Experimentele modellen van artrose

Kraakbeen is een zeer gespecialiseerd weefsel dat slechts één type cellen (chondrocyten) bevat en wordt gekenmerkt door de afwezigheid van bloed- en lymfevaten. Kraakbeen wordt voornamelijk gevoed door absorptie uit de synoviale vloeistof. Het metabolisme van chondrocyten wordt gereguleerd door een aantal oplosbare factoren die lokaal worden geproduceerd door chondrocyten en omliggende weefsels. De functie van chondrocyten hangt ook af van de samenstelling van de extracellulaire omgeving (zuurstofspanning, ionenconcentratie, pH, enz.), de samenstelling van de ECM, de interactie tussen cellen en de matrix, en fysieke signalen. Het belangrijkste doel van experimentele modellering is het creëren van culturen in de extracellulaire omgeving zonder het fenotype van volwassen cellen te veranderen. Het tweede doel is het creëren van culturen om de premature, vertraagde, kortdurende of langdurige reactie van chondrocyten op chemische en/of fysieke signalen te bestuderen. In-vitrostudies bieden ook de mogelijkheid om het gedrag van chondrocyten bij artrose te bestuderen. Het derde doel is het ontwikkelen van cocultuursystemen waarmee de interacties van verschillende weefsels in het gewricht kunnen worden bestudeerd. De vierde taak is het prepareren van kraakbeenimplantaten voor latere transplantatie. En tot slot, de vijfde taak, is het bestuderen van groeifactoren, cytokinen of therapeutische middelen die kraakbeenherstel kunnen stimuleren en/of kraakbeenresorptie kunnen remmen.

In de afgelopen decennia zijn verschillende modellen van gewrichtskraakbeencelculturen ontwikkeld, waaronder monolaagculturen, gesuspendeerde culturen, chondronculturen, explantaten, coculturen en onsterfelijke celculturen. Elke cultuur heeft zijn eigen voor- en nadelen en is geschikt voor het bestuderen van een specifiek aspect van het chondrocytenmetabolisme. Kraakbeenexplantaten zijn daarom een uitstekend model voor het bestuderen van de turnover van matrixelementen, waarvoor echte celoppervlakreceptoren en normale cel-matrix- en matrix-celinteracties nodig zijn. Tegelijkertijd wordt aanbevolen om matrixafzettingen of mechanismen die het chondrocytenmetabolisme reguleren te bestuderen in een cultuur van geïsoleerde cellen. Een monolaagcultuur met lage dichtheid is noodzakelijk voor het bestuderen van het proces van celdifferentiatie. Culturen gesuspendeerd in een natuurlijke of synthetische matrix vormen een model voor het analyseren van de adaptieve respons van chondrocyten op mechanische stress.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ]

Chondrocytenculturen

Bij de selectie van kraakbeenweefsel voor in-vitrostudies moet rekening worden gehouden met verschillende belangrijke punten. De matrixsamenstelling en metabole activiteit van chondrocyten variëren per gewricht, en dit laatste hangt ook af van de diepte waarop de chondrocyten zich in het weefsel bevinden. Deze gegevens werden verkregen in verschillende experimenten waarin geïsoleerde subpopulaties van chondrocyten uit kraakbeenzones van verschillende diepten werden bestudeerd. Er werden een aantal morfologische en biochemische verschillen gevonden tussen gekweekte chondrocyten in de oppervlakkige en diepe lagen van gewrichtskraakbeen. Oppervlakkige cellen synthetiseren een schaarse, proteoglycaanarme fibrillaire matrix, terwijl diepere cellen een matrix produceren die rijk is aan fibrillen en proteoglycanen. Bovendien produceren oppervlakkige cellen relatief meer kleine, niet-geaggregeerde proteoglycanen en hyaluronzuur en relatief minder aggrecan en keratansulfaat dan diepere chondrocyten. Een ander belangrijk onderscheidend kenmerk van het metabolisme van chondrocyten geïsoleerd uit kraakbeenzones van verschillende diepten is de reactie op een exogene stimulus. Volgens M. Aydelotte et al. waren runderchondrocyten uit de oppervlakkige zone van het kraakbeen gevoeliger voor IL-1 dan cellen uit de diepe zone.

Celgedrag hangt ook af van de weefsellocatie. Chondrocyten van rib- en oorkraakbeen van hetzelfde dier reageren verschillend op groeifactoren zoals fibroblastgroeifactor (FGF) en TGF-bèta. FGF verhoogde de incorporatie van thymidine, proline en leucine in gekweekte ribchondrocyten, maar niet in oorchondrocyten. TGF-bèta verhoogde de incorporatie van thymidine in rib- en oorkraakbeenchondrocyten, maar had geen effect op de incorporatie van thymidine en proline in oorchondrocyten. Kraakbeencellen uit gebieden met hoge belasting verschillen van die uit gebieden met lage belasting op het kraakbeen. Zo synthetiseren chondrocyten van volwassen schapenkniegewrichtskraakbeen uit het centrale gebied van het gewrichtsoppervlak van de tibia dat niet bedekt is door de meniscus, en dat in vivo de grootste belasting draagt, minder aggrecan, maar meer decorine dan cellen uit de zones die bedekt zijn door de meniscus. De auteurs benadrukken ook het belang van het gebruik van kraakbeen uit identieke gewrichtszones bij het bestuderen van de synthetische functie van gewrichten.

Het metabolisme van chondrocyten en hun reactie op regulerende factoren hangen ook aanzienlijk af van de leeftijd van de donor, hun skeletontwikkeling en de conditie van de gewrichten waaruit de cellen zijn genomen. Bij humane chondrocyten wordt een significante afname van de proliferatieve respons met de leeftijd waargenomen. De grootste afname wordt waargenomen bij donoren van 40-50 jaar en ouder dan 60 jaar. Bovendien neemt de ernst van de proliferatieve respons op groeifactoren (bijv. FGF en TGF-bèta) af met de leeftijd. Naast kwantitatieve veranderingen in de chondrocytenproliferatie zijn er ook kwalitatieve veranderingen. Cellen van jonge donoren (10-20 jaar) reageren beter op bloedplaatjes-afgeleide groeifactor (PDGF) dan op TGF-bèta, terwijl het tegenovergestelde wordt waargenomen bij cellen van volwassen donoren. Verschillende mechanismen worden gebruikt om leeftijdsafhankelijke veranderingen in de synthetische functie van chondrocyten en hun reactie op groeifactoren te verklaren. Deze omvatten een afname van het aantal en de affiniteit van oppervlaktecelreceptoren, veranderingen in de synthese en bioactiviteit van groeifactoren en cytokinen en wijziging van post-receptorsignalen.

Pathologische aandoeningen van gewrichten veranderen ook de morfologie en metabole activiteit van chondrocyten. Zo identificeerden J. Kouri et al. (1996) drie subpopulaties van chondrocyten in kraakbeen bij artrose. Chondrocyten uit het oppervlakkige en bovenste deel van het middelste deel van het kraakbeen vormen clusters en synthetiseren een grotere hoeveelheid proteoglycanen en collageen. TGF-bèta en insulineachtige groeifactor (IGF) kunnen de synthese van proteoglycanen door chondrocyten stimuleren en de effecten van IL-1 en TNF-a gedeeltelijk neutraliseren. Explantaten van kraakbeen dat is aangetast door artrose en chondrocyten geïsoleerd uit het kraakbeen van een patiënt met artrose zijn gevoeliger voor stimulatie van TGF-bèta dan chondrocyten van gezond kraakbeen. Deze verschillen hangen hoogstwaarschijnlijk samen met fenotypische veranderingen in chondrocyten in de bovenste lagen van het gewrichtskraakbeen.

Isolatie van individuele chondrocyten wordt bereikt door sequentiële behandeling van de ECM met proteolytische enzymen. Na hun vrijmaking uit de ECM zijn de geïsoleerde cellen ideaal voor het bestuderen van de novo-synthese van matrixcomponenten. Sommige auteurs gebruiken alleen collageenase uit Clostridium, terwijl anderen het kraakbeen pre-incuberen met trypsine, pronase, DNase en/of hyaluronidase. Het aantal geïsoleerde cellen is afhankelijk van de gebruikte enzymen. Zo kunnen, bij behandeling met alleen collageenase, 1,4-10 ^chondrocyten worden verkregen uit 1 g weefsel, terwijl pronase, hyaluronidase en collageenase 4,3-10 ^chondrocyten gebruiken. Bij behandeling met collageenase blijven aggrecan, eiwitten, IL-6 en IL-8 in aanzienlijk grotere hoeveelheden in de celkweek achter dan bij sequentiële behandeling met verschillende enzymen. Er zijn verschillende verklaringen voor deze verschillen tussen de twee celkweken:

• Celreceptoren worden beschadigd of geremd door enzymen. TGF-bèta remt de DNA- en proteoglycaansynthese in vers geïsoleerde chondrocyten (dag 1), terwijl de DNA- en proteoglycaansynthese in chondrocyten gekweekt in een monolaag (7 dagen) juist gestimuleerd wordt door TGF-bèta. Er is echter een voldoende lange periode nodig voor de herexpressie van deze membraancomponenten vóór de start van het experiment.
• Exogene proteasen kunnen de integrine-gemedieerde cel-matrixinteractie verstoren. De integrinefamilie bevordert de hechting van chondrocyten aan ECM-moleculen (Shakibaei M. et al., 1997). Deze verstoring kan de expressie van matrixgenen beïnvloeden.
• De restanten van matrixcomponenten kunnen de synthesefunctie van chondrocyten reguleren. Integrinen kunnen de producten van ECM-afbraak herkennen en spelen zo een belangrijke rol bij weefselherstel na de werking van proteolytische enzymen. T. Larsson et al. (1989) rapporteerden dat de toevoeging van intacte of gefragmenteerde proteoglycanen aan celkweek de synthese van eiwitten en proteoglycanen stimuleert. Een hoog gehalte hyaluronzuur veroorzaakt echter een significante afname van de inclusie van sulfaten in de synthese van proteoglycanen door chondrocyten van het kippenembryo, volwassen chondrocyten van varkens- en rattenchondrosarcoomcellen. Bovendien is hyaluronzuur een remmer van de proteoglycaanafgifte uit cellen, zelfs in aanwezigheid van IL-1b, TNF-a en FGF, wat wijst op een tegenwerking van de eerste biologische activiteit van groeifactoren en cytokinen. Het exacte werkingsmechanisme van hyaluronzuur blijft onduidelijk; Het is bekend dat chondrocyten een receptor voor hyaluronzuur bevatten, die gekoppeld is aan actinefilamenten in het cytosol. Binding van hyaluronzuur aan de receptor stimuleert de fosforylering van eiwitten. Deze gegevens tonen dus aan dat gefragmenteerde of natieve moleculen van matrixeiwitten de stofwisseling van chondrocyten moduleren via activering van celmembraanreceptoren.
• Snelle stimulatie van de matrixeiwitsynthese door chondrocyten door enzymen kan een gevolg zijn van veranderingen in de vorm van de chondrocyten en/of een reorganisatie van het cytoskelet.
• Sommige cytokinen (bijv. IL-8) en groeifactoren (bijv. IGF-1, TGF-β) worden opgeslagen in de ECM. Het bekendste voorbeeld is de binding van TGF-β aan decorine, wat resulteert in een verminderd vermogen van TGF-β om celgroei te induceren in ovariumcellen van Chinese hamsters. De bevinding dat het decorinegehalte in kraakbeen toeneemt met de leeftijd, suggereert een afname van de biologische beschikbaarheid van TGF-β met het ouder worden. Groeifactoren en cytokinen kunnen tijdens kweek vrijkomen uit matrixresten en vervolgens de functie van chondrocyten moduleren.

[ 8 ], [ 9 ], [ 10 ], [ 11 ]

Monolaagcultuur van chondrocyten

Het gedifferentieerde fenotype van chondrocyten wordt primair gekenmerkt door de synthese van type II collageen en weefselspecifieke proteoglycanen, evenals een lage mitotische activiteit. Er zijn aanwijzingen dat chondrocyten bij langdurige celkweek in een monolaag, evenals na meerdere herhaalde celpassages, hun bolvormige contouren verliezen en een langwerpige, fibroblastachtige vorm aannemen. Bij dergelijke fibroblastische metaplasie wordt ook de synthetische functie van de cellen gewijzigd, gekenmerkt door een progressieve afname van de synthese van collageentypen II, IX en XI en een toename van de synthese van collageentypen I, III en Y. Kleine niet-geaggregeerde proteoglycanen worden gesynthetiseerd dankzij functioneel aggrecan. De synthese van cathepsine B en L is extreem laag in gedifferentieerde cellen, maar neemt toe tijdens het proces van verlies van differentiatie. Collagenase-1 wordt tot expressie gebracht in gedifferentieerde chondrocyten; bij langdurige cultivatie neemt de expressie ervan af, terwijl de productie van weefselremmers van metalloproteasen (TIMP's) toeneemt.

Gedifferentieerde chondrocyten brengen collageen van het gedifferentieerde fenotype opnieuw tot expressie wanneer ze van een monolaagcultuur naar een gesuspendeerde kweek worden overgebracht. Het differentiatieproces is waarschijnlijk gerelateerd aan de celvorm. Deze eigenschap wordt regelmatig gebruikt door onderzoekers die defecte transplantaten met autologe chondrocyten bestuderen. Een klein aantal cellen, verkregen uit biopsiemateriaal, kan worden vermeerderd in een monolaagcultuur en vervolgens opnieuw worden ingebracht in een driedimensionale matrix vóór transplantatie. De herexpressie van een specifiek fenotype door gededifferentieerde chondrocyten die worden overgebracht naar een agarosekweek, kan worden gestimuleerd door TGF-β, osseïne-hydroxyapatietcomplex en ascorbinezuur.

Als reactie op groeifactoren en cytokinen worden chondrocyten tijdens het differentiatieproces gemodificeerd. De cellulaire respons op cytokinen en groeifactoren verschilt tussen ongedifferentieerde en gedifferentieerde chondrocyten. IL-1 stimuleert de proliferatie van fibroblasten, terwijl de groei van ongedifferentieerde chondrocyten wordt geremd door IL-1. De DNA-synthese wordt gestimuleerd door IGF-1 in langwerpige, maar niet afgeplatte chondrocyten. Bij gedifferentieerde chondrocyten zijn de stimulerende effecten van IL-1β en TNF-α op de procollagenaseproductie sterker dan bij ongedifferentieerde chondrocyten.

Chondrocytenkweek

Het kweken van chondrocyten in suspensie in een vloeibaar medium of in een natuurlijke of synthetische driedimensionale matrix stabiliseert het chondrocytenfenotype. De cellen behouden hun bolvorm en synthetiseren weefselspecifieke eiwitten. Gesuspendeerde kweek van chondrocyten wordt meestal aanbevolen om de vorming van een nieuwe pericellulaire matrix te bestuderen. Kweken van chondrocyten in synthetische of natuurlijke absorberende polymeren worden gebruikt voor implantatie van cellen in kraakbeendefecten om de regeneratie van gewrichtskraakbeenweefsel te stimuleren. Het synthetische of natuurlijke medium voor geïmplanteerde cellen moet aan een aantal eisen voldoen:

• implantaten moeten een poreuze structuur hebben voor celadhesie en groei,
• noch het polymeer zelf, noch de afbraakproducten ervan mogen ontstekingen of toxische reacties veroorzaken wanneer ze in vivo worden geïmplanteerd,
• de entdrager moet de mogelijkheid hebben om zich te hechten aan aangrenzend kraakbeen of subchondraal bot,
• de natuurlijke of synthetische matrix moet het vermogen hebben om te absorberen, de afbraak ervan moet in evenwicht zijn met de weefselregeneratie,
• om het herstel van kraakbeen te vergemakkelijken, moeten de chemische structuur en de poriearchitectuur van de matrix het behoud van het cellulaire fenotype en de synthese van weefselspecifieke eiwitten door de daarin geplaatste chondrocyten vergemakkelijken,
• Bij in vivo-implantatie is het noodzakelijk om de mechanische eigenschappen van de synthetische of natuurlijke matrix te bestuderen.

[ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ], [ 16 ]

Suspensie van chondrocyten in vloeibare fase

De hechting van cellen aan plastic vaten waarin chondrocyten worden gekweekt, kan worden voorkomen door hun wanden te coaten met een oplossing van methylcellulose, agarose, hydrogel (poly-2-hydroxyethylmethacrylaat) of een collageen-agarosemengsel. Onder deze omstandigheden vormen chondrocyten clusters en synthetiseren ze voornamelijk aggrecan en weefselspecifiek collageen (type II, IX, XI). Er worden doorgaans twee celtypen aangetroffen. De cellen in het centrum behouden een bolvorm en zijn omgeven door een goed ontwikkelde ECM, wat wordt bevestigd door histochemische en ultrastructurele studies. Aan de periferie hebben chondrocyten een schijfvormige omtrek en zijn ze omgeven door een schaarse ECM; er is weinig bekend over de functionele kenmerken van dergelijke cellen.

Het is mogelijk om chondrocyten te kweken op microdragers die in suspensie worden gehouden; dextrankorrels (Cytodex), met collageen omhulde dextrankorrels (Cytodex III) en niet-poreuze microbolletjes van type I collageen (cellagen) worden als microdragers gebruikt. Onder deze kweekomstandigheden hechten de chondrocyten zich aan het oppervlak van de microdrager, behouden hun bolvorm en produceren een matrixachtig materiaal. Bovendien bevordert het gebruik van cellagen de proliferatie van chondrocyten en de herexpressie van het normale fenotype. Daarom kan het kweken van chondrocyten op cellagenmicrobolletjes worden gebruikt om het celfenotype te herstellen vóór transplantatie.

Een andere methode voor het kweken van chondrocytensuspensie in een vloeibaar medium is het kweken ervan in de vorm van dichte ballen bestaande uit cellen (0,5-1 * 10 ^b ), verkregen door centrifugatie. Dergelijke chondrocyten kunnen een matrix produceren die een grote hoeveelheid proteoglycanen bevat, collageen type II, maar geen collageen type I, wat wordt bevestigd door histologische, immunohistochemische en kwantitatieve methoden.

Suspensie van chondrocyten in natuurlijke ECM

Chondrocyten kunnen in suspensie worden gekweekt in een driedimensionale matrix (zachte agar, agarose, collageengel of -spons, hyaluronzuur, fibrinelijm, alginaatkorrels).

Chondrocyten gekweekt in agarose behouden hun normale fenotype en synthetiseren type II collageen en weefselspecifieke aggrecaanaggregaten. Bij kweek in agarose worden de door de cel gesynthetiseerde proteoglycanen gedurende 50 dagen aan het medium afgegeven. Ter vergelijking: in een monolaagkweek is de cellulaire fase al in de eerste 5-6 dagen van de kweek overvol met glycosaminoglycanen; bij kweek in medium treedt na een verhoogde synthese en afgifte van glycosaminoglycanen in de eerste 8-10 dagen een tijdsafhankelijke afname op. Desondanks verschilt het gedrag van chondrocyten in agarose van dat in vivo. In agarose bevat een groot aantal gesynthetiseerde aggrecaanaggregaten kleinere moleculen en minder moleculen dan in vivo. TGF-β stimuleert de proteoglycaansynthese in het explantaat, maar vermindert de aggrecaansynthese in agarose.

Alginaat is een lineair polysacharide dat wordt gewonnen uit bruin zeewier. In aanwezigheid van tweewaardige kationen, zoals Ca ²⁺ -ionen, vormt dit polymeer een gel. Elke chondrocyt die in alginaat gevangen zit, is omgeven door een matrix van negatief geladen polysachariden, waarvan de poriën vergelijkbaar zijn met die in hyalien kraakbeen. De matrix die chondrocyten in alginaatkorrels vormen, bestaat uit twee compartimenten: een dunne laag celgebonden matrix die overeenkomt met de pericellulaire en territoriale matrix van gewrichtskraakbeen en een verder weg gelegen matrix die overeenkomt met de interterritoriale matrix in natuurlijk weefsel. Op dag 30 van de kweek zijn het relatieve en absolute volume dat de cellen en elk van de twee compartimenten in een alginaatkorrel innemen vrijwel volledig identiek aan die in natuurlijk kraakbeen. Gedurende bijna 30 dagen behouden chondrocyten hun bolvorm en produceren ze aggrecan, waarvan de hydrodynamische eigenschappen vergelijkbaar zijn met die van aggrecanmoleculen in de gewrichtskraakbeenmatrix, evenals collageenmoleculen van type II, IX en XI. Tegelijkertijd, net als bij andere suspensieculturen, zijn er afgeplatte cellen aanwezig op het oppervlak van alginaatkorrels, die een kleine hoeveelheid collageenmoleculen van type I produceren, die direct in het medium worden afgegeven en niet in de ECM worden opgenomen. In alginaatkorrels wordt een matige proliferatie van chondrocyten waargenomen. Na 8 maanden kweek in alginaatgel verliezen volwassen chondrocyten hun metabole activiteit niet en blijven ze weefselspecifiek collageen van type II en aggrecan produceren.

H. Tanaka et al. (1984) onderzochten de diffusie-eigenschappen van verschillende natuurlijke moleculen in alginaat en ontdekten dat moleculen groter dan 70 kDa niet door alginaat diffundeerden. Celkweek in alginaat is daarom geschikt voor het bestuderen van de regulatie van matrixbiosynthese en ECM-organisatie. De beschikbaarheid van cellen gekweekt in alginaat maakt het mogelijk om de werking van peptideregulerende factoren en farmacologische agentia op transcriptioneel, posttranscriptioneel en translationeel niveau te bestuderen.

Chondrocyten worden ook gekweekt in een matrix van collageenvezels van type I en II. S. Nehrer et al. (1997) vergeleken de werking van chondrocyten bij honden in poreuze collageen-proteoglycaanpolymeermatrices die verschillende typen collageen bevatten. Ze vonden belangrijke verschillen in de morfologie van de biosynthetische functie van chondrocyten gekweekt in collageenmatrices die collageen van type I en II bevatten. Cellen in een matrix van collageen type II behielden hun bolvorm, terwijl ze in collageen type I een fibroblastachtige morfologie hadden. Bovendien produceerden chondrocyten in een matrix van collageen type II een grotere hoeveelheid glycosaminoglycanen. J. van Susante et al. (1995) vergeleken de eigenschappen van chondrocyten gekweekt in alginaat en collageen (type I) gel. De auteurs vonden een significante toename van het aantal cellen in de collageengel, maar vanaf de zesde kweekdag verloren de cellen hun karakteristieke fenotype en veranderden ze in fibroblastachtige cellen. In de alginaatgel werd een afname van het aantal cellen waargenomen, maar de chondrocyten behielden hun normale fenotype. In de collageengel was het aantal proteoglycanen per cel significant hoger dan in alginaat, maar in de gel werd een afname in de synthese van matrixelementen waargenomen vanaf de zesde kweekdag, terwijl in alginaat de synthese bleef toenemen.

Een solide driedimensionale fibrinematrix is een natuurlijke substantie die chondrocyten ondersteunt die erin gesuspendeerd zijn in een gedifferentieerd fenotype. De driedimensionale fibrinematrix kan ook worden gebruikt als drager bij chondrocyttransplantatie. De voordelen van fibrine zijn de afwezigheid van cytotoxiciteit, het vermogen om ruimte te vullen en het adhesieve vermogen. Histologisch en biochemisch onderzoek, autoradiografie en elektronenmicroscopie hebben aangetoond dat chondrocyten in fibrinegel hun morfologie behouden, prolifereren en matrix produceren, zelfs na twee weken kweek. G. Homminga et al. (1993) rapporteerden echter dat de desintegratie van fibrine al na drie dagen kweek begint en dat de dedifferentiatie van chondrocyten voortduurt.

Suspensie van chondrocyten in kunstmatige (synthetische) ECM

Kraakbeenimplantaten voor reconstructieve of orthopedische chirurgie kunnen worden verkregen door geïsoleerde chondrocyten in vitro te kweken in een synthetische biocompatibele matrix.

Chondrocyten gekweekt in polyglycolzuur prolifereren en behouden hun normale morfologie en fenotype gedurende 8 weken. Het chondrocyt-polyglycolzuurcomplex bestaat uit cellen, glycosaminoglycanen en collageen en heeft een uitwendige collageencapsule. Dergelijke implantaten bevatten echter twee soorten collageenmoleculen: I en II. Implantaten van chondrocyten die door een reeks passages gededifferentieerd zijn, bevatten een grotere hoeveelheid glycosaminoglycanen en collageen dan implantaten van voornamelijk ongedifferentieerde chondrocyten.

L. Freed et al. (1993b) vergeleken het gedrag van menselijke en runderchondrocytenculturen in fibreus polyglycolzuur (FPGA) en poreus polymelkzuur (PPLA). Na 6-8 weken kweken van runderchondrocyten in FPGA of PPLA observeerden de auteurs celproliferatie en regeneratie van de kraakbeenmatrix. In FPGA hadden de chondrocyten een bolvorm en bevonden ze zich in lacunae omgeven door een kraakbeenmatrix. Na 8 weken in vitro kweken bevatte het geregenereerde weefsel tot 50% droge stof (4% celmassa, 15% glycosaminoglycanen en 31% collageen). In PPLA hadden de cellen een spoelvormige vorm en een kleine hoeveelheid glycosaminoglycanen en collageen. In FPGA was de celgroei twee keer zo intens als in PPLA. In vivo produceerden chondrocyten gekweekt in VPGK en PPLC binnen 1-6 maanden weefsel dat histologisch vergelijkbaar was met kraakbeen. De implantaten bevatten glycosaminoglycanen en collageen type I en II.

Bovine foetale chondrocyten werden gekweekt in poreus hydrofoob en hydrofiel polyethyleen met hoge dichtheid. Na 7 dagen incubatie in beide substraten behielden de cellen hun bolvorm en bevatten ze voornamelijk collageen type II. Na 21 dagen kweken bleek de hydrofiele matrix meer collageen type II te bevatten dan de hydrofobe matrix.

Kraakbeenweefsel kan ook worden verkregen door kweken in een monolaag op Millicell-CM-filters. Het vooraf coaten van de filters met collageen is noodzakelijk voor de hechting van chondroïtine. Histologisch onderzoek van de kweek toont de accumulatie van chondrocyten aan in de ECM, die proteoglycanen en collageen type II bevatten. Collageen type I werd in een dergelijke kweek niet gedetecteerd. Chondrocyten in het verkregen kraakbeenweefsel zijn bolvormig, maar aan het oppervlak van het weefsel enigszins afgeplat. De dikte van het nieuw gevormde weefsel nam toe met de tijd en was afhankelijk van de initiële dichtheid van de celmonolaag. Onder optimale kweekomstandigheden bereikte de dikte van het kraakbeenweefsel 110 μm; de organisatie van de cellen en het collageen in oppervlakkige en diepe lagen is vergelijkbaar met die van gewrichtskraakbeen. De ECM bevat ongeveer 3 keer meer collageen en proteoglycanen. Na twee weken cultivatie werd matrixaccumulatie waargenomen, waardoor het weefsel uit het filter kon worden gehaald en voor transplantatie kon worden gebruikt.

Sims et al. (1996) bestudeerden de kweek van chondrocyten in polyethyleenoxidegel, een ingekapselde polymeermatrix die de overdracht van grote aantallen cellen door middel van injectie mogelijk maakt. Zes weken na injectie in het subcutane weefsel van athymische muizen werd nieuw kraakbeen gevormd, dat morfologisch werd gekenmerkt door een witte opaalachtige glans, vergelijkbaar met hyalien kraakbeen. Histologische en biochemische gegevens wezen op de aanwezigheid van actief prolifererende chondrocyten die ECM produceerden.

Uitleg

Explantatie van kraakbeenweefsel wordt gebruikt om de processen van ana- en katabolisme erin, het behoud van homeostase, resorptie en herstel te bestuderen. Chondrocyten in kraakbeenexplantaten behouden een normaal fenotype en ECM-samenstelling vergelijkbaar met die in gewrichtskraakbeen in vivo. Na 5 dagen kweken in aanwezigheid van serum wordt een constant niveau van synthese en natuurlijke afbraakprocessen bereikt. Weefselresorptie kan worden versneld in de hoofdkweek en in kweek met de toevoeging van serum met behulp van een aantal middelen, zoals IL-IB, TNF-a, bacteriële lipopolysacchariden, retinoïnezuurderivaten of actieve zuurstofradicalen. Om kraakbeenherstel te bestuderen, wordt de schade ervan geïnduceerd door oplosbare ontstekingsmediatoren (H ₂ O ₂, IL-1, TNF-a) of fysieke ruptuur van de matrix.

De organotypische kweekmethode is een model voor in-vitrostudies naar de effecten van geïsoleerde externe factoren op chondrocyten en de omliggende matrix. In vivo zijn chondrocyten schaars aanwezig in de ECM en komen ze niet met elkaar in contact. De kweek van gewrichtskraakbeenexplantaten behoudt deze structurele organisatie, evenals de specifieke interacties tussen chondrocyten en de omliggende extracellulaire omgeving. Dit model wordt ook gebruikt om de effecten van mechanische stress, farmacologische middelen, groeifactoren, cytokines en hormonen op het kraakbeenmetabolisme te bestuderen.

Een ander voordeel van kraakbeenweefselexplantatie is de afwezigheid van schade aan chondrocyten onder invloed van proteolytische enzymen of mechanische factoren, wat onvermijdelijk is bij celisolatie. Receptoren en andere membraaneiwitten en glycoproteïnen worden beschermd tegen schadelijke factoren.

[ 17 ], [ 18 ], [ 19 ], [ 20 ], [ 21 ]

Chondroncultuur

Chondron is een structurele, functionele en metabolische eenheid van gewrichtskraakbeen, bestaande uit een chondrocyt, de pericellulaire matrix en het compacte filamenteuze kapsel, en verantwoordelijk voor de matrixhomeostase. Chondrons worden mechanisch uit kraakbeen geëxtraheerd en verzameld door middel van meerdere opeenvolgende homogenisaties op lage snelheid. Chondrons geïsoleerd uit zones met verschillende kraakbeendieptes kunnen worden onderverdeeld in vier categorieën: enkelvoudige chondrons, gepaarde chondrons, meerdere (drie of meer) lineair gerangschikte chondrons (chondronkolommen) en chondronclusters.

Enkele chondrons worden meestal aangetroffen in de middelste lagen van intact kraakbeen, gepaarde chondrons bevinden zich op de grens van de middelste en diepe lagen, en lineair gerangschikte meervoudige chondrons zijn typerend voor de diepe lagen van intact kraakbeen. Chondronclusters, ten slotte, bestaan uit willekeurig georganiseerde groepen van enkele en gepaarde chondrons, die na homogenisatie een geaggregeerde toestand behouden. Chondronclusters zijn grote fragmenten van kraakbeen, meestal bestaande uit meerdere chondrons en radiaal gerangschikte collageenfibrillen, d.w.z. een typische organisatie die kenmerkend is voor de diepe lagen van de matrix. Chondrons zijn geïmmobiliseerd in transparante agarose, wat onderzoek naar hun structuur, moleculaire samenstelling en metabole activiteit mogelijk maakt. Het chondron-agarosesysteem wordt beschouwd als een micromodel van kraakbeen, dat verschilt van het traditionele chondrocyt-agarosesysteem doordat de natuurlijke micro-omgeving behouden blijft en er geen noodzaak is om het te synthetiseren en te assembleren. Chondroncultuur is een model voor het bestuderen van de interacties tussen cellen en matrix in gewrichtskraakbeen onder normale en pathologische omstandigheden.

[ 22 ], [ 23 ], [ 24 ], [ 25 ], [ 26 ], [ 27 ]

Cultuur van onsterfelijke chondrocyten

Recombinant DNA of oncogen-bevattende virussen die een cel "onsterfelijk" kunnen maken, worden gebruikt om permanente cellijnen te creëren. Onsterfelijke chondrocyten hebben het vermogen om eindeloos te prolifereren met behoud van een stabiel fenotype. F. Mallein-Gerin et al. (1995) toonden aan dat het SV40T-oncogen de proliferatie van muizenchondrocyten induceert, die stabiel collageentype II, IX en XI, evenals articulair aggrecan en bindend eiwit, blijven produceren. Een dergelijke cellijn verkrijgt echter het vermogen om collageentype I te synthetiseren wanneer deze wordt gekweekt in een monolaagcultuur of in een agarosegel.

W. Horton et al. (1988) beschreven een lijn onsterfelijke cellen met een lage expressie van mRNA van type II collageen. Deze cellen werden verkregen door transformatie met een muizenretrovirus dat I-myc- en y-ra-oncogenen bevat. Dit type cellen vormt een uniek model voor het bestuderen van de interacties van de gewrichtsmatrix bij afwezigheid van type II collageen, evenals de regulatie van de synthese van type II collageen.

Het kweken van chondroprieten met gemuteerde of verwijderde genen is een handig model om hun fysiologische functie te bestuderen. Dit model is met name geschikt om de rol van specifieke moleculen in de organisatie van de kraakbeenmatrix te bestuderen of om de effecten van verschillende regulerende factoren op het kraakbeenmetabolisme te onderzoeken. Chondrocyten met een verwijderd gen voor collageen type IX synthetiseren collageenfibrillen die breder zijn dan normaal, wat aangeeft dat collageen type IX de diameter van de fibrillen reguleert. Zoals opgemerkt in hoofdstuk 1, is onlangs een mutatie ontdekt in het COLAI-gen dat codeert voor collageen type II in families met primaire gegeneraliseerde artrose. Om het effect van gemuteerd collageen type II op de gewrichtsmatrix te bestuderen, transfecteerden R. Dharmrvaram et al. (1997) defectieve COL ₂ AI (arginine op positie 519 is vervangen door cysteïne) in vitro in humane foetale chondrocyten (geïnfecteerd met vreemd nucleïnezuur).

Cocultuursysteem. In het gewricht interageert kraakbeen met andere celtypen in het synoviaal membraan, synoviaal vocht, ligamenten en subchondrale bot. Het metabolisme van chondrocyten kan worden beïnvloed door verschillende oplosbare factoren die door de genoemde cellen worden gesynthetiseerd. Zo wordt bij artritis gewrichtskraakbeen vernietigd door proteolytische enzymen en vrije radicalen die door synoviale cellen worden geproduceerd. Daarom zijn er modellen ontwikkeld om complexe interacties tussen kraakbeen en omliggend weefsel te bestuderen, die coculturen worden genoemd.

S. Lacombe-Gleise et al. (1995) kweekten konijnenchondrocyten en osteoblasten in een cocultuursysteem (COSTAR) waarin de cellen gescheiden werden door een microporeus membraan (0,4 μm), waardoor uitwisseling tussen de twee celtypen mogelijk was zonder direct contact. Deze studie toonde aan dat osteoblasten de groei van chondrocyten kunnen stimuleren via oplosbare mediatoren.

AM Malfait en co-auteurs (1994) bestudeerden de relatie tussen perifere bloedmonocyten en chondrocyten. Dit model is geschikt voor het bestuderen van cytokine-gemedieerde processen bij inflammatoire artropathieën (reumatoïde artritis, seronegatieve spondyloartritis, enz.). De auteurs van het model scheidden de cellen met een eiwitbindend membraan met poriën met een diameter van 0,4 μm. De studie toonde aan dat monocyten die werden gestimuleerd met lipopolysaccharide IL-1 en TNF-α produceerden, wat de synthese van aggrecan door chondrocyten remde en bijdroeg aan de afbraak van reeds gesynthetiseerde aggrecanaggregaten.

K. Tada et al. (1994) creëerden een cocultuurmodel waarin endotheelcellen in een collageen (type I)-gel werden geplaatst in een binnenkamer, gescheiden van de buitenkamer, met daarin chondrocyten geplaatst door een filter met een poriegrootte van 0,4 μm. In een toestand van volledige isolatie van de buitenkamer vormden humane endotheelcellen buisjes in een collageengel in aanwezigheid van EGF of TGF-α. Wanneer beide celtypen gelijktijdig werden gekweekt, werd de TGF-α-afhankelijke buisvorming door endotheelcellen geremd. Remming van dit proces door chondrocyten werd gedeeltelijk geëlimineerd door anti-TGF-β-antilichamen. Aangenomen kan worden dat TGF-β, geproduceerd door chondrocyten, de vascularisatie van het kraakbeen zelf remt.

S. Groot et al. (1994) kweekten gelijktijdig chondrocyten uit de hypertrofische en proliferatieve botzones van een 16 dagen oude muizenfoetus met stukjes hersenweefsel. Na 4 dagen kweek werd transdifferentiatie van chondrocyten naar osteoblasten en het begin van osteoïdvorming waargenomen. Na 11 dagen kweek was een deel van het kraakbeen vervangen door botweefsel en was de botmatrix gedeeltelijk verkalkt. Sommige door hersenweefsel geproduceerde neuropeptiden en neurotransmitters beïnvloeden het metabolisme van osteoblasten of hebben receptoren daarvoor. Voorbeelden hiervan zijn noradrenaline, vasoactief intestinaal peptide, calcitonine-gen-gerelateerd peptide, substantie P en somatostatine. Stukjes hersenweefsel die samen met chondrocyten worden gekweekt, kunnen enkele van de genoemde factoren produceren die het proces van transdifferentiatie van chondrocyten naar osteoblasten kunnen induceren.

[ 28 ], [ 29 ], [ 30 ], [ 31 ], [ 32 ], [ 33 ]

De invloed van externe factoren op de chondrocytencultuur

De invloed van zuurstofspanning op het chondrocytenmetabolisme

In de meeste gevallen ontwikkelen chondrocytenculturen zich onder omstandigheden van atmosferische zuurstofspanning. Het is echter bekend dat in vivo chondrocyten onder hypoxische omstandigheden leven en dat de zuurstofspanning varieert onder verschillende pathologische omstandigheden. Tijdens het rijpingsproces worden significante veranderingen in de bloedtoevoer naar de epifysen waargenomen. Omdat de vascularisatie in verschillende zones van de groeischijf varieert, varieert ook de zuurstofspanning daarin. C. Brighton en R. Heppenstall (1971) toonden aan dat in de tibiaplaat van konijnen de zuurstofspanning in de hypertrofische zone lager is dan in het omringende kraakbeen. Metingen van enkele metabole parameters toonden aan dat chondrocyten snel kunnen reageren op lokale veranderingen in de zuurstofconcentratie. Ten eerste neemt het verbruik ervan door chondrocyten af bij een lage zuurstofspanning. Bij een daling van de zuurstofspanning van 21% naar 0,04% neemt het glucosegebruik toe, nemen de activiteit van glycolytische enzymen en de synthese van melkzuur toe. Zelfs bij een lage zuurstofspanning blijft de absolute hoeveelheid ATP, ADP en AMP stabiel. Deze gegevens wijzen erop dat het metabolisme van chondrocyten gericht is op maximale energiebehoud. De syntheseactiviteit, en daarmee ook de herstelprocessen, veranderen echter onder hypoxische omstandigheden.

Een hoge zuurstofspanning beïnvloedt ook het metabolisme van chondrocyten, wat leidt tot een afname van de proteoglycaan- en DNA-synthese en afbraak van de kraakbeenmatrix. Deze effecten gaan meestal gepaard met de productie van vrije zuurstofradicalen.

De invloed van ionenconcentratie en osmotische druk van de omgeving op de chondrocytfunctie

In natuurlijk kraakbeen verschilt de ionenconcentratie aanzienlijk van die in andere weefsels: het natriumgehalte in het extracellulaire medium is 250-350 mmol en de osmolariteit is 350-450 mosmol. Wanneer chondrocyten uit de ECM worden geïsoleerd en geïncubeerd in standaardmedia (DMEM (Dulbecco's Minimal Essential Medium), met een osmolariteit van 250-280,7 mosmol), verandert de omgeving rond de cellen drastisch. Bovendien is de calcium- en kaliumconcentratie in standaardmedia aanzienlijk lager dan in natuurlijk weefsel en is de anionenconcentratie aanzienlijk hoger.

Toevoeging van sucrose aan het medium verhoogt de osmolariteit ervan en induceert een tijdelijke intracellulaire toename van de concentratie H ^+- en calciumanionen in het cytosol. Dergelijke intracellulaire veranderingen kunnen de differentiatieprocessen van chondrocyten en hun metabole activiteit beïnvloeden. J. Urban et al. (1993) ontdekten dat de opname van ³⁵ 8-sulfaat en ³ H-proline door geïsoleerde chondrocyten, geïncubeerd in standaard DMEM gedurende 2-4 uur, slechts 10% bedroeg van die in natuurlijk weefsel. De synthese-intensiteit bereikte een maximum bij een osmolariteit van het extracellulaire medium van 350-400 mosmol, zowel in vers geïsoleerde chondrocyten als in kraakbeenweefselexplantaten. Bovendien nam het volume van de chondrocyten met 30-40% toe na plaatsing van de geïsoleerde cellen in standaard DMEM met de gespecificeerde osmolariteit. Wanneer chondrocyten echter gedurende 12 tot 16 uur worden gekweekt onder omstandigheden van niet-fysiologische osmolaliteit, passen de cellen zich aan de nieuwe omstandigheden aan en neemt de intensiteit van de biosynthese af in verhouding tot de verschuiving in osmolaliteit van de extracellulaire omgeving.

P. Borgetti et al. (1995) bestudeerden het effect van de osmolariteit van het extracellulaire medium op de groei, morfologie en biosynthese van varkenschondrocyten. De auteurs toonden vergelijkbare biochemische en morfologische kenmerken aan van chondrocyten gekweekt in media met een osmolariteit van 0,28 en 0,38 mosmol. Bij een mediumosmolariteit van 0,48 mosmol werd een afname in celproliferatie en eiwitsynthese waargenomen gedurende de eerste 4-6 uur van de kweek, maar deze parameters herstelden zich vervolgens en bereikten uiteindelijk controlewaarden. Wanneer chondrocyten werden gekweekt in een medium met een osmolariteit van 0,58 mosmol, verloren de cellen het vermogen om de fysiologische intensiteit van proliferatieve processen te handhaven, en na 6 dagen was het aantal chondrocyten significant verminderd. Bij een mediumosmolariteit van 0,58 mosmol werd een sterke remming van de eiwitsynthese waargenomen. Bovendien behouden chondrocyten hun fysiologische fenotype wanneer ze worden gekweekt in media met een osmolariteit van 0,28-0,38 mOsm; bij een hogere osmolariteit (0,48-0,58 mOsm) treden significante veranderingen in celmorfologie op, wat zich manifesteert in het verlies van het karakteristieke fenotype, de transformatie van chondrocyten naar fibroblastachtige cellen en het verlies van het vermogen van cellen om matrixproteoglycanen te assembleren. De resultaten van deze studie wijzen erop dat chondrocyten kunnen reageren op beperkte fluctuaties in de osmolariteit van de extracellulaire omgeving.

Veranderingen in de concentratie van andere ionen kunnen ook de biosyntheseprocessen in chondrocyten beïnvloeden. Zo neemt de mate van ^35S (sulfaat)-opname met de helft toe bij een toename van de kaliumionenconcentratie van 5 mmol (de concentratie in het standaard DM EM-medium) tot 10 mmol (de concentratie in de ECM in vivo). Calciumconcentraties lager dan 0,5 mmol bevorderden de collageenproductie door volwassen runderchondrocyten, terwijl een concentratie van 1-2 mmol (overeenkomend met de concentratie in het standaard DM EM-medium) een significante afname van de collageensynthese veroorzaakte. Een matige toename van de biosynthese werd waargenomen bij hoge calciumgehaltes (2-10 mmol). Verschillende kationen spelen een rol bij de binding van chondrocyten aan ECM-eiwitten. Zo zorgen magnesium- en mangaanionen voor binding aan fibronectine en type II collageen, terwijl calciumionen niet deelnemen aan de binding van chondrocyten aan eiwitten. De resultaten van de beschreven onderzoeken geven dus aan dat veranderingen in extracellulaire ionen van kalium, natrium, calcium en de osmolaliteit van het medium invloed hebben op de biosynthetische functie van chondrocyten die in standaardmedia worden geïncubeerd.

Effect van mechanische stress op het chondrocytenmetabolisme

Gewrichtsimmobilisatie veroorzaakt reversibele kraakbeendetrofie, wat wijst op de noodzaak van mechanische stimuli voor normale metabolische processen in de ECM. In de meeste gevallen bestaan de gebruikte celcultuurmodellen onder normale atmosferische druk. M. Wright et al. (1996) toonden aan dat de mechanische omgeving het metabolisme van chondrocyten beïnvloedt; de celrespons hangt af van de intensiteit en frequentie van compressieve belasting. Experimenten met belasting op explantaten van intact gewrichtskraakbeen in vitro toonden een afname aan in de synthese van eiwitten en proteoglycanen onder invloed van statische belasting, terwijl dynamische belasting deze processen stimuleert. De exacte mechanismen van het effect van mechanische belasting op kraakbeen zijn complex en houden waarschijnlijk verband met celdeformatie, hydrostatische druk, osmotische druk, elektrisch potentiaal en oppervlakte-cellulaire receptoren voor matrixmoleculen. Om het effect van elk van deze parameters te bestuderen, is het noodzakelijk om een systeem te creëren waarin één parameter onafhankelijk kan worden gevarieerd. Explantkweek is bijvoorbeeld niet geschikt om celvervorming te bestuderen, maar kan wel worden gebruikt om het algemene effect van druk op de metabole activiteit van chondrocyten te bestuderen. Compressie van kraakbeen leidt tot celvervorming en gaat ook gepaard met het ontstaan van een hydrostatische drukgradiënt, elektrische potentiaal, vloeistofstroming en veranderingen in fysisch-chemische parameters zoals het watergehalte in de matrix, de elektrische ladingsdichtheid en de osmotische druk. Celvervorming kan worden bestudeerd met behulp van geïsoleerde chondrocyten ondergedompeld in agarose- of collageengel.

Er zijn verschillende systemen ontwikkeld om het effect van mechanische stimulatie op de chondrocytencultuur te bestuderen. Sommige onderzoekers gebruiken systemen waarbij druk wordt uitgeoefend op de celcultuur via de gasfase. Zo observeerden JP Veldhuijzen et al. (1979), met behulp van een druk van 13 kPa boven atmosferische druk met een lage frequentie (0,3 Hz) gedurende 15 minuten, een toename in de synthese van cAMP en proteoglycanen en een afname in DNA-synthese. R. Smith et al. (1996) toonden aan dat intermitterende blootstelling van een cultuur van primaire runderchondrocyten aan hydrostatische druk (10 MPa) met een frequentie van 1 Hz gedurende 4 uur een toename veroorzaakte in de synthese van aggrecan en type II collageen, terwijl constante druk deze processen niet beïnvloedde. Met behulp van een soortgelijk systeem rapporteerden Wright et al. (1996) dat cyclische druk op celcultuur geassocieerd is met hyperpolarisatie van het chondrocytcelmembraan en activering van Ca ²⁺ -afhankelijke kaliumkanalen. De effecten van cyclische druk worden dus gemedieerd door rek-geactiveerde ionenkanalen in het chondrocytenmembraan. De reactie van chondrocyten op hydrostatische druk hangt af van de celkweekomstandigheden en de frequentie van de toegepaste belasting. Cyclische hydrostatische druk (5 MPa) vermindert dus de sulfaatopname in de chondrocytenmonolaag bij een frequentie van 0,05, 0,25 en 0,5 Hz, terwijl bij een frequentie hoger dan 0,5 Hz de sulfaatopname in het kraakbeenexplantaat toeneemt.

M. Bushmann et al. (1992) rapporteerden dat chondrocyten in agarosegels de biosynthese veranderen als reactie op statische en dynamische mechanische belasting, net als het gekweekte intacte orgaan. De auteurs ontdekten dat mechanische belasting een hyperosmotische stimulus genereert met een daaropvolgende pH-daling in chondrocyten.

Het effect van mechanische uitrekking kan worden bestudeerd op een celcultuur ondergedompeld in een gel. De uitrekkingskracht kan worden gecreëerd met behulp van een computergestuurd vacuüm. Wanneer het systeem zich onder een bepaalde mate van vacuüm bevindt, wordt de bodem van de petrischaal met de celcultuur met een bekende hoeveelheid uitgerekt, de vervorming is maximaal aan de randen van de bodem van de schaal en minimaal in het midden. De uitrekking wordt ook overgedragen op de chondrocyten die in de petrischaal worden gekweekt. Met behulp van deze methode toonden K. Holm-vall et al. (1995) aan dat in chondrosarcoomcellen die in een collageen (type II) gel worden gekweekt, de expressie van mRNA van een 2-integrine is verhoogd _{. een 2β-integrine} kan _zich binden aan type II collageen. Het wordt beschouwd als een mechanoreceptor, omdat het interageert met actinebindende eiwitten, en zo de ECM en het cytoskelet verbindt.

Het effect van pH op het chondrocytenmetabolisme

De pH van de interstitiële vloeistof van de exocriene kraakbeenmatrix is zuurder dan die van andere weefsels. A. Maroudas (1980) bepaalde de pH van de gewrichtskraakbeenmatrix op 6,9. B. Diamant et al. (1966) vonden een pH van 5,5 onder pathologische omstandigheden. Het is bekend dat chondrocyten leven bij een lage PO2, wat wijst op de belangrijke rol van glycolyse (95% van alle glucosemetabolisme) in de stofwisseling van deze cellen; glycolyse gaat gepaard met de productie van een grote hoeveelheid melkzuur.

Naast verzuring van het milieu door glycolyseproducten zijn de matrixcomponenten zelf van groot belang. De grote hoeveelheid vaste negatieve lading op proteoglycanen wijzigt de extracellulaire ionische samenstelling: een hoge concentratie vrije kationen (bijv. H ⁺, Na ⁺, K ⁺ ) en een lage concentratie anionen (bijv. O2, HCO3 ) worden waargenomen. Bovendien wordt onder invloed van mechanische belasting water uit de ECM verdreven, wat leidt tot een toename van de concentratie vaste negatieve ladingen en de aantrekking van meer kationen in de matrix. Dit gaat gepaard met een afname van de pH van het extracellulaire milieu, wat de intracellulaire pH beïnvloedt en zo het metabolisme van chondrocyten wijzigt. R. Wilkin en A. Hall (1995) bestudeerden het effect van de pH van het extracellulaire en intracellulaire milieu op de biosynthese van de matrix door geïsoleerde runderchondrocyten. Ze observeerden een dubbele modificatie van matrixsynthese met een afname van de pH. Een lichte daling van de pH (7,4 < pH < 7,1) met 50% verhoogde de incorporatie ^{van 35} SO ₄ en ³ H-proline in chondrocyten, terwijl diepere verzuring van het medium (pH < 7,1) de synthese met 75% remde in vergelijking met de controle. Het creëren van een lage pH (6,65) met behulp van ammoniumionen veroorzaakte een afname van de matrixsynthese met slechts 20%. De verkregen resultaten geven aan dat de verandering van de pH van het extracellulaire medium van de matrixsynthese niet alleen kan worden verklaard door veranderingen in de pH van het intracellulaire medium. Bovendien hebben chondrocyten het vermogen om de intracellulaire pH te reguleren met behulp van de Na ⁺, H ⁺ -wisselaar, de Ka ⁺ -afhankelijke Cl ^_ -НСОС3 -transporter en H ⁺ /ATPase.

[ 34 ], [ 35 ], [ 36 ], [ 37 ], [ 38 ], [ 39 ], [ 40 ]

De invloed van de samenstelling van het kweekmedium op het metabolisme van chondrocyten

Het medium voor het kweken van chondrocyten moet voldoen aan de experimentele omstandigheden. De laatste jaren wordt kalfsserum gebruikt om de kweekomstandigheden te optimaliseren. Bij het gebruik van serum moet echter rekening worden gehouden met een aantal belangrijke punten:

• uitwaartse groei van cellen vanuit de periferie van weefsel in orgaanculturen,
• variabiliteit in de samenstelling van sera van verschillende series,
• de aanwezigheid van onbekende componenten erin,
• verhoogd risico op interferentie en artefacten bij het bestuderen van de invloed van verschillende biologische factoren op de metabolische activiteit van cellen.

Een voorbeeld hiervan is een onderzoek naar het effect van EGF op kraakbeenchondrocyten bij ratten. EGF stimuleerde de incorporatie van ^3H -thymidine en een toename van het DNA-gehalte in de kweek. Dit effect was sterker bij lage serumconcentraties (<1%), maar bij hoge concentraties (>7,5%) verdween het effect.

Het is bekend dat de synthese- en afbraakniveaus in DMEM aangevuld met kalfsserum aanzienlijk hoger liggen dan in vivo omstandigheden. Verschillen tussen in vivo en in vitro metabolisme kunnen te wijten zijn aan verschillen tussen de synoviale vloeistof en het medium waarin de cellen gekweekt worden. Lee et al. (1997) kweekten jonge runderchondrocyten in agarose met behulp van een voedingsmedium dat DMEM bevatte aangevuld met 20% kalfsserum en een grote hoeveelheid normale allogene synoviale vloeistof. De aanwezigheid van synoviale vloeistof in het medium induceerde een toename van de hoeveelheid proteoglycanen, tot 80% van de totale hoeveelheid synoviale vloeistof. Deze resultaten geven aan dat synoviale vloeistof in kweek een metabolisme induceert dat vergelijkbaar is met dat in vivo, met een hoge glycosaminoglycaansynthese en een lage celdeling.

G. Verbruggen et al. (1995) toonden aan dat de synthese van ³⁵ S-arrpeKaHa door humane chondrocyten gekweekt in agarose in serumvrij DMEM 20-30% bedroeg van de synthese die werd waargenomen in DMEM aangevuld met 10% kalfsserum. De auteurs bepaalden in hoeverre IGF-1, IGF-2, TGF-R of insuline de aggrecanproductie in serumvrij medium herstelde. De auteurs concludeerden dat 100 ng/ml insuline, IGF-1 of IGF-2 de aggrecansynthese gedeeltelijk herstelde tot 39-53% van het controleniveau. Er werd geen synergie of cumulatie waargenomen met een combinatie van de genoemde factoren. Tegelijkertijd stimuleerde 10 ng/ml TGF-R in aanwezigheid van 100 ng/ml insuline de aggrecansynthese tot 90% of meer van het referentieniveau. Ten slotte had humaan serumtransferrine, alleen of in combinatie met insuline, geen invloed op de aggrecansynthese. Toen kalfsserum werd vervangen door runderalbumine, nam het gehalte aan aggrecanaggregaten significant af. Verrijking van het kweekmedium met insuline, IGF of TGF-R herstelde gedeeltelijk het vermogen van cellen om aggrecanaggregaten te produceren. Bovendien zijn IGF-1 en insuline in staat de homeostase in celculturen te handhaven. Na 40 dagen kweken in een medium verrijkt met 10-20 ng/ml IGF-1, bleef de proteoglycaansynthese op hetzelfde niveau of zelfs hoger dan in het medium met 20% kalfsserum. Katabole processen verliepen langzamer in het medium verrijkt met IGF-1 dan in het medium verrijkt met 0,1% albumine-oplossing, maar iets sneller in het medium verrijkt met 20% serum. In langlevende culturen handhaaft 20 ng/ml IGF-1 een stabiele celtoestand.

D. Lee et al. (1993) vergeleken het effect van de samenstelling van het kweekmedium (DMEM, DMEM + 20% kalfsserum, DMEM + 20 ng/ml IGF-1) op de DNA-synthese in een kraakbeenweefselexplantcultuur, een monolaagcultuur en in agarosesuspensie. Bij het kweken in agarose in aanwezigheid van serum observeerden de auteurs een neiging van chondrocyten om te groeperen in grote clusters. Cellen gekweekt zonder serum of met IGF-1 behielden een ronde vorm in agarose, verzamelden zich in kleine groepen, maar vormden geen grote aggregaten. In een monolaag was de DNA-synthese significant hoger in het serumbevattende medium dan in het medium verrijkt met IGF-1; de DNA-synthese in het laatste was significant hoger dan in het niet-verrijkte medium. Er werden geen verschillen in DNA-synthese gevonden wanneer chondrocyten werden gekweekt in agarosesuspensie in een niet-verrijkt medium en in een medium met IGF-1. Tegelijkertijd ging het kweken van chondrocytensuspensies in agarose in een serumverrijkt medium gepaard met een verhoogde opname van het radionucleotide ³ H-thymidine vergeleken met andere media.

Vitamine C is noodzakelijk voor de activering van enzymen die betrokken zijn bij de vorming van een stabiele helixstructuur van collageenfibrillen. Chondrocyten met een tekort aan ascorbinezuur synthetiseren ondergehydroxyleerde, niet-helicale collageenprecursoren, die langzaam worden uitgescheiden. Toediening van ascorbinezuur (50 μg/ml) veroorzaakt hydroxylering van collageen type II en IX en hun secretie in normale hoeveelheden. Toevoeging van vitamine C had geen invloed op de proteoglycaansynthese. Daarom wordt de collageensecretie onafhankelijk van de proteoglycaansecretie gereguleerd.

[ 41 ], [ 42 ], [ 43 ], [ 44 ], [ 45 ], [ 46 ], [ 47 ]