Experimenteel werk aan de transplantatie van allogene keratinocyten op kunstmatig gecreëerde littekens van witte ratten

De wens om cellulair potentieel te gebruiken en de noodzaak om nieuwe effectieve methoden te zoeken om de esthetische uitstraling van littekens te verbeteren, leidde tot het idee om de mogelijkheid van keratinocyttransplantatie op littekens te onderzoeken.

Met het oog op de mogelijkheid van het gebruik keratinocytkweek om het uiterlijk van littekens experimenteel werk is gedaan op een witte laboratoriumratten die litteken oppervlakte zijn gemaakt verbeteren bewijzen. Het model van pens van ratten werd verkregen als resultaat van genezing van kunstmatig toegebrachte wonden op de rug, langs de ruggengraat. Ratten werden gesneden stukken van hetzelfde materiaal, afmeting van 2x3 cm. Na 2,5 maanden na operatie "simulatie littekens" ratten werd uitgevoerd dermabrasion chirurgische (verwijdering van de bovenlaag via ignioperation pens) en getransplanteerde allogene keratinocyten geïsoleerd uit de huid van jonge ratten 2-4 dagen na de geboorte.

Isolatie en groei van epidermocyten van de rat werd uitgevoerd in het laboratorium van cellulaire technologieën van het Institute of Cytology RAS van de volgende technologie.

De huid werd gewassen met Hank's zoutoplossing die 200 U / ml gentamicine, in kleine stukjes gesneden, een gebied van 0,2-0,5 cm ². Huidkubussen werden gedurende een uur bij 37 ° C geïncubeerd in een 0,5% oplossing van disaspase in een gebalanceerde zoutoplossing met fosfaat-gebufferde oplossing. De stukjes werden vervolgens overgebracht naar Dulbecco's met fosfaat gebufferde zoutoplossing en de epidermis werd gescheiden van de dermis. De epidermis werd geïncubeerd in een 0,125% trypsine-oplossing gedurende 10-15 minuten onder roeren bij 50 rpm, waarna de werking van het enzym werd gestopt door de toevoeging van 5% foetaal runderserum. Eenderde van de resulterende celsuspensie werd in zuivere vorm voor de opties littekens transplantatie, het tweede derde gekweekt binnenlandse biocompatibele filmbekleding "Polipor", de derde - een petrischaal zonder substraat. De werking van de dermabrasie van de verkregen littekens bij ratten met daaropvolgende transplantatie van rattenepidermocyten daarop werd uitgevoerd onder etheranesthesie met behulp van een hittecalcering.

De eerste groep ratten na dermabrasion op gepolijste, gewassen met zoutoplossing en gedroogd oppervlak steriele pens gesuperponeerde stukken gazon, die werd gedeponeerd scrambled allogene rat epidermotsitov brij met een concentratie van 1,5 miljoen cellen per 1 ml (volgens het Institute of cytologie). Batist stukken gestapeld op gepolijste litteken zodat de cellen op het oppervlak van het litteken. Pleister op de top van verscheidene lagen kaasdoek, dat genaaid aan de randen van het litteken.

Een deel van de resulterende celsuspensie werd uitgeplaat in petrischalen op steriele Polypore-films gesneden in de vorm van bekers, het andere deel op petrischalen zonder een film. De kweek werd uitgevoerd in een FAD-medium bestaande uit een mengsel van DMEM en F12 in een verhouding van 3: 1. Met de toevoeging van 10% foetaal runderserum, 5 μg / ml insuline (Sigma), 0,5 μg / ml hydrocortison hemisuccinaat (Sigma). 10 μg / ml epidermale groeifactor EGF (Institute of Cytology RAS, St. Petersburg). De tweede en derde groepen ratten met 7 individuen werden 6 dagen na de eerste in werking gesteld. Tegen die tijd werden meerlagige lagen gevormd uit de suspensie van gezaaide keratinocyten in petrischalen, die werden getransplanteerd naar ratten. De tweede groep werd getransplanteerd met epidermocyten op de film, de derde groep - met een meerlaagse laag zonder substraat. Na 7 dagen werden de meerlagige lagen van alogische keratinocyten (MPALK), gezaaid op Polypore-films, direct door kweken getransplanteerd op het wondoppervlak. Hierboven werd de film, om het scheuren ervan te voorkomen, gefixeerd met een meerlagig gaasverband en genaaid op de huid van ratten.

Voordat het transplanteren keratinocyten derde groep ratten, gekweekt zonder substraat, waarbij een scheiding van PAC van de bodem van de petrischaal dispase behandeling, met de mogelijkheid om selectief te breken de dermo-epidermale communicatie. Onder invloed van een meerlaags reservoir dispase vernietigt de verbinding van de basale cellaag aan de bodem van de petrischaal en in veel mindere mate, beïnvloedt de intercellulaire communicatie, waardoor het mogelijk "remove" de gehele laag. Losmaken van de meerlaagse celvorming dispase werd als volgt uitgevoerd. Gentamycine (0,2 mg / ml) - van petrischalen gemengd transportmedium werden de cellen platen driemaal met medium met antibiotica, met name gewassen. Meerlaagse lagen werden gegoten 0,125% dispase-oplossing ( «Sigma») en in een incubator geplaatst waar ze bij t gedurende 20-30 minuten geïncubeerd = 37 ° C. Het verschijnen van witte bloemkroon, schil rond de omtrek van het reservoir - een indicator van het begin van het proces van het scheiden van de randen en de bodem van de petrischaal. Enkele minuten na aanvang scheidingsproces werd dispase oplossing 2-3 keer epitheliale lagen werden gewassen met medium geleegd. Op het oppervlak van de epidermale laag werd aangebracht, op maat gesneden beker stuk steriel wondverband "Leith-kleur, die wordt afgesplitst afgescheiden dispase vorming verdere delaminatie van de bodem van de beker met een spatel. Met oogheelkundige pincet laag met de bekleding van het verband" Leith-color "(Russisch ) zich af van de bodem van een petrischaal en voorzichtig op het voorbereide oppervlak van het litteken. Luiers "Lita-color" bevat in zijn samenstelling en gentamicine eksolin (collageen extract), die bij natte omgeving blijft spruit in de toekomst Sem zoutoplossing zwol en werd modern wond coating die goede bescherming tegen externe infectie en snelle genezing biedt als gevolg van beginnende natheid met structuur.

Polyprop films en Lita-kleur servetten waren gelaagd met gaasverbanden die op de huid van ratten werden genaaid voor een meer duurzame fixatie. Elke rat werd in een afzonderlijke kooi geplant om optimale omstandigheden te creëren voor het behoud en de transplantatie van getransplanteerde keratinocyten. Verbanden ratten die schorsing en meerlagige reservoir epidermotsitov schot dispase, meerdere malen getransplanteerd per dag per dag, bevochtigd met steriele zoutoplossing om de meest gunstige voorwaarden van de cellen te creëren voor implantatie. Aangezien de film "Polypor" ondoordringbaar was voor water, bevochtigden de ratten van de tweede groep de verbanden niet, wat een van de voordelen was ten opzichte van transplantaties zonder films. Na 10 dagen werden de verbanden verwijderd. Het klinische beeld van littekens na celtransplantatie verschilde weinig van littekens zonder transplantatie, behalve een meer roze kleuring (als gevolg van dermabrasie) en grotere peeling. Dit feit suggereert dat. Dat onmiddellijk na de val van de wondbedekking met de IPC, geen veranderingen in de pens plaatsvonden.

Biopsiemateriaal nemen bij ratten.

Na 1, 2, 5 en 9 maanden na transplantatie van keratinocyten op ratten allogichnyh grond littekens witte ratten, die een gevormd materiaal voor histologische, cytomorfologische en elektronenmicroscopisch onderzoek. Als controlemonsters werden normale rattenhuid en litteken genomen zonder transplantatie van cellen. Anesthesie bij ratten werd uitgevoerd met etheranesthesie.

Na anesthesie, van de gemarkeerde gebieden, waarin keratinocyten werden getransplanteerd, een biopsie-doorn met een diameter van 2 mm. De stukjes littekenweefsel werden genomen en in een 2,5% glutaaraldehyde-oplossing geplaatst om het materiaal voor elektronenmicroscopie te bereiden. Stukjes weefsel genomen voor histologisch onderzoek werden in 10% neutrale formaline-oplossing doorlussen alcoholen geplaatst, gevolgd door en afgevuld in paraffine, gevolgd door snijden van ultradunne secties en ze te bekijken in het licht-optische microscoop.

Controle I. Normale huid van de rat.

Om het verschil te zien tussen het microscopische beeld van de normale littekenveranderde huid van ratten en littekens op bepaalde tijdstippen na de IPC-transplantatie, worden foto's en beschrijvingen daarvan in alle stadia van deze studie gedemonstreerd.

De epidermis van de normale huid bestaat uit 7-9 lagen cellen. Geil laagje van middelmatige dikte. Op sommige plaatsen bestaat het uit 6-8 lagen geile schubben. De basale laag wordt weergegeven door cellen met een cilindrische vorm met groot licht, reguliere kernen en verschillende nucleoli. Desmosomale verbindingen tussen de cellen en het basale membraan worden duidelijk uitgedrukt. Onder goed gedefinieerde basaalmembraan die fijne uitsteeksels in subepidermale laag liggen evenwijdig aan de zachte bundels van collageen en elastine vezels, zoals langwerpige fibroblasten, kleine vaten heeft. In diepere lagen liggen de bundels collageen- en elastinevezels in verschillende richtingen. Onder hen zijn er veel vaten met dunne wanden van hetzelfde kaliber, cellulaire elementen (fibroblasten, mestcellen, leukocyten). In een groot aantal haarzakjes, talgklieren.

Controle 2. Litteken van een rat van 2 maanden oud.

Klinisch beeld. Littekens lichtroze, met afpellen, op sommige plaatsen blijven de korstjes achter. Hun gebied is afgenomen als gevolg van de samentrekking van de collageenvezels en wordt ongeveer 3,0-3,5 cm ^:. Huidbijlagen zijn afwezig.

Microscopisch beeld. De epidermis bestaat uit 3-5 lagen cellen, gevouwen, voorgesteld door basale cellen van afgeronde vorm, één rij subulaat, 1-2 rijen korrelvormig met keratogialinekorrels in de bovenste laag, er zijn delen van intracellulair oedeem. De hoornlaag is heterogeen veranderd van zeer dun naar verdikt. Er is een vouwing van de pens als gevolg van (samentrekking) van littekenweefsel. De vouwen dringen door tot de papillaire laag en geven de indruk van papillen. De grens tussen de opperhuid en de dermis is een rechte lijn. Het basale membraan kan niet overal worden getraceerd. In het onderste deel van de subepidermale en diepere lagen - vaten met een dikke, loszittende muur, veel verlaten, met stase-verschijnselen. Rond de vaten - een cluster van macrofagen, fibroblasten. Macrofagen omgeven de erythrocyten die uit de haarvaten komen en fagocytiseren ze. In de meer oppervlakkige lagen - kleine haarvaten. Onder de epidermis zitten collageenvezels los. In de diepere laag van de pens - grove bundels collageenvezels waaronder veel fibroblasten.

Littekens van een rat een maand na transplantatie van MPAl ratten-ratten-keratinocyten.

Klinisch beeld. Littekens zijn roze, hun gebied is afgenomen, vooral in diameter en gemiddeld 2,5-3 cm ². Haar en talgklieren zijn afwezig.

Deze microscopisch onderzoek van het materiaal verkregen bij ratten met overdracht MPAlK MPAlK op de film en het substraat zonder wezenlijk identiek. Echter, technisch, werken met MPAlK ondersteunde veel moeilijker en bewerkelijk dan wanneer gegroeid MPAlK op het substraat, zodat de verdere studie van het onderwerp op de transplantatie kertainotsitov littekens we gebruikt als basis voor de teelt ( "substraat") gelaagde gazon.

Microscopisch beeld. Er is een verdikking van de epidermis tot 15-20 lagen, bijna tot het midden waarvan de keratinocyten een smalle, langwerpige, verticale vorm en een compacte opstelling hebben. De basale cellen zijn gerangschikt in een oneven lijn. Hun kernen zijn licht, groot, rond van vorm met één of twee nucleoli, wat op hun hoge synthetische en proliferatieve activiteit duidt. De grens tussen de opperhuid en de dermis is een rechte lijn. De doornige laag is goed ontwikkeld, bestaat uit 3-5 lagen cellen van ronde vorm, er zijn 2 nucleoluscellen.

Direct onder het basale membraan - dicht op elkaar liggende dunne bundels collageenvezels, parallel daaraan een groot aantal lege vaten, zijn diepere collageenvezels grover, verzameld in dichte bundels. Veel grote fibroblasten, mestcellen (2-3 in het gezichtsveld), macrofagen, leukocyten en lege bloedvaten waarvan de wanden zijn losgemaakt, zijn eromheen losjes gelokaliseerde collageenvezels. In sommige vaten - stasis, diapedesis van uniforme elementen. Rond de vaten - fibroblasten, enkele lymfocyten. Huidbijlagen zijn afwezig.

Wanneer een keratinocytsuspensie wordt getransplanteerd naar een gepolijst litteken, verschilt het microscopische beeld van het vorige. Bij de meeste dieren - de opperhuid is dun, bestaat uit 5-6 lagen cellen. De onderste laag bestaat uit cellen met een onregelmatige, veelhoekige vorm met afgeronde onregelmatig gevormde kernen. De conditie van de subepidermale laag is vergelijkbaar met die in de groep dieren zonder een transplantatie.

In dit geval kan men spreken van vertraging van de processen die gepaard gaan met celtransplantatie, of van een groot verlies van cellen getransplanteerd in de vorm van een suspensie. Vandaar dat een conclusie werd getrokken dat de correctie van littekens door keratinocytentransplantatie in de vorm van een suspensie niet geschikt is.

Littekenvorming van de rat 2 maanden na de transplantatie van MPAl ratten-ratten-keratinocyten.

Klinisch beeld. Het litteken ziet er dun en zacht uit. In plaatsen is er een ecdysis, schalen.

Microscopische afbeeldingen. Het stratum corneum is verdikt, op sommige plaatsen - hyperkeratose. De opperhuid is verdikt, het bestaat uit 12-20 rijen cellen. De grens tussen de opperhuid en de dermis is een rechte lijn. Gevoelige collageenvezels onder de epidermis liggen vrij strak. In diepere lagen van de pens worden ze verzameld in grofkorrelige bundels. In de subepidermale laag verschijnt een nieuwe vatenformatie. In de onderste lagen van littekenweefsel - veel lege vaten, parallel aan het oppervlak van de epidermis. Grote fibroblasten worden gelijkmatig verdeeld in de dikte van de pens, er zijn gigantische, veelzijdige, veel macrofagen.

Littekenvorming van de rat 5 maanden na transplantatie van het MP van spermocyten van de rat.

Klinisch beeld. Litteken ziet er glad, glad, zonder schillen, zijn er enkele haar hun grotere dichtheid aan de omtrek van het litteken, waarin de rand ingegroeide haarfollikels in de pens en neoplasma van de haarfollikels aangeeft. Het gebied van de littekens blijft dalen.

Microscopisch beeld. De epidermis is nog steeds dik (15-20 lagen, soms tot 30) in de bovenste lagen is gevuld met keratogialin korrels. Het basale membraan is duidelijk zichtbaar. Onder haar collageen zitten vezels los. In de onderste lagen - collageen is krachtiger en strak verpakt. Onder de collageenbundels bevinden zich veel capillairen. In de bovenste lagen nam het aantal lege bloedvaten af. De epidermis en dermis zijn licht golvend. Er zijn diepe epidermale uitlopers in het littekenweefsel. Onder de collageenvezels bevinden zich zichtbaar nieuw gevormde vaten. Verschijnen enkele haarzakjes en talgklieren.

Littekenvorming van de rat 9 maanden na de transplantatie van IPA ratten-epidermocyten.

Klinisch beeld. Littekens zijn veel kleiner in vergelijking met eerdere perioden, en hun gebied gemiddeld ongeveer 1,5-2,0 cm ². Littekens zijn ongelijk bedekt met dun haar, vooral rond de omtrek. Kleinschalige schaalverkleining blijft behouden.

Microscopisch beeld.

De epidermis werd dunner, weergegeven van 6-8 rijen cellen, die doet denken aan de epidermale structuur van de normale huid van ratten, alleen de dichtheid van cellen met 1 mm. Hoger en ze zijn kleiner. Basale laag bestaat uit kleine cellen met een ronde cilindrische vorm. Het basale membraan is goed gedefinieerd, de hemidesmosomen zijn duidelijk zichtbaar. De aanwezigheid van epidermale uitgroeiingen in de subepidermale laag wordt genoteerd. De papillaire laag wordt uitgedrukt over de gehele lengte van het litteken. Deze feiten tonen aan dat gedurende deze tijdsperiode de hechting van de getransplanteerde keratinocyten veel duurzamer is geworden met de onderliggende weefsels van de pens. Daarom kan de zorg voor littekens van mensen met MALC-transplantatie 9 maanden na IPC-transplantatie traditioneel zijn. Onder de epidermis bevinden zich meer delicate collageenvezels dan in de diepe lagen. Er waren veel schepen, vooral oppervlakkig gelegen. In grotere schepen zijn de wanden verdikt. Haarzakjes en talgklieren in grote hoeveelheden. Het microscopische patroon lijkt op een huidweefsel.

Resultaten van experimenteel werk en hun discussie.

Tijdens deze werkzaamheden kunsthuid littekens van ratten na operatie dermabrasion, getransplanteerd keratinocyten in verschillende formah- op wondoppervlakken, als suspensie in batisten en gelaagde formatie zonder substraat. Het werk werd gedaan om morfologische gegevens te verkrijgen over het effect van getransplanteerde allogene keratinocyten op littekens, evenals het bepalen van de optimale transplantatievarianten.

Er werd vastgesteld dat alle drie de methoden van transplantatie reëel zijn, maar transplantatie van IPAA zonder substraat is een zeer arbeidsintensieve procedure, waarbij IPAC kan worden verwond, wat de resultaten van transplantatie beïnvloedt. Bovendien sluit deze methode van transplantatie werk op grote oppervlakken uit.

Transplantatie van de keratinocytsuspensie is een veel economischere methode, vereist geen lange celkweek en is eenvoudig in onze voorgestelde versie met behulp van steriele kamferachtige knuppels waarvan de afmetingen overeenkomen met de grootte van de littekens. De vertraging van het therapeutische effect tijdens de transplantatie van de celsuspensie gedurende ongeveer een maand in vergelijking met de MIC op de wondbekleding is geen significant moment met de duur van de behandeling, berekend in vele maanden. Het is bekend dat tijdens de transplantatie van IPC om patiënten te verbranden de transformatie van de toestand van de huidstructuur geleidelijk en gedurende meerdere jaren plaatsvond. Transplantatie van de keratinocytkweek op wondbedekkingen is de meest geschikte en veelbelovende methode, maar het is ook veel duurder. Bovendien vereist vandaag de zoektocht naar meer geavanceerde coatings die plastic, hygroscopisch, bacteriostatisch of bacteriedodend moeten zijn en die biologisch neutraal zijn voor cellen. De film "Polipor" - een tussentijdse versie van de binnenlandse film wond dekking, ondanks enkele tekortkomingen, heeft ons in staat gesteld om experimenteel keratinocyten transplantatie ratten op littekens te bestuderen en om conclusies te trekken over de effectiviteit van deze richting attractie littekens.

De auteurs die de IPC-transplantatie op verbrande wonden uitvoerden, merkten op dat tijdens de eerste week na transplantatie van de gelaagde keratinocytlaag op de gereinigde wonden, de opperhuid verdikt en gelaagd was. Alle lagen van de opperhuid waren goed gedefinieerd. Het is interessant dat het aantal cellagen in transplantaties 10-30% groter is dan in huidbiopsiespecimens. De auteurs noteerden het verschijnen van korrels van keratogialine op de 5e dag na de transplantatie van MPA, het basale membraan en de hemidesmosomen - al op de derde dag.

J.Rives et al. (L994), Paramonov BA (1996); NM Kuznetsov et al. (1998) vonden dat gedurende de eerste periode na de transplantatie BMD patiënten met polnosloynymi schil na brandwonden, communicatie tussen de dermis en de epidermis is zeer zwak en is een rechte lijn, papillaag ontbreekt. Tegen het einde van de tweede maand begint de vorming van ondiepe papillen en aanhangsels van de huid, de verbinding tussen de dermis en de epidermis wordt duurzamer. De literatuurgegevens spreken van de transplantatie van allogene keratinocyten op de wonden van verbrande patiënten, als een veelbelovende methode. Hoewel de afstoting van allogene keratinocyten door verschillende auteurs optreedt ingediend in de periode van 10 dagen tot 3 maanden, maar zij een rol spelen bij de genezing van het wondoppervlak, het vrijgeven groeifactoren en mechanisch sluiten van het defect. Aangenomen wordt dat MPALK een verminderde antigene activiteit heeft, omdat tijdens de kweek in vitro de Langerhans-cellen verliezen, waardoor ze lange tijd in het ontvangende organisme kunnen bestaan. Bovendien heeft de allogene cultuur die wordt verkregen uit de huid van jonge gezonde mensen een onvergelijkbaar groter biologisch potentieel dan de autologe cultuur van patiënten na een trauma.

Het belangrijkste doel van onze studie was om uit te zoeken of allogene keratinocyten zullen overleven op de littekens en wat de veranderingen in het littekenweefsel zullen zijn onder invloed van een dergelijke biologisch actieve "wondbedekking". In het geval van een positief resultaat, werk de meest effectieve en minst arbeidsintensieve technologie uit op dit gebied van revalidatiegeneeskunde.

De door ons in veel opzichten verkregen gegevens bleken vergelijkbaar te zijn met de literatuurgegevens over de morfologische veranderingen die in de menselijke epidermis optreden na de overdracht van allogene keratinocyten naar brandwonden. Maar er zijn significante verschillen, zowel in termen van het morfologische substraat, dat is getransplanteerd, als in termen van technologie. So. Het proces van vorming van de basale membraan en dermo-epidermale verbindingen (hemidesmosomes, papillae) vindt op een later tijdstip plaats dan bij de keratinocyttransplantatie naar de wondoppervlakken zonder littekenveranderingen. Dit lijkt te wijten te zijn aan slechte voeding van de pensweefsels in vergelijking met de dermis of spierbundel. Het litteken, vooral het oude, is een dicht bindweefsel met een zeer klein aantal vaten, de bodem van de brandwond is een granulatieweefsel dat rijk is aan bloedvaten. Het is dus duidelijk dat de omstandigheden waaronder transplantatie en engraftment van keratinocyten optreden totaal verschillend zijn. Hoe gevasculariseerd het gebied van transplantatie van cellen, hoe gemakkelijker het is om ze te verwerken. Uit dit postulaat komt een conclusie naar voren over de voorkeur voor het werken met jonge littekens, waarbij het bindweefsel nog los zit en rijk is aan bloedvaten.

Als resultaat van dit experimentele werk is bewezen dat:

1. Een transplantatie van MALK naar littekens is mogelijk. 
2. De optimale methode van transplantatie is de transplantatie van keratinocyten op de wondbedekking.
3. Het oppervlak van het litteken moet worden gemalen met een operatieve dermabrasie met Schumann's laser of een snijder.
4. Onder invloed van MPALK vindt snelle epithelisatie van het bodemoppervlak van de pens plaats.
5. Hoe beter gevasculariseerd littekenweefsel, dat wil zeggen hoe jonger het litteken, hoe beter de resultaten van keratinocyttransplantatie.
6. Het littekenweefsel onder invloed van getransplanteerde keratinocyten wordt geleidelijk getransformeerd en verandert in een huidachtig (meer bros littekenweefsel met aanhangsels van de huid).
7. Geleidelijk losraken van littekenweefsel begint met de subepidermale laag. Verbetert zijn vascularisatie, bundels van collageenvezels in de bovenste en onderste delen van de pens nemen een meer brokkelige locatie aan dan in het littekenweefsel zonder transplantatie van cellen. Er zijn haarzakjes en talgklieren. Epidermis in zijn structuur, na het passeren van de fase van hypertrofie, nadert de epidermis van de normale huid.
8. De waargenomen veranderingen zijn geassocieerd met van keratinocyten afgeleide groeifactoren, cytokinen, die het trofisme van het littekenweefsel verbeteren en de transformatie van grof vezelig weefsel naar een meer losse weefsel vergemakkelijken, wat leidt tot een verbetering van het littekentype.

Op basis van deze studie kan dus worden geconcludeerd dat het gunstige effect van getransplanteerde keratinocyten op littekenweefsel van praktisch belang kan zijn voor de revalidatie van patiënten met verschillende soorten littekens.

Met dit werk aan ratten konden ook eisen worden geformuleerd. Naar de wondbedekkingen, waarop keratinocyten worden gekweekt.

Wondbedekkingen moeten zijn:

• biocompatibel met cellen,
• ademend,
• hebben een elastische, vormgevende basis,
• wees hydrofiel,
• aangezien medicinale additieven antibacteriële geneesmiddelen bevatten en antioxidanten niet toxisch zijn voor gekweekte cellen.

Klinische resultaten van biotechnologische behandeling van littekens.

Eerder, N. Carver et al. (1993) vonden dat occlusieve verbanden het best zijn voor het hechten aan de wond en overleving van keratinocyten, maar staan niet de vorming van een gelaagde (rijpe) epidermis toe. Voor het vormen van een gelaagde opperhuid is een luchtomgeving noodzakelijk. Daarom werd na het bevestigen van de meerlagige laag na 7-10 een occlusieve wondbedekking voorgesteld om wonden te verwijderen en te geleiden onder droge verbanden of in water oplosbare zalven. We kunnen zeggen dat de kwaliteit en eigenschappen van het "substraat" waarop de cellen worden gekweekt erg belangrijk zijn voor de effectiviteit van transplantatie van het cellulaire materiaal en bijgevolg voor de resultaten van het werk van de artsen. Maar er is vandaag geen ideale wondbedekking, ondanks de overvloed aan voorgestelde opties (kunstleder, non-woven materiaal van carboxymethylcellulose, fibrinebekleding, semi-permeabele polyurethaanfolie). Niet onbelangrijk moment in deze kwestie zijn de kosten van "substraten" (speciale wondcoatings), omdat hun hoge kosten de totale kosten van een biotechnologische behandeling verhogen.

De effectiviteit van cellulaire technologieën is tot nu toe bewezen, maar helaas zijn deze technologieën erg duur, vooral in landen waar de industriële productie van cellulaire composities niet is vastgesteld. Niettemin hebben landen zoals de Verenigde Staten al lang een industrie opgericht voor de productie van cellulair materiaal voor transplantatie van verbranding. In het bijzonder, het bedrijf Bio-Technology Inc, sinds 1989 verhoogd 37.000 gelamineerde lagen van keratinocyten, die voor de behandeling van 240 patiënten hebben gebruikt in 79 landen over de hele wereld (R.Odessey, 1992) met 1 cm ² celkweek kost ongeveer 7-8 $ US.

De technologie van het behandelen van verschillende ziekten en huidproblemen heeft een aantal verschillen, maar de kern van elke behandeling met cellen is de productie van celmateriaal van hoge kwaliteit en de transplantatie ervan.

Dit proces bestaat uit de volgende stappen:

• selectie van de huid van de getroffene (of van donoren),
• transport van huidflappen naar het biotechnologiecentrum,
• de isolatie van cellen van de basale laag en hun vermenigvuldiging,
• opbouw van meerlagige lagen van keratinocyten (IPC).
• transplantatie van celculturen.

Het belangrijkste probleem bij de behandeling met de transplantatie van meerlaagse keratinocytlagen is de behoefte aan levensvatbare cellen in alle stadia van celtransplantatie. Huidstukken voor het isoleren van autologe of allogene cellen moeten zo dun mogelijk zijn, omdat het in dit geval gemakkelijker is om ze te scheiden met behulp van mechanische en enzymatische methoden en om een suspensie van levende cellen voor groei te verkrijgen. Ze kunnen worden verkregen door het dermatoom af te snijden of door de huid van de oogleden, de voorhuid, het binnenoppervlak van de schouder te gebruiken. Gegeven dat de cellen gevoelig zijn voor halogenen (chloor, jodium), waterstofperoxide, kunnen ze niet worden gebruikt bij de behandeling van de huid op het moment dat het materiaal wordt ingenomen.

De kwantitatieve en kwalitatieve opbrengst van cellen van huidtransplantaten en de effectiviteit van hun cultivatie hangen ook af van de gezondheidstoestand en de leeftijd van de donor. Bovendien moeten huidbiopsiespecimens zo snel mogelijk en in geschikte omstandigheden (milieu, temperatuur) aan het laboratorium worden afgeleverd bij een gecertificeerd en geaccrediteerd laboratorium.

Eagle's medium of medium 199 met de toevoeging van 10% runderserum, DMEM-medium aangevuld met 5% foetaal runderserum en antibiotica kan worden gebruikt voor het opslaan en transporteren van huidflappen.

In het cytologische laboratorium wordt de huidbiopsie eerst mechanisch in kleine stukjes verdeeld, vervolgens wordt de verwerking van huidfragmenten uitgevoerd met behulp van enzymen: trypsine, collagenase, dyspase, enz.

Onder de werking van enzymen vindt vernietiging door desmosomes plaats en keratinocyten worden in het medium afgegeven als afzonderlijke cellen of aggregaten die uit verschillende aantallen cellen bestaan. Voor kweken worden alleen basale keratinocyten gebruikt die op speciale media worden gekweekt in incubators die 5% CO bevatten, in petrischalen of in flesjes op t = 37 ° C. Binnen 48 uur wordt de vorming van keratinocytkolonies waargenomen, die geleidelijk convergeren naar een monolaag. Na het verkrijgen van een voldoende aantal cellen wordt de resulterende suspensie uitgespreid op de wondbedekking die voor dit doel is bereid en in Petrischalen wordt geplaatst. Uit de suspensie wordt eerst een monolaag en vervolgens een meerlagige laag keratinocyten gevormd. Schematisch worden de stadia van het keratinocytkweekproces getoond in Fig. 12 (33.43.54.65).

De vorming van een meerlagige keratinocytenformatie die geschikt is voor transplantatie duurt gewoonlijk 7-10 dagen. Soms is deze periode langer, wat afhankelijk is van de kwaliteit van het bronmateriaal (leeftijd, gezondheid van de donor, de juistheid van het materiaal, de kwaliteit van de gebruikte media, enz.). Als de meerlaagse laag te groot wordt, kunnen er op het oppervlak cellen zijn met apoptose verschijnselen die ongeschikt zijn voor transplantatie. Petrischalen, met daarop gekweekt op wondbedekkingen door meerlaagse lagen van keratinocyten (IPC), worden in speciale containers aan de kliniek afgeleverd bij een temperatuur van niet lager dan + 15 ° C.

De gemodificeerde Green-methode voor het verbouwen van de IPC

In ons werk als wondbedekking gebruikten we een meerlagige cambric, waarbij we de polypore-films achterlieten waarmee we in een experiment met ratten begonnen te werken. Meerlaagse keratinocytenlagen werden dus door ons op prefab en steriele batist gegroeid, hoewel het ook niet de optimale wondbedekking is.

Klinische studies werden uitgevoerd op vrijwilligers met inachtneming van de noodzakelijke ethische normen: ondertekening van een verdrag en geïnformeerde toestemming.

1. De kweek van eigen (autoloog) en genomen uit de cellen van de cellen (allogene) keratinocyten werd toegepast.
2. Eigen keratinocyten werden verkregen uit een stukje huid gesneden uit de binnenkant van de schouder van de patiënten.
3. De werking van dermabrasie van littekens werd uitgevoerd met behulp van thermocoupling, roterende schijven en erbium laser.
4. Groepen patiënten met normotrofe, hypotrofe en hypertrofische littekens werden genomen.

Het technologische proces voor de toepassing van cellulaire technologie om het type huidlittekens te verbeteren bestond uit de volgende stadia:

1. Selectie van patiënten.
2. Verklaar de essentie van de behandeling, de timing van het verkrijgen van de verwachte resultaten, de ondertekening van een verdrag en geïnformeerde toestemming.
3. Benoeming van patiënten gedurende 2-3 weken vóór de operatie selmevit door 1t. 3 keer per dag, zinkteral op 1t. 3 keer per dag.
4. Een stuk huid van 2,0 cm lang en 0,7-1,0 cm breed van het binnenoppervlak van de schouder nemen, hoog, bijna aan de onderkant van het okselgebied, om autologe keratinocyten te verkrijgen.
5. In het geval dat patiënten weigeren hun eigen keratinocyten te isoleren vanwege de mogelijkheid om een lineair litteken op het binnenoppervlak van de schouder te verkrijgen, werd het cellulaire materiaal uit een celbank genomen (allogene keratinocyten).
6. Keratinocyten werden geïsoleerd en gekweekt onder omstandigheden van een laboratorium dat gecertificeerd was voor dit type werk.
7. Na ontvangst van een IPC die voldoende was voor transplantatie, werd een dag chirurgie toegediend aan de littekens in de kliniek, waar het materiaal in speciale containers in petrischalen werd gebracht.
8. De werking van dermabrasie van de pens, hemostase werd uitgevoerd, het grondoppervlak werd gewassen met steriele zoutoplossing, gedroogd, waarna IPC werd getransplanteerd op steriele batiste "cellen naar beneden". Dat wil zeggen, de cellen die boven in de MIC waren, waren lager, grenzend aan het gepolijste oppervlak.
9. Bovenaan was een steriele film gelegd die met een elastisch verband of elastische omnifix-pleister op de huid was bevestigd. In plaats van de film kunnen ook indifferente wondbekledingen die siliconen bevatten, bijvoorbeeld Mepitel, Mepiform, siliconengelplaten, worden gebruikt.

Na 5-7 dagen wordt de film of siliconencoating verwijderd. Tegen die tijd moeten alle keratinocyten op het gepolijste litteken kruipen en zich aan het oppervlak hechten.

10. De natte omgeving gecreëerd onder de film- en siliconencoating draagt daar actief aan bij. De doper die op dit punt op het litteken achterblijft kan worden geïmpregneerd met curiose of chitosangel. Dientengevolge wordt op de 2e dag een dichte korst gecreëerd, die voor het gemak van de patiënt beter te fixeren is met een elastisch, luchtdoorlatend pleister, bijvoorbeeld Omnifix. De ademende korst laat de nieuw gevormde epidermis differentiëren en in een volwassen vorm veranderen.

Afhankelijk van het type litteken en de diepte van het slijpen, wordt het verband na 8-10 dagen geweigerd. De epidermis heeft op dit moment 30-40% meer cellulaire lagen dan in de normale huid. Het basale membraan is niet gevormd. Keratinocyten van de verdikte epidermis geven een massa biologisch actieve moleculen af in het littekenweefsel.

Het succes van de biotechnologische behandeling van littekens hangt grotendeels af van de manier waarop ze worden behandeld in de postoperatieve periode. Celkweken zijn een "zacht" soort wondbedekking en in de vroege perioden na transplantatie kan de BMD gemakkelijk worden losgemaakt van de onderliggende weefsels. Daarom wordt patiënten geadviseerd om na de operatie voor het litteken te zorgen. Gedurende 8-9 maanden, niet wrijven en gemakkelijk werken met koud gekookt water om te voorkomen dat een dunne, nieuw gecreëerde opperhuid wordt afgescheurd die geen stevige grip heeft op de onderliggende weefsels.

Let op.

Voor de operatie en tijdens dermabrasie gebruik van gehalogeneerde oxidanten en conserveringsmiddelen (yodopiron, sulyodopiron, iodinol, yodinat, chloorhexidine, waterstofperoxide) is toegestaan voordat transplanteren kletok- absoluut gecontraïndiceerd vanwege hun cytotoxische effecten. Giftig voor cellen zijn ook goed methyleenblauw. Briljant groen.

Om infectie te voorkomen, met name bij het werken met hypertrofische littekens, is het mogelijk om het operatiegebied te behandelen met neomycinesulfaat, polymyxine of gentamicine. Ze oefenen geen cytotoxisch effect uit op keratinocyten.

Als gevolg van deze behandeling wordt een drievoudig effect bereikt.

1. Afstemming van het oppervlak van de pens.
2. Maak een laag erboven van een nieuwe opperhuid, normale dikte.
3. De transformatie van littekenweefsel in dermoïde-achtige door de werking van cytokines, groeifactoren en andere biologisch actieve moleculen, uitgescheiden door getransplanteerde cellen en gestimuleerd door deze keratinocyten, fibroblasten en macrofagen.

Het litteken wordt minder opvallend, meer elastisch, er verschijnen poriën in, bladerdeeg, pigmentatie kan worden hersteld door de aanwezigheid van melanocyten in de MPC.

Al deze positieve momenten in de cicatrix komen echter niet meteen. In dit opzicht is het noodzakelijk patiënten te waarschuwen. Dat het proces van transformatie van littekenweefsel in de dermis langzaam is en het optimale resultaat van een dergelijke behandeling niet eerder dan 10-14 maanden kan worden verwacht. Direct nadat het verband is afgewezen, hebben de gepolijste oppervlakken een uitgesproken polychroom, des te helderder het maalproces. De minste schade aan de huid treedt op bij het slijpen van de normotrofische littekens met een erbiumlaser. De kleur van de littekens en de omliggende huid werd hersteld in de periode van 3 tot 8 weken. Ondanks dergelijke voorzorgsmaatregelen is er soms postoperatieve hyperpigmentatie, die gedurende enkele maanden zelfstandig kan doorgaan.

[1], [2], [3], [4], [5], [6], [7], [8], [9], [10], [11]