Experimentele modellen van artrose

Kraakbeen is een zeer gespecialiseerd weefsel dat slechts één type cellen (chondrocyten) bevat, gekenmerkt door de afwezigheid van bloed en lymfevaten. Voeding van het kraakbeen wordt hoofdzakelijk uitgevoerd door absorptie uit de synoviale vloeistof. Metabolisme van chondro-cyten wordt gereguleerd door een aantal oplosbare factoren die plaatselijk worden geproduceerd door chondrocyten en omringende weefsels. De functie van chondrocyten hangt ook af van de samenstelling van het extracellulaire medium (zuurstofspanning, ionenconcentratie, pH, enz.), VCM-samenstelling, cel- en matrixinteractie, fysieke signalen. De hoofdtaak van experimentele modellering is het creëren van culturen in de extracellulaire omgeving zonder het fenotype van rijpe cellen te veranderen. De tweede taak is het creëren van culturen voor het bestuderen van de voortijdige, vertraagde, korte of langetermijnreactie van chondrocyten op chemische en / of fysieke signalen. Studies in vitro bieden ook de mogelijkheid om het gedrag van chondrocyten te bestuderen in artrose. De derde taak is de ontwikkeling van co-curatieve systemen, die het bestuderen van de interacties van verschillende weefsels in het gewricht mogelijk maken. De vierde taak is de bereiding van kraakbeenachtige implantaten voor de daaropvolgende transplantatie. En ten slotte is de vijfde taak het bestuderen van groeifactoren, cytokinen of therapeutische middelen die in staat zijn herstel en / of remming van de resorptie van kraakbeen te stimuleren.

In de afgelopen decennia zijn verschillende modellen van gewrichtskraakbeencelculturen gecreëerd, waaronder monolaagkweken, zwevende kweken, chondronculturen, explantaten, coculturen, onsterfelijke celculturen. Elke cultuur heeft zijn voor- en nadelen en elk is geschikt voor het bestuderen van een bepaald aspect van het metabolisme van chondrocyten. Kraakbeenachtige explantaten zijn dus een uitstekend model voor het bestuderen van de turnover van matrixelementen, waarvoor echte celoppervlakreceptoren en normale celmatrix- en matrix-celinteracties nodig zijn. Tegelijkertijd wordt aanbevolen het onderzoek naar afzettingen in de matrix of mechanismen voor de regulatie van het chondrocytenmetabolisme uit te voeren op een cultuur van geïsoleerde cellen. Een monolaag cultuur met lage dichtheid is noodzakelijk voor het bestuderen van het proces van celdifferentiatie. Culturen gesuspendeerd in een natuurlijke of synthetische matrix zijn een model voor het analyseren van de adaptieve respons van chondrocyten op mechanische stress.

[1], [2], [3], [4], [5], [6], [7]

Chondrocyte culturen

Bij het kiezen van kraakbeenweefsel voor in-vitrostudies, moeten verschillende belangrijke punten worden overwogen. Matrixsamenstelling en metabole activiteit van chondrocyten variëren in verschillende gewrichten, en de laatste hangt ook af van de diepte van de chondrocyte in het weefsel. Deze gegevens werden verkregen in verschillende experimenten waarbij geïsoleerde subpopulaties van chondrocyten uit de kraakbeenzones van verschillende diepten werden bestudeerd. Een aantal morfologische en biochemische verschillen werden gevonden tussen gekweekte chondrocyten die zich in het oppervlak bevinden en diepe lagen van het gewrichtskraakbeen. Oppervlaktecellen synthetiseren een zeldzame, uitgeputte proteoglycan fibrillaire matrix, terwijl diepere cellen een matrix produceren die rijk is aan fibrillen en proteoglycanen. Bovendien oppervlakkige cellen relatief klein geaggregeerde proteoglycanen en hyaluronzuur en aggrecan en relatief kleinere keratansulfaat, de dieper gelegen chondrocyten. Een ander belangrijk onderscheidend kenmerk van het metabolisme van chondrocyten geïsoleerd uit de kraakbeenzones van verschillende diepten is de respons op de exogene stimulus. Volgens M. Aydelotte en co-auteurs waren de stier-chondrocyten van de oppervlaktezone van het kraakbeen gevoeliger voor IL-1 dan de cellen van de diepe zone.

Het gedrag van de cellen hangt ook af van de locatie van het weefsel. Chondrocyten kraakbeen en oorranden, uit dezelfde dieren die verschillend reageren op groeifactoren zoals fibroblast groeifactor (FGF), en TGF-beta. FGF verhoogde thymidine, proline en leucine om de cultuur van chondrocyten rib, maar niet het oor. TGF-P verhoogde de inbouw van thymidine in het kraakbeen chondrocyten rib en oor, maar had geen effect op thymidine opname in chondrocyten en proline oor. Kraakbeencellen worden verkregen uit de gebieden welke zwaarst belast, verschillen van die van de delen met een lage belasting van het kraakbeen. Bijvoorbeeld, rijpe chondrocyten van het kraakbeen van het kniegewricht van het centrale gebied schapen articulair tibiale botoppervlak niet onder de meniscus, die de grootste belasting draagt in vivo kleinere gesynthetiseerd aggrecan, decorine maar groter dan de cellen van de door de meniscus gebieden. De auteurs benadrukken ook het belang van het gebruik van het kraakbeen van de gewrichten van identieke gebieden in de studie van de synthetische functie van de gewrichten.

Het metabolisme van chondrocyten en hun reactie op regulerende factoren hangt ook in belangrijke mate af van de leeftijd van de donor, de ontwikkeling van zijn skelet en de toestand van de gewrichten waarvan de cellen worden genomen. In humane chondrocyten wordt een significante afname met de leeftijd van de proliferatieve respons waargenomen. De grootste daling wordt waargenomen bij donors van 40-50 jaar en ouder dan 60 jaar. Bovendien neemt de ernst van de proliferatieve respons op groeifactoren (bijvoorbeeld FGF en TGF-bèta) tijdens veroudering af. Naast kwantitatieve veranderingen in de proliferatie van chondrocyten, zijn er ook kwalitatieve veranderingen. Jonge donorcellen (10-20 jaar oud) reageren beter op van bloedplaatjes afgeleide groeifactor (PDGF) dan op TGF-bèta, terwijl het tegenovergestelde wordt waargenomen bij adulte donorcellen. Om de leeftijdsafhankelijke veranderingen in de synthetische functie van chondrocyten en hun respons op het effect van groeifactoren te verklaren, worden verschillende mechanismen gebruikt. Onder hen, een afname van het aantal en de affiniteit van cellulaire oppervlakte-receptoren, een verandering in de synthese en bioactiviteit van groeifactoren en cytokines, een wijziging van postreceptorsignalen.

De pathologische toestand van de gewrichten verandert ook de morfologie en metabole activiteit van chondrocyten. Dus, J. Kouri en co-auteurs (1996) identificeerden drie subpopulaties van chondrocyten in kraakbeen met osteoartritis. Chondrocyten uit het oppervlakkige en bovenste midden van het kraakbeen vormen clusters en synthetiseren meer proteoglycanen en collageen. TGF-beta en insuline-achtige groeifactor (IGF) kan proteoglycansynthese stimuleren door chondrocyten en gedeeltelijk neutraliseren van de effecten van IL-1 en TNF-a. Kraakbeenexplantaten werden getroffen met artrose en chondrocyten afgezonderd uit kraakbeen van patiënten met osteoartritis zijn gevoeliger voor stimulatie van TGF-bèta dan gezonde kraakbeen chondrocyten. Deze verschillen zijn het meest waarschijnlijk geassocieerd met fenotypische veranderingen in chondrocyten in de bovenste lagen van het gewrichtskraakbeen.

Isolatie van individuele chondrocyten wordt bereikt door sequentiële behandeling met proteolytische enzymen van ECM. Na hun afgifte uit de ECM zijn geïsoleerde cellen bij uitstek geschikt voor het bestuderen van de synthese van de novo matrixcomponenten . Sommige auteurs gebruiken alleen clostridium collagenase, anderen pre-incuberen kraakbeen met trypsine, pronase, DNase en / of hyaluronidase. Het aantal geïsoleerde cellen hangt af van de gebruikte enzymen. Wanneer dus de verwerking van een 1 g collagenase weefsel kan worden verkregen 1,4T0 ⁶ chondrocyten, terwijl bij gebruik pronase, hyaluronidase en collagenase - 4,3-10 ⁶. Bij verwerking met collagenase blijven aggrecan, eiwitten, IL-6, IL-8 veel meer in de celcultuur dan in het geval van sequentiële behandeling met verschillende enzymen. Er zijn verschillende verklaringen voor deze verschillen tussen de twee celculturen:

• Cellulaire receptoren beschadigd of gedrukt door de werking van enzymen, TGF-bèta remt DNA-synthese van proteoglycanen in de nieuw geïsoleerde chondrocyten (dag 1), terwijl het DNA en proteoglycan synthese van chondrocyten gekweekt in monolaag (7 dagen) gestimuleerd door TGF-beta. Echter, re-expressie van het membraan componenten vereist voldoende tijd voordat het experiment.
• Exogene proteasen kunnen de interactie van cellen en de matrix verbreken, gemedieerd door integrinen. De integrinefamilie bevordert de hechting van chondrocyten aan VKM-moleculen (Shakibaei M. Et al., 1997) Deze breuk kan de expressie van matrixgenen beïnvloeden.
• Residuen van matrixcomponenten kunnen de synthetische functie van chondrocyten reguleren. Integrinen zijn in staat afbraakproducten van ECM te herkennen en spelen daardoor een belangrijke rol bij weefselherstel na blootstelling aan proteolytische enzymen. T. Larsson et al (1989) dat de toevoeging van intacte of gefragmenteerde proteoglycanen in gekweekte cellen stimuleert de synthese van eiwitten en proteoglycanen. Echter, hoge niveaus van hyaluronzuur veroorzaakt een aanzienlijke vermindering van de opname van sulfaat proteoglycan synthese door chondrocyten kippenembryo chondrocyten volwassen varkens en ratten chondrosarcoom cellen. Bovendien hyaluronzuur - remmer van proteoglycanafgifte uit de cellen zelfs in de aanwezigheid van IL-lb, TNF-a, FGF, wat aangeeft dat de eerste tegengaan van de biologische activiteit van groeifactoren en cytokines. Het exacte mechanisme dat ten grondslag ligt aan de werking van hyaluronzuur blijft onduidelijk; Het is bekend dat chondrocyten een receptor voor hyaluronzuur bevatten, geassocieerd met actine-filamenten van het cytosol. De binding van hyaluronzuur aan zijn receptor stimuleert de fosforylatie van eiwitten. Aldus demonstreren deze gegevens de modulatie van de metabolische functie van chondrocyten door gefragmenteerde of natieve moleculen van matrixeiwitten door het activeren van de membraanreceptorcellen.
• De snelle stimulering door enzymen van de synthese van matrixeiwitten door chondrocyten kan een gevolg zijn van een verandering in de vorm van chondrocyten en / of de reorganisatie van het cytoskelet.
• Sommige cytokines (bijv. IL-8) en groeifactoren (bijv. IGF-1, TGF-P) worden in de ECM gefixeerd. Het bekendste voorbeeld is de binding van TGF-beta met decor, wat leidt tot een afname van het vermogen van de eerste om cellulaire groei in ovariumcellen in Chinese hamsters te induceren. De gegevens dat de inhoud van de kraakbeendecoratie met de leeftijd toeneemt, duiden op een afname van de biologische beschikbaarheid van TGF-bèta bij veroudering. Groeifactoren en cytokinen kunnen tijdens kweken uit matrixresiduen worden vrijgemaakt en moduleren vervolgens de chondrocytfunctie.

[8], [9], [10], [11],

Monolaagkweek van chondrocyten

Het gedifferentieerde fenotype van chondrocyten wordt primair gekenmerkt door de synthese van type II collageen en weefselspecifieke proteoglycanen, evenals een laag niveau van mitotische activiteit. Er is bewijs dat bij langdurig kweken van cellen in een monolaag en na verschillende herhaalde doorgangen van cellen, de chondrocyten hun bolvormige contouren verliezen en een langwerpige, fibroblastachtige vorm krijgen. Met zo'n fibroblast metaplasie synthesefunctie ook gemodificeerde cellen, gekenmerkt door een progressieve vermindering van de synthese van het collageen II, IX en type XI en verbeterde synthese van collageen I, III en Utipov. Kleine niet-geaggregeerde proteoglycanen worden gesynthetiseerd door functioneel aggrecan. Synthetzatepsin B en L is extreem laag in gedifferentieerde cellen, maar in het proces van verlies van differentiatie neemt toe. Collagenase-1 wordt tot expressie gebracht in gedifferentieerde chondrocyten, met langdurige kweek neemt de expressie ervan af, terwijl de productie van weefselremmers van metalloproteases (TIMP) toeneemt.

De gedifferentieerde chondrocyten opnieuw tot expressie brengen van het collageen van het gedifferentieerde fenotype wanneer ze worden overgebracht van een monolaag cultuur naar een hangende. Het differentiatieproces hangt waarschijnlijk samen met de vorm van de cellen. Deze eigenschap wordt regelmatig gebruikt door onderzoekers die gebrekkige transplantaties met autologe chondrocyten bestuderen. Een klein aantal cellen verkregen uit een biopsiemateriaal kan worden vermenigvuldigd in een monolaagkweek en vervolgens opnieuw worden geplaatst in een driedimensionale matrix vóór transplantatie. Re-expressie van een specifiek fenotype door gededifferentieerde chondrocyten overgedragen aan een agarose kweek kan worden gestimuleerd met TGF-p, een osseïne-hydroxyapatietcomplex en ascorbinezuur.

Als reactie op het effect van groeifactoren en cytokines, worden chondrocyten tijdens het differentiatieproces gemodificeerd. De cellulaire respons op cytokines en groeifactoren verschillen tussen ongedifferentieerde en gedifferentieerde chondrocyten. IL-1 stimuleert de proliferatie van fibroblasten, terwijl de groei van niet-gedifferentieerde chondrocyten wordt geremd door IL-1. Synthese van DNA wordt gestimuleerd door IGF-1 in langwerpige, maar niet afgeplatte chondrocyten. In de gedifferentieerde chondrocyten zijn de stimulerende effecten van IL-1β en TNF-α op procollagenaseproducten meer uitgesproken dan in niet-gedifferentieerde.

Teelt van chondrocyten

De kweek van chondrocyten in suspensie in een vloeibaar medium of in een natuurlijke of synthetische driedimensionale matrix stabiliseert het fenotype van de chondrocyte. Cellen behouden hun bolvorm, synthetiseren weefselspecifieke eiwitten. Een gewogen chondrocytkweek wordt meestal aanbevolen voor de studie van de vorming van een nieuwe pericellulaire matrix. Chondrocytculturen in synthetische of natuurlijke absorberende polymeren worden gebruikt om cellen in kraakbeendefecten te implanteren om de regeneratie van het kraakbeenweefsel van het gewricht te stimuleren. Synthetische of natuurlijke omgeving voor implanteerbare cellen moet aan een aantal vereisten voldoen:

• Implantaten moeten een poreuze structuur hebben voor adhesie en celgroei,
• noch het polymeer zelf, noch de producten van de afbraak ervan zouden tijdens in vivo implantatie ontstekingen of toxische reacties moeten veroorzaken ,
• de transplantatiedrager moet kunnen binden aan een aangrenzend kraakbeen of subchondraal bot,
• een natuurlijke of synthetische matrix moet in staat zijn te worden geabsorbeerd, de degradatie ervan moet worden gecompenseerd door weefselregeneratie,
• Om kraakbeenherstel te vergemakkelijken, zouden de chemische structuur en matrixarchitectuur van de matrix moeten helpen het celfenotype te behouden dat wordt gecodeerd door de chondrocyten en de synthese van weefselspecifieke eiwitten,
• tijdens implantatie in vivo is het noodzakelijk om de mechanische eigenschappen van de synthetische of natuurlijke matrix te bestuderen.

[12], [13], [14], [15], [16]

Suspensie van chondrocyten in de vloeistoffase

Het bevestigen van cellen aan plastic vaten waarin chondrocyten worden gekweekt, kan worden voorkomen door hun wanden te bekleden met een oplossing van methylcellulose, agarose, hydrogel (poly-2-hydroxyethylmethacrylaat) of een mengsel van collageen-agarose. Onder deze omstandigheden vormen chondrocyten clusters en synthetiseren voornamelijk aggrecan- en weefselspecifieke collagenen (II, IX, XI-typen). Meestal worden twee soorten cellen gevonden. De cellen in het centrum behouden een bolvormige vorm omgeven door een goed ontwikkelde ECM, wat wordt bevestigd door histochemische en ultrastructurele studies. Aan de periferie hebben chondrocyten schijfvormige contouren, zijn ze omringd door een zeldzame ECM; Er is weinig bekend over de functionele kenmerken van dergelijke cellen.

Kweken van chondrocyten op microdragers ondersteund in suspensie is mogelijk; Dextran-parels (cytodex), met collageen gecoate dextran-parels (cytodex III), niet-holle microsferen van collageen type I (collageen) worden gebruikt als microdragers. Onder deze kweekomstandigheden hechten chondrocyten aan het oppervlak van de microdrager, behouden hun bolvorm en produceren een matrixachtig materiaal. Bovendien bevordert het gebruik van collageen de proliferatie van chondrocyten en de re- expressie van een normaal fenotype. Daarom kan het kweken van chondrocyten op de microsferen van het collageen worden gebruikt om het celfenotype vóór transplantatie te herstellen.

Een andere methode voor het kweken van een suspensie van chondrocyten in een vloeibaar medium is hun kweek in de vorm van dichte kralen bestaande uit cellen (0,5-1 * 10 ^b ) verkregen door centrifugatie. Dergelijke chondrocyten zijn in staat om een matrix te produceren die een groot aantal proteoglycanen, collageen type II, maar niet type I-collageen bevat, wat wordt bevestigd door histologische, immunohistochemische en kwantitatieve methoden.

Suspensie van chondrocyten in een natuurlijke ECM

Chondrocyten kunnen worden gekweekt in suspensie in een driedimensionale matrix (zachte agar, agarose, collageengel of spons, hyaluronzuur, fibrinelijm, alginaatparels).

Gekweekte agarose chondrocyten behouden hun normale fenotype en synthetiseren collageen type II en weefselspecifieke aggregaat-nieuwe aggregaten. Wanneer gekweekt in agarose, worden met behulp van cellen gesynthetiseerde proteoglycanen gedurende 50 dagen in het medium afgegeven. Ter vergelijking - in monolaagkweek wordt de celfase al in de eerste 5-6 dagen van kweken overladen met glycosaminoglycanen; wanneer gekweekt in het medium nadat de synthese en afgifte van glycosaminoglycanen is geïntensiveerd, treedt de tijdsafhankelijke afname in glycosaminoglycanen op in de eerste 8-10 dagen. Niettemin verschilt het gedrag van chondrocyten tijdens hun kweek in agarose van dat in in vivo omstandigheden. In agarose bevat een groot aantal gesynthetiseerde Aggregan-aggregaten kleinere en kleinere moleculen dan in vivo. TGF-P stimuleert de synthese van proteoglycanen in het explantaat, maar vermindert de synthese van aggrecan in agarose.

Alginaat is een lineair polysaccharide afgeleid van bruin zeewier. In de aanwezigheid van tweewaardige kationen, zoals Ca2 ^{+ -ionen}, wordt dit polymeer een gel. Elke chondrocyten gevangen in alginaat, omgeven door een matrix van negatief geladen polysacchariden, waarvan de poriën zijn vergelijkbaar met die van hyaline kraakbeen. De matrix die is gevormd chondrocyten in alginaatkorrels, bestaande uit twee segmenten - een dunne laag cel-geassocieerde matrix die correspondeert met de pericellulaire en territoriale matrices van gewrichtskraakbeen en externe interterritoriale matrix equivalent in natief weefsel. Op de 30e dag van de cultuur, relatieve en absolute volume ingenomen door cellen, en elk van de twee afdelingen in het alginaat kraal is vrijwel identiek aan die van natuurlijk kraakbeen. Bijna 30 dagen chondrocyten behouden hun bolvorm en produceren aggrecan, hydrodynamische eigenschappen die overeenkomen met die van aggrecan moleculen in de matrix van gewrichtskraakbeen en collageen molecule II, IX en XI types zijn. Tegelijkertijd, als andere culturen, suspensies, alginaat kralen op het oppervlak van afgeplatte cellen aanwezig dat een kleine hoeveelheid type I collageenmoleculen, direct in het milieu en niet in het VCR genereren. In de alginaatparels wordt matige proliferatie van chondrocyten waargenomen. Na 8 maanden kweken in alginaatgel rijpe chondrocyten niet verliest metabolische activiteit en blijft synthetiseren weefselspecifieke collageen type II en aggrecan.

N. Tanaka en coauthors (1984) onderzochten de diffusie-eigenschappen van verschillende natuurlijke moleculen in het alginaat en vonden dat moleculen groter dan 70 kD niet door het alginaat diffunderen. Aldus is het kweken van cellen in het alginaat geschikt voor het bestuderen van de regulatie van matrixbiosynthese en de organisatie van ECM. De beschikbaarheid van cellen gekweekt in het alginaat maakt het mogelijk om het effect van peptide regulerende factoren en farmacologische middelen op transcriptionele, posttranscriptionele en translationele niveaus te onderzoeken.

Chondrocyten worden ook gekweekt in een matrix van collageenvezels I en II-typen. S. Nehrer en co-auteurs (1997) vergeleken de werking van hondenchondrocyten in poreuze collageen-proteoglycan-polymere matrices die collagenen van verschillende typen bevatten. Ze vonden belangrijke verschillen in de morfologie van de biosynthetische functie van chondrocyten gekweekt in collageenmatrices die collageen typen I en II bevatten. Cellen in de matrix van collageen type II wikkelden hun bolvorm, terwijl ze in type I collageen een fibroblastachtige morfologie hadden. Bovendien produceerden chondrocyten in de matrix van type II collageen meer glycosaminoglycanen. J. Van Susante et al (1995) vergeleken de eigenschappen van chondrocyten gekweekt in het alginaat en de collageen (type I) gel. De auteurs vonden een significante toename van het aantal cellen in de collageengel, maar vanaf de 6e dag van kweken verloren de cellen een karakteristiek fenotype, veranderend in fibroblastachtige cellen. In de alginaatgel werd een afname van het aantal cellen waargenomen, maar de chondrocyten behielden hun normale fenotype. De hoeveelheid collageengel proteoglycanen per cel significant hoger dan in het alginaat, maar de afname werd waargenomen in de gel matrixelementen synthese vanaf de 6de dag van de kweek, terwijl in alginaat synthese blijven groeien.

Een solide driedimensionale fibrinematrix is een natuurlijke substantie die de daarin gewogen chondrocyten in een gedifferentieerd fenotype ondersteunt. De 3D-fibrinematrix kan ook worden gebruikt als drager voor chondrocyttransplantatie. Voordelen van fibrine zijn de afwezigheid van cytotoxiciteit, het vermogen om de ruimte te vullen, het kleefvermogen. Door histologische en biochemische studies is gevonden dat autoradiografie, elektronenmicroscopie en chondrocyten in de fibrinegel hun morfologie behouden, vermenigvuldigen en een matrix produceren, zelfs na 2 weken kweken. Echter, G. Homminga en co-auteurs (1993) rapporteerden dat, na 3 dagen van cultivatie, het desintegreren van fibrine begint, de dedifferentiatie van chondrocyten vordert.

Suspensie van chondrocyten in een kunstmatige (synthetische) ECM

Kraakbeenimplantaten voor reconstructieve of orthopedische chirurgie kunnen worden verkregen door geïsoleerde chondrocyten in vitro te groeien in een synthetische biocompatibele matrix.

Gekweekte polyglycolzuur chondrocyten prolifereren en handhaven een normale morfologie en fenotype binnen 8 weken. Het chondrocyt-polyglycolzuurcomplex bestaat uit cellen, glycosaminoglycanen, collagenen en heeft een buitenste collageencapsule. In dergelijke implantaten zijn er echter twee soorten collageenmoleculen - I en II. Implantaten die zijn gededifferentieerd door een reeks passages van chondrocyten hebben een groter aantal glycosaminoglycanen en collagenen dan in implantaten van hoofdzakelijk ongedifferentieerde chondrocyten.

L. Freed et al (1 993b) ten opzichte van het gedrag van chondrocyten kweken van humane en runder een vezelachtige polyglycolzuur (EQAP) en onenigheid polilaktilovoy acid (pPLC). Na 6-8 weken kweken van stier-chondrocyten in de HSVG of PPLC, observeerden de auteurs celproliferatie en kraakbeenmatrixregeneratie. In HSBC waren de chondrocyten bolvormig, gelokaliseerd in lacunes omgeven door een kraakbeenachtige matrix. Na 8 weken kweken in vitro geregenereerde weefsel bevatten tot 50% vaste stof (4% van de celmassa, 15% en 31% glycosaminoglycanen collagenen). In PPLK waren cellen spindelvormig, een kleine hoeveelheid glycosaminoglycanen en collageen. In HSBC was de celgroei 2 keer intenser dan in PTCA. Onder in vivo omstandigheden produceerden chondrocyten die gedurende 1 tot 6 maanden waren gekweekt in HPVC en PPLC een weefsel dat histologisch op kraakbeen lijkt. Implantaten bevatten glycosaminoglycanen, type I en type II collagenen.

Foetale stier-chondrocyten werden gekweekt in poreus hydrofoob en hydrofiel polyethyleen met hoge dichtheid. Na 7 dagen incubatie in beide substraten behielden de cellen een bolvorm, voornamelijk bevattende type II collageen. Na 21 dagen kweken bleek dat de hydrofiele matrix meer type II collageen bevat dan de hydrofobe matrix.

Kraakbeenweefsel kan ook worden verkregen door kweken in een monolaag op Millicell-CM-filters. Het vooraf coaten van de filters met collageen is noodzakelijk voor de bevestiging van chondroits. Histologisch onderzoek van de kweek demonstreert de accumulatie van chondrocyten in de ECM bevattende proteoglycanen en type II collageen. Collageen type I in een dergelijke cultuur wordt niet gedetecteerd. Chondrocyten in het resulterende kraakbeenweefsel hebben een bolvorm, maar op het oppervlak van het weefsel zijn ze enigszins afgeplat. De dikte van het nieuw gevormde weefsel nam met de tijd toe en was afhankelijk van de begindichtheid van de monolaag van cellen. Onder optimale kweekomstandigheden bereikte de dikte van het kraakbeenweefsel 110 μm, de organisatie van zijn cellen en collageen in het oppervlak en diepe lagen is vergelijkbaar met die van gewrichtskraakbeen. VKM bevat ongeveer 3 keer meer collageen en proteoglycanen. Na 2 weken kweken werd de accumulatie van de matrix-sa genoteerd, wat het mogelijk maakte om het weefsel uit het filter te extraheren en het voor transplantatie te gebruiken.

Sims et al. (1996) bestudeerden de kweek van chondrocyten in een polyethyleenoxide-gel ingekapselde polymeermatrix die het mogelijk maakt een groot aantal cellen door injectie te transporteren. Zes weken na injectie in het subcutane weefsel van athymische muizen, werd een nieuw kraakbeen gevormd, dat morfologisch werd gekenmerkt door witte opalescentie vergelijkbaar met hyalien kraakbeen. De gegevens van histologische en biochemische studies wezen op de aanwezigheid van actief prolifererende chondrocyten, die ECM produceren.

Explantatie

Onderzoek van kraakbeenweefsel wordt gebruikt om de processen van ana- en katabolisme daarin, homeostase, resorptie en reparatie te bestuderen. Chondrocyten in kraakbeenachtige weefselexplantaten ondersteunen het normale fenotype en de samenstelling van ECM, vergelijkbaar met die in gewrichtskraakbeen in vivo. Na 5 dagen kweken in aanwezigheid van serum, wordt een constant niveau van synthese en natuurlijke afbraak bereikt. De weefselresorptie kan worden versneld in de hoofdcultuur en kweek met toevoeging van serum door een aantal middelen, bijvoorbeeld IL-IB, TNF-a, bacteriële lipopolysacchariden, retinezuurderivaten of actieve zuurstofradicalen. Om de reparatie van kraakbeen te bestuderen, wordt de schade geïnduceerd door oplosbare mediatoren van ontsteking (H ₂ O ₂, IL-1, TNF-a) of fysieke breuk van de matrix.

De methode van organotypische culturen is een model voor het bestuderen van in vitro effecten van geïsoleerde externe factoren op chondrocyten en de omringende matrix. In vivo bevinden chondrocyten zich zelden in de ECM en nemen geen contact met elkaar op. De cultuur van het explant gewrichtskraakbeen behoudt deze structurele organisatie, evenals de specifieke interacties tussen de chondrocyten en hun omliggende extracellulaire omgeving. Dit model wordt ook gebruikt om het effect van mechanische stress, farmacologische middelen, groeifactoren, cytokines, hormonen op het metabolisme van kraakbeen te bestuderen.

Een ander voordeel van kraakbeenweefselexplantatie is de afwezigheid van chondrocytbeschadiging door proteolytische enzymen of een mechanische factor, die onvermijdelijk is wanneer cellen worden geïsoleerd. Receptoren en andere membraaneiwitten en glycoproteïnen worden beschermd tegen schadelijke factoren.

[17], [18], [19], [20], [21]

Cultuur van chondrons

Chondron is een structurele, functionele en metabole eenheid van gewrichtskraakbeen, bestaande uit een chondrocyte, zijn pericellulaire matrix en een compacte filamentcapsule, en is verantwoordelijk voor de matrixhomeostase. De chondrons worden mechanisch uit het kraakbeen gehaald en verzameld door verschillende opeenvolgende homogenisaties met lage snelheid. Geïsoleerd uit zones met verschillende dieptes hondrony kraakbeen kan worden onderverdeeld in vier categorieën: één hondron, tweeling hondrony, meerdere (drie of meer) lineair opgestelde hondrony (kolom hondronov) hondronov congestie.

Enkele chondrons worden meestal aangetroffen in de middenlagen van intact kraakbeen, gepaard - op de grens van middelste en diepe lagen, lineair gelegen meerdere chondrons zijn kenmerkend voor diepe lagen van intact kraakbeen. Tenslotte bestaan clusters van chondrons uit willekeurig georganiseerde groepen enkelvoudige en gepaarde chondrons die de geaggregeerde toestand behouden na homogenisatie. Accumulaties van chondrons zijn grote fragmenten van kraakbeen, meestal met verschillende chondrons en radiaal geplaatste collageenfibrillen, dat wil zeggen, een typische organisatie-eigenschap van diepe lagen van de matrix. Chondrons worden geïmmobiliseerd in een transparante agarose, die het mogelijk maakt om hun structuur, moleculaire samenstelling en metabole activiteit te bestuderen. Hondron systeem - agarose beschouwd als micro model van kraakbeen, dat verschilt van het traditionele systeem van chondrocyten - agarose dat de natuurlijke micro-omgeving behouden, hoeft de synthese en assemblage uit te voeren. De kweek van chondrons is een model voor het bestuderen van de interacties van cellen en matrix in gewrichtskraakbeen in normale en pathologische omstandigheden.

[22], [23], [24], [25], [26], [27]

Cultuur van onsterfelijke chondrocyten

Om permanente cellijnen te maken, worden recombinant DNA of oncogen bevattende virussen gebruikt die de cel "onsterfelijk" kunnen maken. Onsterfelijke chondrocyten hebben het vermogen om eindeloze proliferatie, het handhaven van een stabiel fenotype. F. Mallein-Gerin et al (1995) toonden aan dat het oncogeen-SV40T geïnduceerde proliferatie van muizen chondrocyten die dus blijven stabiel drukken de collagenen II, IX en XI types, evenals gemeenschappelijke en aggrecan bindingeiwit. Een dergelijke cellijn verwerft echter het vermogen om type I collageen te synthetiseren wanneer gekweekt in een monolaagkweek of in een agarosegel.

W. Horton en co-auteurs (1988) beschreven een lijn van onsterfelijke cellen met een laag niveau van mRNA-expressie van collageen type II. Deze cellen werden verkregen door ze te transformeren met een muizen retrovirus dat I-myc- en y-ra-oncogenen bevat. Dit type cellen is een uniek model voor het bestuderen van de interacties van de gewrichtsmatrix in afwezigheid van type II collageen, evenals de regulatie van de synthese van type II collageen.

Hondropitov cultuur met de gemuteerd of gedeleteerd gen - een geschikte model voor de studie van hun fysiologische functies. Dit model is bijzonder geschikt voor het bestuderen van de rol van specifieke moleculen in kraakbeenmatrix organisaties of het bestuderen van de effecten van verschillende regulerende factoren op kraakbeenmetabolisme. Chondrocyten afstand gen gesynthetiseerd collageen type IX collageen fibrillen groter dan normaal, wat aangeeft dat collageen type IX regelt de diameter van de fibrillen. Zoals ik in hoofdstuk 1, de nieuw gevonden genmutatie COLAI soort codering II collageen in gezinnen met primaire gegeneraliseerde artrose. Om het effect van mutant collageen type II studie in het articulaire matrix R. Dharmrvaram et al (1997) uitgevoerd transfectie ( "verontreiniging" een vreemd nucleïnezuur) defect COL ₂ AI (arginine op positie 519 is vervangen door cysteïne) in humane foetale chondrocyten in vitro.

Systeem van co-culturen. In het gewricht heeft kraakbeen een wisselwerking met cellen van andere typen die aanwezig zijn in het synoviale membraan, synoviale vloeistof, ligamenten, subchondrale botten. Het metabolisme van chondrocyten kan worden beïnvloed door verschillende oplosbare factoren die door deze cellen worden gesynthetiseerd. Artritis gewrichtskraakbeen wordt dus vernietigd door proteolytische enzymen en vrije radicalen, die worden geproduceerd door synoviale cellen. Daarom zijn er modellen ontwikkeld om complexe interacties tussen kraakbeen en omringende weefsels te bestuderen, die co-cultuur worden genoemd.

S. Lacombe-Gleise et al (1995) werden gekweekt konijn chondrocyten en osteoblasten in het gemengde cultuursysteem (Costar), waarbij de cellen microporeuze membraan gescheiden (0,4 micron) maakt de uitwisseling tussen beide celtypen niet in rechtstreeks contact. Deze studie toonde het vermogen van osteoblasten om de groei van chondrocyten door middel van oplosbare mediatoren te stimuleren.

AM Malfait en co-auteurs (1994) onderzochten de relatie tussen monocyten van perifeer bloed en chondrocyten. Dit model is handig voor het bestuderen van de processen gemedieerd door cytokinen, bij inflammatoire artropathieën (reumatoïde artritis, seronegatieve spondylitis, enz.). De auteurs van het model scheidden de cellen door een eiwitbindend membraan met poriën met een diameter van 0,4 μm. De studie wees uit dat door lipopolysaccharide gestimuleerde monocyten uitgewerkt indien geen IL-1-a, die de synthese van chondrocyten aggrecan remt en bijgedragen tot de afbraak van reeds gesynthetiseerde aggrecaanaggregaten.

K. Tada et al (1994) gemaakt van een co-cultuur model waarin endotheelcellen collageen (I-type) gel uit de buitenkamer gescheiden door chondrocyten in een filter met een poriegrootte van 0,4 micron in de binnenkamer zijn gebracht. In een toestand van volledige isolatie van de buitenste kamer vormden menselijke endotheelcellen buizen in een collageengel in de aanwezigheid van EGF of TGF-a. Met de gelijktijdige kweek van beide typen TGF-cellen werd de afhankelijke vorming van de buizen door endotheelcellen geremd. De chondrocytremming van dit proces werd gedeeltelijk geëlimineerd door anti-TGF-bèta-antilichamen. Er kan worden aangenomen dat de door de chondrocyten geproduceerde TGF-beta de vascularisatie van het kraakbeen zelf onderdrukt.

S. Groot en co-auteurs (1994) cultiveerden gelijktijdig chondrocyten uit de hypertrofische en proliferatieve zones van het bot van een 16 dagen oude foetale muis met stukjes hersenweefsel. Na 4 dagen kweken werd transdifferentiatie van chondrocyten in osteoblasten en het begin van osteoïdevorming waargenomen. Na 11 dagen kweken werd een gedeelte van het kraakbeen vervangen door botweefsel en de botmatrix was gedeeltelijk verkalkt. Sommige neuropeptiden en neurotransmitters geproduceerd door hersenweefsel, beïnvloeden het metabolisme van osteoblasten of hebben receptoren daarop. Onder hen kunnen norepinefrine, vasoactief intestinaal peptide, peptide geassocieerd met het calcitoninegen, substantie P en somatostatine worden geïsoleerd . Gekweekt met chondrocyten, kunnen stukjes hersenweefsel enkele van deze factoren produceren, die het proces van chondrocyten transdifferentiatie in osteoblasten kunnen induceren.

[28], [29], [30], [31], [32], [33]

De invloed van externe factoren op de cultuur van chondrocyten

Het effect van zuurstofspanning op het metabolisme van chondrocyten

In de meeste gevallen ontwikkelen chondrocytculturen zich onder omstandigheden van atmosferische zuurstofspanning. Niettemin is het goed bekend dat in vivo chondrocyten bestaan onder hypoxische omstandigheden en de zuurstofspanning varieert met verschillende pathologische aandoeningen. Tijdens het rijpingsproces worden significante veranderingen in de bloedtoevoer van de epifysen waargenomen. Omdat vascularisatie varieert in verschillende gebieden van de groeiplaat, varieert ook de zuurstofspanning daarin. C. Brighton en R. Heppenstall (1971) toonden aan dat in de plaat van de tibia bij konijnen, de zuurstofspanning in de hypertrofische zone minder is dan in het omliggende kraakbeen. Metingen van sommige metabole parameters hebben aangetoond dat chondrocyten in staat zijn om snel te reageren op lokale veranderingen in zuurstofconcentratie. Allereerst neemt het verbruik van chondrocyten af bij een lage zuurstofspanning. Met een afname van de zuurstofdruk van 21 tot 0,04% neemt het gebruik van glucose toe, worden glycolyse-enzymactiviteit en melkzuursynthese verhoogd. Zelfs bij een lage zuurstofspanning blijft de absolute hoeveelheid ATP, ADP en AMP stabiel. Deze gegevens duiden op de richting van het chondrocytenmetabolisme om energiebehoud te maximaliseren. Desalniettemin veranderen de synthetische activiteit, en dus de herstelprocessen, onder omstandigheden van hypoxie.

Hoge zuurstofspanning beïnvloedt ook het metabolisme van chondrocyten, waardoor de synthese van proteoglycanen en DNA afneemt, afbraak van de matrix van kraakbeen. Deze effecten gaan in de regel gepaard met de productie van vrije zuurstofradicalen.

Invloed van ionenconcentratie en osmotische druk van de omgeving op de functie van chondrocyten

In natief kraakbeen verschilt de ionconcentratie significant van die in andere weefsels: het natriumgehalte in het extracellulaire medium is 250-350 mmol en de osmolariteit ervan is 350-450 mosmol. Bij het isoleren van chondrocyten van een videorecorder en het incuberen van hen in een standaard media (DMEM (Minimaal Essentieel Medium Dulbecco's - Dulbecco's minimaal essentieel medium) osmolariteit - 250-280,7 mOsm) verandert sterk omgeving van de cel. Bovendien is de concentratie van calcium en kalium in standaardmedia veel lager dan in natuurlijk weefsel, en de concentratie van anionen is veel hoger.

Toevoeging van sucrose aan het medium leidt tot een toename van zijn osmolariteit en induceert een tijdelijke intracellulaire toename in de concentratie van H ⁺ en calciumanionen in het cytosol. Dergelijke intracellulaire veranderingen kunnen de processen van chondrocytdifferentiatie en hun metabole activiteit beïnvloeden. J. Urban et al (1993) vonden dat de opname van ³⁵ 8-sulfaat en ³ H-proline geïsoleerde chondrocyten geïncubeerd in DMEM standaard medium gedurende 2-4 uur, was slechts 10% van die in het natieve weefsel. De intensiteit van de synthese bereikte een maximum met osmolariteit van het extracellulaire medium van 350 - 400 mosmol zowel in de nieuw geïsoleerde chondrocyten als in de explantaten van het kraakbeenweefsel. Bovendien nam het chondrocytvolume toe met 30-40% na het plaatsen van geïsoleerde cellen in een standaard DMEM-medium van genoemde osmolariteit. Wanneer chondrocyten echter gedurende 12-16 uur worden gekweekt onder niet-fysiologische osmolariteit, passen cellen zich aan nieuwe omstandigheden aan, waardoor de intensiteit van biosynthese wordt verminderd in verhouding tot de osmolariteit van het extracellulaire medium.

P. Borgetti et al (1995) onderzochten het effect van osmolariteit van het extracellulaire medium van de groei, morfologie en de biosynthese van varkens chondrocyten. De auteurs tonen een overeenkomstige biochemische en morfologische kenmerken van chondrocyten gekweekt in media met een osmolariteit mOsm 0,28 en 0,38. Bij 0,48 mOsm osmolariteit van het medium tijdens de eerste 4-6 uur kweken werd waargenomen afname in celproliferatie en eiwitsynthese, maar vervolgens trad opnieuw deze parameters die uiteindelijk de controlewaarden bereikt. Wanneer chondrocyten kweken in een medium met 0,58 mOsm osmolariteit cellen verliezen hun vermogen om fysiologische intensiteit proliferatieve processen ondersteunen en na 6 dagen het aantal chondrocyten wordt aanzienlijk verminderd. Met osmolariteit van het medium, 0,58 mosmol, wordt een diepe remming van eiwitsynthese waargenomen. Bovendien, wanneer gekweekt in medium met een osmolariteit mOsm 0,28-0,38 chondrocyten behouden fysiologische fenotype bij een hogere osmolariteit (mOsm 0,48-0,58) significante veranderingen in de celmorfologie, zoals gemanifesteerde verlieskarakteristiek fenotype chondrocyten conversie in fibroblast-achtige cellen, evenals celverlies, het vermogen matrix proteoglycanen samen te stellen. De resultaten van deze studie duiden op het vermogen van chondrocyten om te reageren op beperkte osmolaliteitsoscillaties in de extracellulaire omgeving.

De verandering in de concentratie van andere ionen kan ook de processen van biosynthese in chondrocyten beïnvloeden. Aldus neemt de mate van opname van ^35S (sulfaat) met de helft toe met een toename in de concentratie van kaliumionen van 5 mmol (concentratie in een standaard DM DM-medium) tot 10 mmol (concentratie in VKM in vivo). Calciumconcentratie lager dan 0,5 mmol droeg bij aan de productie van collageen door volwassen stier-chondrocyten, terwijl een concentratie van 1-2 mmol (overeenkomend met de concentratie in het standaard DM DM-medium) een significante vermindering in collageensynthese veroorzaakte. Een matige toename in biosynthese werd waargenomen bij hoge calciumspiegels (2-10 mmol). Verschillende kationen nemen deel aan de hechting van chondrocyten aan VKM-eiwitten. Aldus verschaffen magnesium- en mangaanionen hechting aan fibronectine en collageen type II, terwijl calciumionen niet deelnemen aan de aanhechting van chondrocyten aan eiwitten. Aldus geven de resultaten van de beschreven studies de invloed aan van veranderingen in extracellulaire ionen van kalium, natrium, calcium en osmolariteit van het medium op de biosynthetische functie van chondrocyten geïncubeerd in standaard media.

De invloed van mechanische stress op het metabolisme van chondrocyten

Immobilisatie van het gewricht veroorzaakt een omkeerbare atrofie van het kraakbeen, hetgeen de behoefte aan mechanische stimuli voor het normale verloop van metabole processen in de ECM aangeeft. In de meeste gevallen bestaan de gebruikte celcultuurmodellen onder normale atmosferische drukomstandigheden. M. Wright en co-auteurs (1996) toonden aan dat de mechanische omgeving het metabolisme van chondrocyten beïnvloedt, de respons van cellen hangt af van de intensiteit en frequentie van de compressiebelasting. Experimenten met de belasting op de intacte explantaten van gewrichtskraakbeen in vitro toonde een afname van de synthese van eiwitten en proteoglycanen onder statische belasting, dynamische belasting tijdens deze processen te stimuleren. Het precieze mechanisme voor de uitvoering van de mechanische belasting effecten op kraakbeen complex en waarschijnlijk gerelateerd aan cellen, de hydrostatische druk, osmotische druk, elektrische potentiaal en celoppervlakreceptoren stam van matrixmoleculen. Om het effect van elk van deze parameters te bestuderen, is het noodzakelijk om een systeem te creëren waarin één parameter onafhankelijk kan worden gevarieerd. Een explant cultuur is bijvoorbeeld niet geschikt om celvervorming te bestuderen, maar het kan worden gebruikt om het totale effect van druk op de metabolische activiteit van chondrocyten te bestuderen. Compressie van kraakbeen leidt tot vervorming cel, en ook gepaard met het optreden van hydrostatische drukgradiënt elektrische potentiaal en fluïdumstroom verandering fysicochemische factoren als het watergehalte in de matrix, de dichtheid van de elektrische lading, de mate van osmotische druk. Celvervorming kan worden bestudeerd met behulp van geïsoleerde chondrocyten die zijn ondergedompeld in een agarose- of collageengel.

Verschillende systemen zijn ontwikkeld om het effect van mechanische stimulatie op de kweek van chondrocyten te bestuderen. Sommige onderzoekers gebruiken systemen voor dit doel waarbij de druk wordt uitgeoefend op de celcultuur door de gasfase. Bijvoorbeeld JP Veldhuijzen et al (1979) onder een druk boven de atmosferische van 13 kPa bij een lage frequentie (0,3 Hz) gedurende 15 minuten, een toename waar cAMP synthese en proteoglycanen verlagen van DNA-synthese. R. Smith et al (1996) toonden aan dat de intermitterende blootstelling van primaire kweken van chondrocyten stier hydrostatische druk (10 MPa) bij 1 Hz gedurende 4 uur veroorzaakte de toename van de synthese van aggrecan en collageen type II, terwijl de constante druk geen invloed op deze processen hebben. Via een soortgelijk systeem M. Wright et al (1996) dat de cyclische druk op de celkweek wordt geassocieerd met hyperpolarisatie van het celmembraan van chondrocyten en activering van Ca ^{2 +} afhankelijke kaliumkanalen. Aldus worden de effecten van cyclische druk gemedieerd door ionkanalen, geactiveerd door rekken, in het chondrocytmembraan. De reactie van chondrocyten op hydrostatische druk hangt af van de omstandigheden van celkweek en de frequentie van de aangebrachte belasting. Aldus cyclische hydrostatische druk (5 MPa) vermindert de opname van sulfaat in monolaag van chondrocyten met een frequentie van 0,05, 0,25 en 0,5 Hz, terwijl voor frequenties boven 0,5 Hz opname sulfaat in kraakbeen explantaat toeneemt.

M. Bushmann et al. (1992) rapporteerden dat chondrocyten in een agarosegel de biosynthese veranderen als reactie op statische en dynamische mechanische stress op dezelfde manier als het gekweekte intacte orgaan. De auteurs vonden dat de mechanische belasting een hyperosmotische stimulus genereert, gevolgd door een afname van de pH in de chondrocyten.

Het effect van mechanisch rekken kan worden bestudeerd op een cultuur van cellen die zijn ondergedompeld in een gel. De rekkracht kan worden gecreëerd met behulp van een computergestuurd vacuüm. Wanneer het systeem in een bepaalde mate in een vacuüm staat, wordt de bodem van de petrischaal met de celkweek met een bepaalde hoeveelheid verlengd, de vervorming is maximaal aan de randen van de bodem van de beker en is minimaal in het midden. Rekken wordt uitgezonden en gekweekt in een petrischaaltje van chondrocyten. Met deze methode Holm-vall K. Et al (1995) toonden aan dat gekweekt in collageen (II type) gel chondrosarcoom cellen verhoogde expressie van mRNA en ₂ -integrina. En ₂ p _g integrine kan binden aan type II collageen. Het wordt beschouwd als een mechanoreceptor, omdat het interageert met actine-bindende eiwitten, waardoor de ECM en het cytoskelet met elkaar worden verbonden.

Effect van pH op het metabolisme van Chondrocyten

De pH van de interstitiële vloeistof van ECM van het kraakbeenweefsel is zuurder dan in andere weefsels. A. Maroudas (1980) bepaalde de pH van het gewrichtskraakbeen op 6,9. W. Diamant en co-auteurs (1966) vonden een pH van 5,5 in pathologische omstandigheden. Het is bekend dat chondrocyten bij lage PO2 leven, wat de belangrijke rol van glycolyse (95% van het totale glucosemetabolisme) in het metabolisme van deze cellen aangeeft; glycolyse gaat gepaard met de productie van een grote hoeveelheid melkzuur.

Naast verzuring van het milieu door glycolyseproducten zijn de matrixcomponenten zelf van groot belang. Een groot aantal vaste negatieve lading op het extracellulaire proteoglycanen modificeert de ionische samenstelling: er is een hoge concentratie van vrije kationen (b.v. H ⁺, Na ⁺, K ⁺ ) en een lage concentratie aan anionen (bijvoorbeeld O2, NPHS). Bovendien wordt onder invloed van een mechanische belasting water uit de ECM verdreven, hetgeen leidt tot een toename van de concentratie van vaste negatieve ladingen en de aantrekking van meer kationen op de matrix. Dit gaat gepaard met een afname van de pH van het extracellulaire medium, dat de intracellulaire pH beïnvloedt, waardoor het metabolisme van chondrocyten wordt gemodificeerd. R. Wilkin en A. Hall (1995) bestudeerden het effect van de pH van het extracellulaire en intracellulaire medium op de biosynthese van de matrix door geïsoleerde stierenchondrocyten. Ze observeerden een dubbele modificatie van matrixsynthese met een afname van de pH. Een geringe verlaging van de pH (7,4 35 S0 ₄ en ³ H-proline tot chondrocyten, terwijl diepere aanzuring (pH <7,1) remt de synthese met 75% ten opzichte van controle. Het creëren van dezelfde lage pH (6.65) met ammoniumionen veroorzaakte een afname van de matrixsynthese met slechts 20%. De verkregen resultaten geven aan dat de modificatie van de pH van het extracellulaire matrixsynthesemedium niet alleen kan worden verklaard door veranderingen in de pH van het intracellulaire medium. Voorts chondrocyten bezitten het vermogen om intracellulaire pH te reguleren door Na ⁺, H ⁺ exchanger, Ca ⁺ -afhankelijke C1 ^_ -NSOZ -CONVEYORS en H ⁺ / ATPase.

[34], [35], [36], [37], [38], [39], [40]

Effect van de samenstelling van het te kweken medium op het metabolisme van chondrocyten

Het medium voor het kweken van de chondrocyten moet overeenkomen met de experimentele omstandigheden. In de afgelopen jaren werd kalverserum gebruikt om de kweekomstandigheden te optimaliseren. Bij gebruik van serum moet echter een aantal belangrijke punten worden overwogen:

• externe groei van cellen uit de periferie van weefsel in orgelculturen,
• de variabiliteit van de samenstelling van sera van verschillende series,
• aanwezigheid van onbekende componenten in hen,
• verhoogd risico op interferentie, artefacten in de studie van de invloed van verschillende biologische factoren op de metabole activiteit van cellen.

Een voorbeeld van de laatste is de studie van het effect van EGF op kraakbeenchondrocyten bij ratten. EGF stimuleerden opname van ³ H-thymidine en DNA-gehalte toenemen in de kweek. Dit effect was meer uitgesproken bij lage serumconcentraties (<1%), maar bij hoge concentraties (> 7,5%) verdween het effect.

Het is bekend dat niveaus van synthese en afbraak in DMEM verrijkt met kalfsserum aanzienlijk zijn verhoogd in vergelijking met in vivo omstandigheden. Verschillen tussen in vivo en in vitro metabolisme kunnen worden veroorzaakt door verschillen tussen de synoviale vloeistof en de omgeving waarin de cellen worden gekweekt. D. Lee et al. (1997) cultiveerden chondrocyten van jonge stieren in agarose met behulp van een voedingsmedium dat DMEM bevat verrijkt met 20% kalfsserum en een grote hoeveelheid normale allogene synoviale vloeistof. De aanwezigheid van gewrichtsvloeistof in het medium induceerde een toename in het aantal proteoglycanen, tot 80% van de totale hoeveelheid synoviale vloeistof. De verkregen resultaten geven aan dat synoviale vloeistof in kweek een metabole snelheid induceert die vergelijkbaar is met die in vivo, met een hoog niveau van glycosaminoglycan-synthese en een laag niveau van celdeling.

G. Verbruggen et al (1995) toonden aan dat de synthese van ³⁵ S-arrpeKaHa humane chondrocyten gekweekt in agarose in DMEM zonder serum was 20-30% van het niveau van synthese waargenomen in DMEM, aangevuld met 10% kalfsserum. De auteurs bepalen in welke mate IGF-1, IGF-2, TGF-P of verminderde insulineproductie aggrecan in medium zonder serum. De auteurs concludeerden dat de 100 ng / ml insuline, IGF-1 of IGF-2 gedeeltelijk verlaagde synthese van aggrecan tot 39-53% van de controleniveaus. Met een combinatie van deze factoren zijn er geen synergetische of cumulatieve verschijnselen geïdentificeerd. Tegelijkertijd, 10 ng / ml TGF-P in de aanwezigheid van 100 ng / ml insuline gestimuleerde synthese van aggrecan tot 90% of meer van het referentieniveau. Ten slotte had serumtransferrine, alleen of in combinatie met insuline, geen invloed op de synthese van aggrecan. Toen het kalverserum werd vervangen door runderserumalbumine, was het aggregaatgehalte van aggrecan significant verminderd. Verrijking van het medium voor insulinekweek, IGF of TGF-P herstelde gedeeltelijk het vermogen van de cellen om aggrecan-aggregaten te produceren. In dit geval kunnen IGF-1 en insuline de homeostase in celculturen handhaven. Na 40 dagen kweken in medium aangevuld met 10-20 ng / ml IGF-1, werd proteoglycansynthese gehandhaafd op hetzelfde niveau of zelfs hoger in vergelijking met medium dat 20% kalfsserum. Katabole processen verliep langzaam medium aangevuld met IGF-1 dan in het medium aangevuld met 0,1% albumine oplossing, maar iets sneller in medium aangevuld met 20% serum. In langlevende culturen handhaaft 20 ng / ml IGF-1 een stabiele toestand van cellen.

D. Lee et al (1993) vergeleek het effect van de samenstelling van cultuurmedium (DMEM, DMEM + 20% kalfsserum, DMEM + 20 ng / ml IGF-1) op DNA-synthese in een cultuur van explantaat kraakbeen monolaag cultuur in suspensie in agarose . Wanneer gekweekt in agarose in de aanwezigheid van serum, observeerden de auteurs een neiging om chondrocyten in grote clusters te groeperen. Cellen gekweekt zonder serum of met IGF-1 werden opgeslagen in een ronde agarose, geassembleerd in kleine groepen, maar vormden geen grote aggregaten. In de monolaag was de synthese van DNA significant hoger in serum-bevattende media dan in het medium verrijkt met IGF-1; De synthese van DNA in de laatste was veel hoger dan in de niet-aangepaste omgeving. Wanneer chondrocyten kweken in suspensie in agarose in niet-geconcentreerde medium en in een medium met IGF-1, geen verschil in DNA-synthese. Op hetzelfde moment dat de suspensie kweken van chondrocyten in agarose in medium aangevuld met serum, ging gepaard met een verhoogde opname van radionucleotide ³ H-thymidine in vergelijking met andere omgevingen.

Vitamine C is noodzakelijk voor de activering van enzymen die betrokken zijn bij de vorming van een stabiele spiraalstructuur van collageenvezels. Chondrocyten, deficiënt met betrekking tot ascorbinezuur, synthetiseren onder-gehydroxyleerde niet-helixvoorlopers van collageen, die langzaam worden uitgescheiden. De introductie van ascorbinezuur (50 μg / ml) veroorzaakt hydroxylatie van collageentypen II en IX en hun afscheiding in normale hoeveelheden. De toevoeging van vitamine C had geen invloed op het niveau van synthese van proteoglycanen. Bijgevolg wordt de uitscheiding van collageen onafhankelijk van de secretie van proteoglycanen gereguleerd.

[41], [42], [43], [44], [45], [46], [47]