Experimenteel onderzoek naar transplantatie van allogene keratinocyten op kunstmatig gecreëerde littekens van witte ratten

De wens om het cellulaire potentieel te benutten en de noodzaak om nieuwe effectieve methoden te vinden om het esthetische uiterlijk van littekens te verbeteren, leidde tot het idee om de mogelijkheid te onderzoeken om keratinocyten te transplanteren naar het oppervlak van littekens.

Om de waarschijnlijkheid van het gebruik van keratinocytenkweek ter verbetering van het uiterlijk van littekens aan te tonen, werd een experimentele studie uitgevoerd op witte laboratoriumratten, waarbij littekenoppervlakken werden gecreëerd. Het rattenlittekenmodel werd verkregen door het genezen van kunstmatig toegebrachte wonden op de rug, langs de wervelkolom. Bij de ratten werden identieke stukjes huid van 2x3 cm uitgesneden. 2,5 maand na de "littekenmodellering" ondergingen de ratten dermabrasie (verwijdering van de bovenste lagen van het litteken met behulp van thermocaustische middelen) en werden allogene keratinocyten getransplanteerd, die 2-4 dagen na de geboorte uit de huid van rattenjongen waren geïsoleerd.

De isolatie en kweek van ratten-epidermale cellen werd uitgevoerd in het laboratorium voor celtechnologieën van het Instituut voor Cytologie van de Russische Academie van Wetenschappen met behulp van de volgende technologie.

De huid werd gewassen in Hank's zoutoplossing met 200 U/ml gentamicine en in kleine stukjes gesneden, elk met een oppervlakte van 0,2-0,5 cm² ^. De huidstukjes werden gedurende 1 uur bij 37 °C geïncubeerd in een 0,5% dispase-oplossing in een gebalanceerde zoutfosfaat-gebufferde oplossing. De stukjes werden vervolgens overgebracht naar Dulbecco's fosfaat-gebufferde zoutoplossing en de epidermis werd van de dermis gescheiden. De epidermis werd gedurende 10-15 minuten onder roeren bij 50 rpm geïncubeerd in een 0,125% trypsine-oplossing, waarna de enzymwerking werd gestopt door toevoeging van 5% foetaal runderserum. Een derde van de resulterende celsuspensie werd in zuivere vorm gebruikt voor een van de opties voor transplantatie op littekens, het tweede derde deel werd gekweekt op biocompatibele, huishoudelijke filmcoatings "Polypor" en het derde deel op petrischalen zonder substraat. De dermabrasie-operatie op de ontstane littekens bij ratten, gevolgd door transplantatie van ratten-epidermale cellen op de littekens, werd uitgevoerd onder etheranesthesie met behulp van thermische cauterisatie.

Bij de eerste groep ratten werden na dermabrasie steriele stukjes cambric op het gepolijste, met fysiologische oplossing gewassen en gedroogde oppervlak van het litteken geplaatst. Daarop werd een geschudde suspensie van allogene rattenepidermocyten aangebracht in een concentratie van 1,5 miljoen cellen per 1 ml (volgens het Institute of Cytology). De stukjes cambric werden op het gepolijste litteken geplaatst, zodat de cellen op het littekenoppervlak lagen. Daaroverheen werd een verband van meerdere lagen gaas gelegd, dat aan de randen van het litteken werd vastgenaaid.

Een deel van de verkregen celsuspensie werd geënt in petrischalen op steriele Polypore-films die in de vorm van de schalen waren gesneden, het andere deel op petrischalen zonder film. De kweek werd uitgevoerd in FAD-medium, bestaande uit een mengsel van DMEM en F12-medium in een verhouding van 3:1, met toevoeging van 10% foetaal runderserum, 5 μg/ml insuline (Sigma), 0,5 μg/ml hydrocortisonhemisuccinaat (Sigma) en 10 μg/ml epidermale groeifactor (EGF) (Instituut voor Cytologie RAS, St. Petersburg). De tweede en derde groep ratten, elk bestaande uit 7 individuen, werden 6 dagen na de eerste geopereerd. Tegen die tijd waren er meerlagige lagen gevormd uit de suspensie van geënt keratinocyten in de petrischalen, die in de ratten werden getransplanteerd. De tweede groep werd getransplanteerd met epidermocyten op een film, de derde met een meerlagige laag zonder substraat. Na 7 dagen werden de verkregen meerlagige lagen allogene keratinocyten (MPALK), gezaaid op de "Polypore"-films, als kweek direct op het wondoppervlak getransplanteerd. Om scheuren te voorkomen, werd de film bovenop gefixeerd met een meerlagig gaasverband en vastgenaaid aan de huid van de ratten.

Voordat de keratinocyten werden getransplanteerd naar de derde groep ratten die zonder substraat waren gekweekt, werd de PAC van de bodem van de petrischaal gescheiden door deze te behandelen met dispase. Dit middel kan de dermale-epidermale verbindingen selectief verbreken. Wanneer dispase inwerkt op een meerlagige laag, verbreekt het de verbinding van de cellen van de basale laag met de bodem van de petrischaal en heeft het een veel geringer effect op de intercellulaire verbindingen, waardoor de laag volledig kan worden "verwijderd". Het losmaken van de meerlagige cellaag met dispase werd als volgt uitgevoerd. Het transportmedium werd uit de petrischalen verwijderd en de cellagen werden driemaal gewassen met een voedingsmedium met antibiotica, met name gentamicine (0,2 mg/ml). De meerlagige lagen werden gevuld met een 0,125% dispase-oplossing ("Sigma") en in een thermostaat geplaatst, waar ze gedurende 20-30 minuten werden geïncubeerd bij t=37 °C. Het verschijnen van een witte rand die langs de rand van de laag loslaat, is een indicatie dat de scheiding van de randen en de bodem van de petrischaal is begonnen. Enkele minuten na het begin van het scheidingsproces werd de dispase-oplossing afgetapt en werden de epitheellagen 2-3 keer met het medium gewassen. Een stukje steriel wondverband "Lita-color", geknipt op maat van de cup, werd op het oppervlak van de epidermislaag aangebracht. De door dispase gescheiden laag, die bovendien met een spatel van de bodem van de cup was losgetrokken, werd met een oogpincet van de bodem van de petrischaal afgescheurd en voorzichtig overgebracht naar het geprepareerde oppervlak van het litteken. De servetten "Lita-color" bevatten gentamicine en exoline (collageenextract) die, wanneer ze worden bevochtigd met de resten van het groeimedium en vervolgens met een fysiologische oplossing, opzwellen en een modern wondverband vormen, dat een goede bescherming biedt tegen infecties van buitenaf en zorgt voor een snelle genezing dankzij de vochtabsorberende structuur.

Meerlagige gaasverbanden werden aangebracht op de Polypore-films en Lita-color-servetten en aan de huid van de ratten genaaid voor een sterkere fixatie. Elke rat werd in een aparte kooi geplaatst om optimale omstandigheden te creëren voor het onderhoud en de inplanting van de getransplanteerde keratinocyten. De verbanden van de ratten waarnaar de suspensie en de meerlagige laag epidermocyten, verwijderd door middel van dispase, werden getransplanteerd, werden meerdere keren per dag bevochtigd met steriele zoutoplossing om de meest gunstige omstandigheden te creëren voor inplanting van de cellen. Aangezien de Polypore-film waterafstotend was, werden de verbanden van de ratten in de tweede groep niet bevochtigd, wat een van de voordelen was ten opzichte van transplantaties zonder films. De verbanden werden na 10 dagen verwijderd. Het klinische beeld van littekens na celtransplantatie verschilde weinig van littekens zonder transplantatie, behalve hun rozere kleur (als gevolg van dermabrasie) en de grotere mate van afschilfering. Dit feit suggereert dat... dat er direct nadat de wondverbanden met de MPC waren losgelaten, geen veranderingen in het litteken optraden.

Het nemen van een biopsiemateriaal van ratten.

1, 2, 5 en 9 maanden na de transplantatie van allogene rattenkeratinocyten op gepolijste littekens van witte ratten, werd materiaal afgenomen voor histologisch, cytomorfologisch en elektronenmicroscopisch onderzoek. Monsters van normale rattenhuid en littekenweefsel zonder celtransplantatie werden als controle afgenomen. De ratten werden onder etheranesthesie gebracht.

Na anesthesie werden stukjes littekenweefsel afgenomen van de gemarkeerde plekken waar keratinocyten waren getransplanteerd met behulp van een biopsiepons met een diameter van 2 mm. Deze stukjes werden in een 2,5% glutaraldehyde-oplossing geplaatst ter voorbereiding op elektronenmicroscopisch onderzoek. De voor histologisch onderzoek afgenomen stukjes weefsel werden in een 10% neutrale formaline-oplossing geplaatst, vervolgens door alcoholen gepasseerd en ingebed in paraffine. Vervolgens werden er ultradunne coupes van gesneden en bekeken onder een lichtmicroscoop.

Controle I. Normale rattenhuid.

Om het verschil te kunnen zien tussen de microscopische foto's van de normale, door littekens aangetaste rattenhuid en de littekens op bepaalde momenten na de transplantatie van MPC, worden in alle stadia van dit onderzoek foto's en beschrijvingen van de littekens getoond.

De opperhuid van een normale huid bestaat uit 7-9 cellagen. De hoornlaag is matig dik. Op sommige plaatsen bestaat deze uit 6-8 lagen hoornachtige schubben. De basale laag wordt vertegenwoordigd door cilindrische cellen met grote, lichte, regelmatig gevormde kernen en verschillende nucleoli. Desmosomale verbindingen tussen cellen en met het basale membraan zijn duidelijk zichtbaar. Onder het goed gedefinieerde basale membraan, dat kleine uitgroeisels heeft in de subepidermale laag, parallel daaraan liggen delicate bundels collageen- en elastinevezels, waaronder langwerpige fibroblasten, kleine bloedvaten. In diepere lagen liggen bundels collageen- en elastinevezels in verschillende richtingen. Daaronder bevinden zich vele bloedvaten met dunne wanden van hetzelfde kaliber, cellulaire elementen (fibroblasten, mestcellen, leukocyten). Een groot aantal haarzakjes en talgklieren.

Controle 2. Rattenlitteken, 2 maanden oud.

Klinisch beeld. De littekens zijn lichtroze, vervellen, er blijven korstjes achter. Hun oppervlakte is afgenomen door samentrekking van collageenvezels en is nu ongeveer 3,0-3,5 cm groot ^. Huidaanhangsels ontbreken.

Microscopisch beeld. De epidermis bestaat uit 3-5 lagen cellen, geplooid, weergegeven door afgeronde basale cellen, één rij subulate cellen, 1-2 rijen korrels met keratohyalinekorrels in de bovenste laag, er zijn gebieden met intracellulair oedeem. De stratum corneum is ongelijkmatig veranderd van zeer dun naar verdikt. Littekenplooiing wordt opgemerkt als gevolg van (contractie) van littekenweefsel. De plooien dringen door tot in de papillaire laag en wekken de indruk van papillen. De grens tussen de epidermis en de dermis is een rechte lijn. Het basaalmembraan is niet overal te zien. In het onderste deel van de subepidermale en diepere lagen bevinden zich vaten met een dikke, losse wand, vele zijn verlaten, met stase. Rond de vaten bevindt zich een ophoping van macrofagen, fibroblasten. Macrofagen omringen de erytrocyten die uit de haarvaten vrijkomen en fagocyteren deze. In de meer oppervlakkige lagen bevinden zich kleine haarvaten. Onder de epidermis liggen losjes collageenvezels. In de diepere laag van het litteken bevinden zich grove bundels collageenvezels, waaronder veel fibroblasten.

Rattenlitteken één maand na transplantatie van rattenkeratinocyten.

Klinisch beeld. De littekens zijn roze, hun oppervlakte is afgenomen, vooral in diameter, en bedraagt gemiddeld 2,5-3 cm² ^. Haar en talgklieren zijn afwezig.

De gegevens van microscopisch onderzoek van het materiaal verkregen van ratten met transplantatie van MPaLK op film en MPaLK zonder substraat zijn vrijwel identiek. Puur technisch gezien is het werken met MPaLK zonder substraat echter veel ingewikkelder en arbeidsintensiever dan het kweken van MPaLK op een substraat. Daarom hebben we bij verdere bestudering van de transplantatie van keratinocyten naar littekens meerlagig cambric gebruikt als kweekbasis ("substraten").

Microscopisch beeld. Er is een verdikking van de epidermis tot 15-20 lagen zichtbaar, bijna tot het midden waarvan de keratinocyten een smalle, langwerpige, verticale vorm en compacte rangschikking hebben. De basale cellen bevinden zich in een onregelmatige lijn. Hun kernen zijn licht, groot, rond met één of twee nucleoli, wat wijst op hun hoge synthetische en proliferatieve activiteit. De grens tussen de epidermis en de dermis is een rechte lijn. De stekellaag is goed ontwikkeld en bestaat uit 3-5 lagen ronde cellen, waarvan er 2 nucleolaire cellen zijn.

Direct onder het basaalmembraan bevinden zich dicht op elkaar gelegen dunne bundels collageenvezels, parallel daaraan een groot aantal verlaten vaten. De dieper gelegen collageenvezels zijn grover en verzameld in dichte bundels. Er bevinden zich veel grote fibroblasten, mestcellen (2-3 in het gezichtsveld), macrofagen, leukocyten en verlaten vaten, waarvan de wanden losjes zijn, daaromheen bevinden zich losjes gelegen collageenvezels. In sommige vaten is er stase, diapedese van gevormde elementen. Rond de vaten bevinden zich fibroblasten en enkele lymfocyten. Huidaanhangsels ontbreken.

Bij het transplanteren van een keratinocytensuspensie op een gepolijst litteken wijkt het microscopische beeld af van het vorige. Bij de meeste dieren is de epidermis dun en bestaat uit 5-6 cellagen. De onderste laag bestaat uit cellen met een onregelmatige, veelhoekige vorm met kernen van ronde tot onregelmatige vorm. De toestand van de subepidermale laag is vergelijkbaar met die bij de groep dieren zonder MPALK-transplantatie.

In dit geval kunnen we spreken van een vertraging in de processen die gepaard gaan met celtransplantatie, of van een groot verlies aan cellen die in suspensievorm zijn getransplanteerd. Daarom werd geconcludeerd dat littekencorrectie door keratinocyten in suspensievorm te transplanteren, niet zinvol is.

Rattenlitteken 2 maanden na transplantatie van rattenkeratinocyten.

Klinisch beeld. Het litteken ziet er dun en delicaat uit. Plaatselijk zijn er vervellings- en schilferplekken te zien.

Microscopisch beeld. De stratum corneum is verdikt, op sommige plaatsen - hyperkeratose. De epidermis is verdikt en bestaat uit 12-20 rijen cellen. De grens tussen de epidermis en de dermis is een rechte lijn. Delicate collageenvezels onder de epidermis liggen vrij dicht op elkaar. In de diepere lagen van het litteken zijn ze verzameld in grote, grove bundels. In de subepidermale laag ontstaat nieuwe vaatvorming. In de onderste lagen van het littekenweefsel bevinden zich veel verlaten bloedvaten, parallel aan het oppervlak van de epidermis. Grote fibroblasten zijn gelijkmatig verdeeld over de dikte van het litteken; er zijn gigantische, meervoudig vertakte macrofagen.

Rattenlitteken 5 maanden na transplantatie van rattenepidermale cellen.

Klinisch beeld. Het litteken ziet er egaal en glad uit zonder te vervellen. Er zijn losse haartjes, de dichtheid ervan is groter aan de rand van het litteken, wat wijst op marginale ingroei van haarzakjes in het litteken en de vorming van nieuwe haarzakjes. De littekenoppervlakte neemt verder af.

Microscopisch beeld. De opperhuid is nog steeds dik (15-20 lagen, op sommige plaatsen zelfs 30). In de bovenste lagen is deze gevuld met keratohyalinekorrels. Het basaalmembraan is duidelijk zichtbaar. Daaronder liggen collageenvezels losjes. In de onderste lagen is het collageen krachtiger en dichter opeengepakt. Er bevinden zich veel haarvaten tussen de collageenbundels. In de bovenste lagen is het aantal verlaten vaten afgenomen. De verbinding tussen opperhuid en lederhuid is licht golvend. Op sommige plaatsen zijn diepe uitgroeisels in de opperhuid in littekenweefsel zichtbaar. Nieuw gevormde vaten zijn zichtbaar tussen de collageenvezels. Er zijn afzonderlijke haarzakjes en talgklieren zichtbaar.

Litteken bij een rat 9 maanden na transplantatie van epidermale MPA-cellen van een rat.

Klinisch beeld. De littekens zijn aanzienlijk kleiner geworden in vergelijking met eerdere perioden, hun oppervlakte is gemiddeld ongeveer 1,5-2,0 cm² ^. De littekens zijn ongelijkmatig bedekt met fijn haar, vooral aan de periferie. Er is nog steeds sprake van lichte schilfering van de dunne huidplaat.

Microscopisch beeld.

De opperhuid is dunner geworden, bestaat uit 6-8 rijen cellen en lijkt qua structuur op de opperhuid van een normale rattenhuid, alleen is de celdichtheid 1 mm hoger en zijn ze kleiner. De basale laag bestaat uit kleine rondcilindrische cellen. Het basale membraan is goed zichtbaar, hemidesmosomen zijn duidelijk zichtbaar. De aanwezigheid van epidermale uitgroeisels in de subepidermale laag is opgemerkt. De papillaire laag is over de gehele lengte van het litteken zichtbaar. Deze feiten wijzen erop dat de getransplanteerde keratinocyten tegen die tijd veel sterker aan het onderliggende littekenweefsel zijn gehecht. Daarom kan littekenverzorging bij mensen met een MPALK-transplantatie 9 maanden na een MPC-transplantatie traditioneel zijn. Onder de opperhuid zijn collageenvezels delicater dan in de diepere lagen. Er zijn veel vaten verschenen, vooral oppervlakkige. De wanden van grotere vaten zijn verdikt. Haarzakjes en talgklieren zijn in grote aantallen aanwezig. Het microscopisch beeld lijkt op dermaal weefsel.

Resultaten van experimenteel werk en bespreking ervan.

Tijdens dit onderzoek werden keratinocyten in verschillende vormen getransplanteerd op kunstmatig gecreëerde rattenhuidlittekens na dermabrasie: op wondbedekkingen, als suspensie op cambric en als een meerlaagse laag zonder substraat. Het doel van het onderzoek was om morfologische gegevens te verkrijgen over het effect van getransplanteerde allogene keratinocyten op littekens, en om optimale transplantatiemogelijkheden te bepalen.

Alle drie de transplantatiemethoden bleken haalbaar, maar transplantatie van de MPAC zonder substraat is een zeer arbeidsintensieve procedure, waarbij de MPAC beschadigd kan raken, wat de resultaten van de transplantatie beïnvloedt. Bovendien is bij deze transplantatiemethode geen werk op grote oppervlakken mogelijk.

Keratinocytensuspensietransplantatie is een veel kosteneffectievere methode, vereist geen langdurige celkweek en is eenvoudig in de versie die wij voorstellen, waarbij gebruik wordt gemaakt van steriele cambric blanks, waarvan de afmetingen overeenkomen met de grootte van de littekens. De vertraging in het therapeutische effect bij transplantatie van een celsuspensie met ongeveer een maand ten opzichte van MPC op een wondbedekking is geen significant punt bij een behandelingsduur van vele maanden. Het is bekend dat bij transplantatie van MPC bij brandwondenpatiënten de transformatie van de huidstructuur geleidelijk en over meerdere jaren plaatsvindt. Keratinocytenkweektransplantatie op wondbedekking is de meest geschikte en veelbelovende methode, maar ook aanzienlijk duurder. Bovendien vereist het momenteel een zoektocht naar meer geavanceerde coatingopties die flexibel, hygroscopisch, bacteriostatisch of bactericide moeten zijn en biologisch neutraal voor cellen. De "Polypor"-folie - een tussenversie van de traditionele wondbedekking - stelde ons, ondanks enkele onvolkomenheden, in staat om experimenteel de transplantatie van rattenkeratinocyten op littekens te bestuderen en conclusies te trekken over de effectiviteit van deze richting van littekenbehandeling.

De auteurs die MPC op brandwonden transplanteerden, merkten op dat de opperhuid in de eerste week na transplantatie van een meerlagige laag keratinocyten op ontsmette wonden dikker en gelaagder werd. Alle lagen van de opperhuid waren duidelijk zichtbaar. Interessant is dat het aantal cellagen in de transplantaten 10-30% hoger was dan in huidbiopsieën. De auteurs merkten op dat er keratohyalinekorrels verschenen op de vijfde dag na MPC-transplantatie, en het basaalmembraan en de hemidesmosomen al op de derde dag.

J.Rives et al. (1994), Paramonov BA (1996); Kuznetsov NM et al. (1998) ontdekten dat in de vroege stadia na transplantatie van MPC bij patiënten met volledige huiddefecten na brandwonden, de verbinding tussen de dermis en epidermis zeer zwak is en een rechte lijn is, de papillaire laag ontbreekt. Tegen het einde van de 2e maand beginnen ondiepe papillen en huidaanhangsels te vormen, de verbinding tussen de dermis en epidermis wordt sterker. Literatuurgegevens geven aan dat transplantatie van allogene keratinocyten op wonden bij brandwondenpatiënten een veelbelovende methode is. Ondanks het feit dat afstoting van allogene keratinocyten plaatsvindt, volgens verschillende auteurs, binnen 10 dagen tot 3 maanden, spelen ze niettemin hun rol bij de genezing van het wondoppervlak, door groeifactoren af te scheiden en het defect mechanisch te sluiten. Men vermoedt dat MPALC een verminderde antigene activiteit hebben, omdat ze tijdens in-vitrokweek Langerhanscellen verliezen, waardoor ze lang in het lichaam van de ontvanger kunnen overleven. Bovendien heeft een allogene kweek, verkregen uit de huid van jonge, gezonde mensen, een onvergelijkbaar groter biologisch potentieel dan een autologe kweek van patiënten na een verwonding.

Het hoofddoel van onze studie was om te onderzoeken of allogene keratinocyten zich in littekens nestelen en welke veranderingen er in littekenweefsel optreden onder invloed van zo'n biologisch actieve "wondcoating". Bij een positief resultaat de meest effectieve en minst arbeidsintensieve technologie voor dit gebied van de revalidatiegeneeskunde te ontwikkelen.

De gegevens die we verkregen, waren in veel opzichten vergelijkbaar met de literatuurgegevens over morfologische veranderingen in de menselijke epidermis na transplantatie van allogene keratinocyten in brandwonden. Er zijn echter ook significante verschillen, zowel wat betreft het morfologische substraat waarop de transplantatie plaatsvindt als wat betreft de technologie. Zo vindt de vorming van het basaalmembraan en dermale-epidermale verbindingen (hemidesmosomen, papillen) in een later stadium plaats dan bij transplantatie van keratinocyten in wondoppervlakken zonder littekenvorming. Blijkbaar gebeurt dit door de slechtere voeding van het littekenweefsel in vergelijking met de dermis of spierfascia. Een litteken, vooral een oud litteken, is een dicht bindweefsel met een zeer klein aantal vaten, terwijl de bodem van een brandwond bestaat uit granulatieweefsel rijk aan vaten. Het is dus duidelijk dat de omstandigheden waaronder de transplantatie en inplanting van keratinocyten plaatsvinden, absoluut verschillend zijn. Hoe meer gevasculariseerd het getransplanteerde gebied is, hoe gemakkelijker de inplanting verloopt. Uit dit postulaat volgt de conclusie dat het beter is om te werken met jonge littekens, waarin het bindweefsel nog vrij los en rijk aan bloedvaten is.

Als resultaat van dit experimentele werk werd bewezen dat:

1. Transplantatie van MPALK op littekens is mogelijk.
2. De optimale transplantatiemethode is het transplanteren van keratinocyten op de wondbedekking.
3. Het littekenoppervlak moet gepolijst worden met chirurgische laserdermabrasie of een Schumann-snijder.
4. Onder invloed van MPALK vindt een snelle epithelisatie van het gepolijste oppervlak van het litteken plaats.
5. Hoe beter het littekenweefsel gevasculariseerd is, dat wil zeggen hoe jonger het litteken, hoe beter de resultaten van de keratinocytentransplantatie.
6. Onder invloed van de getransplanteerde keratinocyten transformeert het littekenweefsel geleidelijk tot een huidachtig weefsel (meer los littekenweefsel met huidaanhangsels).
7. Geleidelijke verzwakking van littekenweefsel, beginnend met de subepidermale laag. De vascularisatie verbetert, collageenvezelbundels in de bovenste en onderste delen van het litteken nemen een lossere structuur aan dan in littekenweefsel zonder celtransplantatie. Haarzakjes en talgklieren verschijnen. De opperhuid benadert, na de hypertrofiefase, qua structuur de opperhuid van een normale huid.
8. De waargenomen veranderingen worden in verband gebracht met groeifactoren en cytokinen die door keratinocyten worden afgescheiden. Deze verbeteren de trofie van littekenweefsel en bevorderen de transformatie van grof vezelig weefsel naar losser weefsel, wat leidt tot een verbetering van het uiterlijk van het litteken.

Op basis van dit onderzoek kan worden geconcludeerd dat getransplanteerde keratinocyten een gunstig effect hebben op littekenweefsel, wat praktische implicaties kan hebben voor de revalidatie van patiënten met verschillende soorten littekens.

Dankzij ons werk op ratten konden we ook de eisen formuleren voor wondbedekkingen waarop keratinocyten groeien.

Wondverbanden moeten:

• biocompatibel met cellen,
• ademend,
• een elastische, vormvaste basis hebben,
• hydrofiel zijn,
• omdat medicinale additieven antibacteriële middelen en antioxidanten bevatten die niet giftig zijn voor gekweekte cellen.

Klinische resultaten van biotechnologische behandeling van littekens.

Eerder ontdekten N. Carver et al. (1993) dat occlusieve verbanden de hechting aan de wond en de overleving van keratinocyten het beste bevorderen, maar de vorming van een gelaagde (rijpe) opperhuid niet toelaten. Een luchtige omgeving is noodzakelijk voor de vorming van een gelaagde opperhuid. Daarom werd voorgesteld om, na het aanbrengen van een meerlaagse laag, het occlusieve wondverband na 7-10 dagen te verwijderen en de wonden te behandelen met droge verbanden of wateroplosbare zalven. Men kan stellen dat de kwaliteit en eigenschappen van het "substraat" waarop de cellen groeien een zeer belangrijk punt zijn voor de effectiviteit van transplantatie van celmateriaal, en daarmee voor de resultaten van het werk van artsen. Maar er bestaat vandaag de dag geen ideaal wondverband, ondanks de overvloed aan voorgestelde opties (kunsthuid, non-woven stof van carboxymethylcellulose, fibrinecoatings, semipermeabele polyurethaanfolies). Een belangrijk punt in deze kwestie zijn de kosten van ‘substraten’ (speciale wondbedekkingen), omdat de hoge kosten ervan de totale kosten van de biotechnologische behandeling verhogen.

De effectiviteit van celtechnologieën is tot nu toe bewezen, maar helaas zijn deze technologieën erg duur, vooral in landen waar de industriële productie van celcomposities nog niet is ingeburgerd. Landen zoals de Verenigde Staten hebben echter al lang een industrie ontwikkeld voor de productie van celmateriaal voor brandwondentransplantatie. Zo heeft het bedrijf BioSurface Technology Inc. sinds 1989 37.000 meerlagige keratinocytenlagen gekweekt, die werden gebruikt om 240 patiënten in 79 landen wereldwijd te behandelen (R. Odessey, 1992), terwijl 1 cm² ^celkweek ongeveer 7-8 dollar kost.

De technologie voor de behandeling van verschillende huidziekten en -problemen kent een aantal verschillen, maar elke celbehandeling is gebaseerd op het verkrijgen van hoogwaardig celmateriaal en de transplantatie daarvan.

Dit proces bestaat uit de volgende stappen:

• het nemen van huid van slachtoffers (of van donoren),
• het transporteren van huidflappen naar een biotechnologiecentrum,
• isolatie van basale laagcellen en hun proliferatie,
• groei van meerlagige keratinocytlagen (MLK).
• celcultuurtransplantatie.

Het grootste probleem bij de behandeling met transplantatie van meerlagige keratinocyten is de behoefte aan levensvatbare cellen in alle stadia van de celtransplantatie. Stukjes huid voor het isoleren van autologe of allogene cellen moeten zo dun mogelijk zijn, omdat ze in dat geval gemakkelijker te scheiden zijn met mechanische en enzymatische methoden en een suspensie van levende cellen opleveren voor kweek. Ze kunnen worden verkregen door middel van snijden met een dermatoom of door de huid van de oogleden, de voorhuid en de binnenkant van de schouder te gebruiken. Aangezien de cellen gevoelig zijn voor halogenen (chloor, jodium) en waterstofperoxide, kunnen ze niet worden gebruikt voor de verwerking van de huid tijdens de materiaalafname.

De kwantitatieve en kwalitatieve opbrengst van cellen uit huidtransplantaten en de efficiëntie van de kweek ervan hangen ook af van de gezondheid en leeftijd van de donor. Bovendien moeten huidbiopsieën zo snel mogelijk en onder geschikte omstandigheden (omgeving, temperatuur) worden afgeleverd bij een voor deze doeleinden gecertificeerd en geaccrediteerd laboratorium.

Voor de opslag en het transport van huidflappen kunnen Eagle's medium of medium 199 met toevoeging van 10% runder serum, DMEM medium met toevoeging van 5% foetaal runder serum en antibiotica worden gebruikt.

In het cytologisch laboratorium wordt het huidbiopsie eerst mechanisch in kleine stukjes verdeeld, waarna de huidstukjes met behulp van enzymen worden verwerkt: trypsine, collageenase, dispase, etc.

Onder invloed van enzymen worden desmosomen vernietigd en komen keratinocyten vrij in het medium in de vorm van individuele cellen of aggregaten bestaande uit verschillende aantallen cellen. Alleen basale keratinocyten worden gebruikt voor de kweek. Deze worden gekweekt op speciale media in thermostaten met 5% CO2, in petrischalen of in erlenmeyers bij t = 37 °C. Al na 48 uur wordt de vorming van kolonies keratinocyten waargenomen, die geleidelijk samensmelten tot een monolaag. Nadat een voldoende aantal cellen is ontvangen, wordt de resulterende suspensie geënt op speciaal voorbereide wondverbanden en in petrischalen geplaatst. Eerst wordt een monolaag en vervolgens een meerlaagse laag keratinocyten uit de suspensie gevormd. De fasen van het kweekproces van keratinocyten worden schematisch weergegeven in Fig. 12 (33, 43, 54, 65).

De vorming van een meerlagige keratinocytenlaag die geschikt is voor transplantatie duurt gewoonlijk 7-10 dagen. Soms is deze periode langer, afhankelijk van de kwaliteit van het bronmateriaal (leeftijd, gezondheidstoestand van de donor, correctheid van de materiaalafname, kwaliteit van de gebruikte media, enz.). Als de meerlagige laag te groot wordt, kunnen er cellen met apoptoseverschijnselen op het oppervlak verschijnen die ongeschikt zijn voor transplantatie. Petrischalen met meerlagige keratinocytenlagen (MLK) die erin groeien op wondbedekkingen, worden in speciale containers naar de kliniek gebracht bij een temperatuur van minimaal +15 °C.

Modified Green's methode voor het kweken van MPC

In ons werk gebruikten we meerlagige cambric als wondbedekking, waarbij we de "Polypor"-films waarmee we in het experiment met ratten begonnen, achterwege lieten. We kweekten dus meerlagige keratinocytenlagen op voorontvette en steriele cambric, hoewel dit ook geen optimale wondbedekking is.

Klinische studies werden uitgevoerd op vrijwilligers, waarbij rekening werd gehouden met de noodzakelijke ethische normen: ondertekening van een overeenkomst en geïnformeerde toestemming.

1. Er werd gebruikgemaakt van een kweek van de eigen (autologe) en opgeslagen (alloge) keratinocyten van de patiënt.
2. De keratinocyten van de patiënten werden verkregen uit een stukje huid dat van de binnenkant van hun bovenarmen werd gesneden.
3. Littekendermabrasiechirurgie werd uitgevoerd met behulp van thermocauterisatie, roterende schijven en een erbiumlaser.
4. Er werden groepen patiënten geselecteerd met normotrofe, hypotrofe en hypertrofische littekens.

Het technologische proces voor de toepassing van cellulaire technologie om het uiterlijk van huidlittekens te verbeteren, bestond uit de volgende stappen:

1. Patiëntenselectie.
2. Uitleg over de essentie van de behandeling, het tijdsbestek waarbinnen de verwachte resultaten behaald moeten worden, ondertekening van het contract en geïnformeerde toestemming.
3. Schrijf aan patiënten 2-3 weken voor de operatie selmevit 1 tablet 3 maal daags, zinctheral 1 tablet 3 maal daags voor.
4. Een stuk huid van 2,0 cm lang en 0,7-1,0 cm breed wordt van de binnenkant van de schouder genomen, bijna ter hoogte van het onderste deel van de okselstreek, om autologe keratinocyten te verkrijgen.
5. In gevallen waarbij patiënten weigerden hun eigen keratinocyten te laten isoleren vanwege de mogelijkheid van een lineair litteken aan de binnenkant van de schouder, werd celmateriaal uit een celbank gehaald (allogeen keratinocyten).
6. Keratinocyten werden geïsoleerd en gekweekt in een laboratorium dat gecertificeerd is voor dit soort werk.
7. Nadat voldoende MPC was verkregen voor transplantatie op de littekens, werd een dag voor de operatie in de kliniek vastgelegd. Het materiaal werd in speciale containers in petrischaaltjes bewaard.
8. Er werd een littekendermabrasie-operatie uitgevoerd, hemostase, het gepolijste oppervlak werd gewassen met een steriele zoutoplossing en gedroogd, waarna de MPC's erop werden getransplanteerd op steriele cambric "cells down". Dat wil zeggen dat de cellen die zich boven in de MPC bevonden, zich lager bevonden, grenzend aan het gepolijste oppervlak.
9. Er werd een steriele film aangebracht, die met een elastisch verband of elastische Omnifix-pleister op de huid werd bevestigd. In plaats van de film kunnen indifferente wondverbanden met siliconen worden gebruikt, bijvoorbeeld Mepitel, Mepiform en siliconengelpleisters.

Na 5-7 dagen wordt de film of siliconencoating verwijderd. Tegen die tijd zouden alle keratinocyten zich op het gepolijste litteken moeten hebben genesteld en zich aan het oppervlak moeten hebben gehecht.

10. De vochtige omgeving die onder de film en de siliconencoating ontstaat, draagt hier actief aan bij. De cambric die vanaf dat moment op het litteken achterblijft, kan worden doordrenkt met curiosine of chitosangel. Hierdoor ontstaat op de tweede dag een dichte korst, die voor het gemak van de patiënt het beste kan worden gefixeerd met een elastische, ademende pleister, zoals Omnifix. De ademende korst zorgt ervoor dat de gevormde opperhuid zich kan ontwikkelen tot een volwassen huid.

Afhankelijk van het type litteken en de diepte van het slijpen, wordt het verband na 8-10 dagen afgestoten. Op dat moment heeft de opperhuid 30-40% meer cellagen dan een normale huid. Het basaalmembraan is nog niet gevormd. Keratinocyten van de verdikte opperhuid scheiden veel biologisch actieve moleculen af in het littekenweefsel.

Het succes van biotechnologische littekenbehandeling hangt grotendeels af van de nazorgmethode. Celculturen zijn een "zachte" wondbedekking en in de beginfase na de transplantatie kunnen de IPC's gemakkelijk van het onderliggende weefsel worden losgemaakt. Daarom wordt patiënten geadviseerd het litteken na de operatie voorzichtig te behandelen. Wrijf gedurende 8-9 maanden niet en behandel het voorzichtig met koud gekookt water om te voorkomen dat de dunne, nieuw gevormde opperhuid, die niet goed hecht aan het onderliggende weefsel, losraakt.

Opmerking.

Vóór een operatie en tijdens dermabrasie is het gebruik van gehalogeneerde antiseptica en oxidatiemiddelen (jodopyron, suliodopyron, jodinol, jodinaat, chloorhexidine, waterstofperoxide) toegestaan. Vóór een celtransplantatie is het gebruik ervan strikt gecontra-indiceerd vanwege hun cytotoxische effect. Methyleenblauw en briljantgroen zijn ook toxisch voor cellen.

Om infectie te voorkomen, vooral bij hypertrofische littekens, kan het operatiegebied worden behandeld met neomycinesulfaat, polymyxine of gentamicine. Deze middelen hebben geen cytotoxisch effect op keratinocyten.

Door deze behandeling wordt een drievoudig effect bereikt.

1. Het egaliseren van het littekenoppervlak.
2. Het ontstaan van een nieuwe laag opperhuid van normale dikte erboven.
3. Transformatie van littekenweefsel in huidachtig weefsel door de werking van cytokinen, groeifactoren en andere biologisch actieve moleculen die door getransplanteerde cellen worden afgescheiden en door hen worden gestimuleerd: keratinocyten, fibroblasten en macrofagen.

Het litteken wordt minder opvallend, elastischer, er verschijnen poriën en donshaar en de pigmentatie kan worden hersteld dankzij de aanwezigheid van melanocyten in de IPC.

Al deze positieve aspecten van het litteken treden echter niet onmiddellijk op. Patiënten moeten er daarom op gewezen worden dat het proces van transformatie van littekenweefsel naar huidweefsel langzaam verloopt en dat het optimale resultaat van een dergelijke behandeling pas na 10-14 maanden verwacht kan worden. Direct na het afstoten van de verbanden vertonen de gepolijste oppervlakken een uitgesproken polychromie, hoe helderder hoe dieper de polijsting is uitgevoerd. De minste schade aan de huid wordt opgemerkt bij het polijsten van normotrofe littekens met een erbiumlaser. De kleur van de littekens en de omliggende huid werd binnen 3 tot 8 weken hersteld. Ondanks dergelijke voorzorgsmaatregelen treedt postoperatieve hyperpigmentatie soms op, die binnen enkele maanden vanzelf kan verdwijnen.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ]