Mesenchymale stamcellen

Onder de regionale stamcellen nemen mesenchymale stamcellen (MSC's) een bijzondere plaats in. Hun derivaten vormen de stromamatrix van alle organen en weefsels van het menselijk lichaam. Prioriteit in MSC-onderzoek ligt bij vertegenwoordigers van de Russische biologische wetenschap.

Halverwege de vorige eeuw werd voor het eerst een homogene cultuur van multipotente stromale stamcellen uit beenmerg geïsoleerd in het laboratorium van A. Friedenstein. Mesenchymale stamcellen, gehecht aan het substraat, behielden langdurig een hoge proliferatie-intensiteit en vormden in culturen met een lage zaaidichtheid na fixatie op het substraat klonen van fibroblastachtige cellen die geen fagocyterende activiteit vertoonden. De stopzetting van de MSC-proliferatie eindigde met hun spontane differentiatie in vitro tot cellen van bot, vet, kraakbeen, spier of bindweefsel. Verder onderzoek maakte het mogelijk om het osteogene potentieel van fibroblastachtige cellen in het beenmergstroma van verschillende zoogdiersoorten vast te stellen, evenals hun kolonievormende activiteit. In vivo-experimenten hebben aangetoond dat zowel hetero- als orthotope transplantatie van kolonievormende fibroblastachtige cellen resulteert in de vorming van bot, kraakbeen, bindweefsel en vetweefsel. Omdat stromale stamcellen uit het beenmerg zich kenmerken door een groot vermogen tot zelfvernieuwing en veelzijdige differentiatie binnen een enkele cellijn, worden ze multipotente mesenchymale voorlopercellen genoemd.

Opgemerkt moet worden dat in de loop van meer dan 45 jaar fundamenteel onderzoek naar mesenchymale stamcellen de daadwerkelijke voorwaarden zijn geschapen voor het gebruik van hun derivaten in de klinische praktijk.

Tegenwoordig bestaat er geen twijfel meer over dat alle weefsels van het menselijk lichaam worden gevormd uit stamcellen van verschillende cellijnen als gevolg van de processen van proliferatie, migratie, differentiatie en rijping. Tot voor kort werd echter aangenomen dat stamcellen in een volwassen organisme weefselspecifiek zijn, d.w.z. dat ze alleen lijnen van gespecialiseerde cellen kunnen produceren van die weefsels waarin ze zich bevinden. Deze conceptuele positie werd weerlegd door de feiten dat hematopoëtische stamcellen niet alleen transformeren tot cellulaire elementen van perifeer bloed, maar ook tot ovale levercellen. Bovendien bleken neurale stamcellen in staat om zowel neuronen als gliale elementen te vormen, evenals vroege, toegewijde lijnen van hematopoëtische voorlopercellen. Mesenchymale stamcellen, die gewoonlijk cellulaire elementen van bot, kraakbeen en vetweefsel produceren, zijn op hun beurt in staat om te transformeren tot neurale stamcellen. Aangenomen wordt dat tijdens het proces van groei, fysiologische en herstellende weefselregeneratie, niet-gecommitteerde voorlopercellen worden gegenereerd uit weefsel-niet-specifieke stamreserves. Zo kan bijvoorbeeld spierweefselherstel gerealiseerd worden doordat mesenchymale stamcellen vanuit het beenmerg naar de skeletspieren migreren.

Hoewel een dergelijke kruislingse uitwisselbaarheid van stamcellen niet door alle onderzoekers wordt erkend, wordt de mogelijkheid van klinisch gebruik van mesenchymale stamcellen als bron voor celtransplantatie en als cellulaire vector van genetische informatie niet langer betwist, evenals de multipotentie van beenmergstromale stamcellen, die relatief eenvoudig kunnen worden geïsoleerd en in vitro gekweekt. Tegelijkertijd blijven er in de wetenschappelijke literatuur berichten verschijnen over de potentiële pluripotentie van beenmergstromale stamcellen. Als bewijs worden onderzoeksprotocollen aangehaald waarin MSC's, onder invloed van specifieke transdifferentiatie-inductoren, worden getransformeerd tot zenuwcellen, cardiomyocyten en hepatocyten. Sommige wetenschappers hebben echter ernstige twijfels over de mogelijkheid van herhaalde activering en expressie van genen uit de periode van de vroege embryogenese. Tegelijkertijd begrijpt iedereen dat als de omstandigheden worden gevonden om de multipotentie van mesenchymale stamcellen uit te breiden tot de pluripotentie van ES-cellen, veel ethische, morele, religieuze en juridische problemen in de regeneratieve plastische geneeskunde automatisch zullen worden opgelost. Bovendien, aangezien in dit geval de autologe stromacellen van de patiënt de bron van regeneratief stamcelpotentieel zijn, is ook het probleem van immuunafstoting van de celtransplantatie opgelost. De nabije toekomst zal uitwijzen hoe realistisch deze vooruitzichten zijn.

[ 1 ], [ 2 ]

Gebruik van mesenchymale stamcellen in de geneeskunde

In de kliniek wordt het gebruik van mesenchymale stamcelderivaten primair geassocieerd met het herstel van weefseldefecten die optreden bij uitgebreide en diepe thermische huidlaesies. In de preklinische fase werd een experimentele beoordeling uitgevoerd van de haalbaarheid van het gebruik van allogene fibroblastachtige mesenchymale stamcellen voor de behandeling van diepe brandwonden. Er werd aangetoond dat fibroblastachtige mesenchymale stamcellen uit het beenmerg in kweek een monolaag vormen, waardoor transplantatie mogelijk is om de regeneratieprocessen van diepe brandwonden te optimaliseren. De auteurs merken op dat embryonale fibroblasten vergelijkbare eigenschappen hebben, maar dat hun klinische gebruik wordt beperkt door bestaande ethische en juridische problemen. Een diepe thermische brandwond met schade aan alle huidlagen werd gemodelleerd naar Wistar-ratten. Het brandwondoppervlak besloeg 18-20% van het totale huidoppervlak. De eerste experimentele groep bestond uit ratten met een diepe thermische brandwond en transplantatie van allogene fibroblastachtige mesenchymale stamcellen. De tweede groep bestond uit dieren met een diepe thermische brandwond en transplantatie van allogene embryonale fibroblasten. De derde groep bestond uit controleratten met een diepe thermische brandwond die geen celtherapie ondergingen. Een suspensie van fibroblastachtige mesenchymale stamcellen en embryonale fibroblasten werd met een pipet aangebracht op het oppervlak van de brandwond in een hoeveelheid van 2 x 104 ^.cellen op de 2e dag na brandwondmodellering en excisie van de resulterende necrotische korst. Na celtransplantatie werd het brandwondoppervlak bedekt met een gaasje bevochtigd met een isotone natriumchloride-oplossing met gentamicine. Beenmergcellen werden verzameld om MSC's te verkrijgen met hun daaropvolgende inductie in een lijn van fibroblastachtige mesenchymale stamcellen van volwassen Wistar-ratten uit dijbenen. Embryonale fibroblasten werden verkregen uit de longen van 14-17 dagen oude embryo's. Embryonale fibroblasten en beenmergcellen voor het verkrijgen van MSC's werden vooraf gekweekt in petrischalen bij een temperatuur van 37 °C in een CO2-incubator, in een atmosfeer met 5% CO2 en een luchtvochtigheid van 95%. Embryonale fibroblasten werden 4-6 dagen gekweekt, terwijl de vorming van een monolaag van MSC's 14 tot 17 dagen duurde. Vervolgens werden MSC's cryoconserveerd als bronmateriaal voor fibroblastachtige mesenchymale stamcellen, die werden verkregen door MSC's gedurende 4 dagen te ontdooien en te kweken. Het aantal gevormde fibroblastachtige mesenchymale stamcellen was meer dan 3 keer hoger dan het aantal embryonale fibroblasten dat tijdens dezelfde kweekperiode werd gevormd. Om de getransplanteerde cellen in brandwonden tijdens de kweekfase te identificeren, werd hun genoom gelabeld met behulp van een virale shuttlevector gebaseerd op recombinant adenovirus type V met het 1ac-2-gen dat codeert voor E. coli ß-galactosidase. Levende cellen op verschillende tijdstippen na transplantatie werden immunohistochemisch gedetecteerd in cryocoupes met de toevoeging van X-Gal-substraat, wat een karakteristieke blauwgroene kleuring geeft. Door dynamische visuele, planimetrische en histologische beoordeling van de conditie van de brandwond werd vastgesteld dat er al op de derde dag na de celtransplantatie significante verschillen in het verloop van het wondproces in de geselecteerde groepen optreden. Dit verschil werd vooral duidelijk op de 7e dag na de celtransplantatie. Bij de dieren van de eerste groep, waar fibroblastachtige mesenchymale stamcellen werden getransplanteerd, kreeg de wond een gelijkmatig intens roze kleur, groeide er granulatieweefsel over het gehele oppervlak tot aan de opperhuid en nam het brandwondoppervlak aanzienlijk in omvang af. De collageenfilm die zich op het wondoppervlak vormde, werd iets dunner, maar bleef het gehele brandwondgebied bedekken. Bij de dieren van de tweede groep, waar embryonale fibroblasten werden getransplanteerd, steeg het granulatieweefsel tot aan de opperhuid van de wondranden, maar slechts plaatselijk, terwijl de plasmorroe vanuit de wond intenser was dan in de eerste groep en de aanvankelijk gevormde collageenfilm vrijwel verdween. Bij dieren die geen celtherapie kregen, was de brandwond op de 7e dag bleek, gepit, necrotisch weefsel bedekt met fibrine. Plasmorea werd over het gehele brandoppervlak opgemerkt. Histologisch vertoonden de dieren van de 1e en 2e groep een afname in cellulaire infiltratie en ontwikkeling van het vasculaire netwerk,en deze tekenen van het beginnende regeneratieve proces waren meer uitgesproken bij de ratten van de 1e groep. In de controlegroep werden tekenen van cellulaire infiltratie van de wond waargenomen, het histologische patroon van nieuw gevormde vaten was afwezig. Op de 15e-30e dag van observatie was het gebied van het brandwondoppervlak bij de dieren van de 1e groep significant kleiner dan bij de ratten van de andere groepen, en was het granulerende oppervlak meer ontwikkeld. Bij de dieren van de 2e groep nam het gebied van het brandwondoppervlak ook af in vergelijking met de grootte van de brandwonden bij de ratten van de controlegroep, wat optrad als gevolg van marginale epithelisatie. In de controlegroep bleef het brandwondoppervlak bleek op plaatsen met zeldzame granulaties, verschenen er vasculaire asterisken op, waren er eilandjes van fibrineuze plaque, bleef matige plasmorroe over het gehele brandwondoppervlak en bleef op sommige plaatsen een korst achter die moeilijk te verwijderen was. Over het algemeen nam bij dieren uit de 3e groep de wondgrootte ook af, maar de randen van de wond bleven ondermijnd.

Zo werd tijdens een vergelijkende studie naar de wondgenezingssnelheid met fibroblastachtige mesenchymale stamcellen en embryonale fibroblasten, en ook zonder celtherapie, een versnelling van de wondgenezing van het brandwondoppervlak waargenomen als gevolg van de transplantatie van fibroblastachtige mesenchymale stamcellen en embryonale fibroblasten. Bij gebruik van allogene fibroblastachtige mesenchymale stamcellen was de wondgenezing echter hoger dan bij transplantatie van embryonale fibroblasten. Dit uitte zich in een versnelling van de faseveranderingen van het regeneratieve proces: de cellulaire infiltratietijden werden verminderd, de groeisnelheid van het vasculaire netwerk nam toe en de vorming van granulatieweefsel nam toe.

De resultaten van dynamische planimetrie geven aan dat de snelheid van spontane genezing van de brandwond (zonder gebruik van celtherapie) het laagst was. Op dag 15 en 30 na transplantatie van allogene fibroblastachtige mesenchymale stamcellen was de wondgenezingssnelheid hoger dan bij transplantatie van embryonale fibroblasten. Een histochemische methode voor het detecteren van bèta-galactosidase toonde aan dat na transplantatie van fibroblastachtige mesenchymale stamcellen en embryonale fibroblasten de getransplanteerde cellen gedurende de gehele observatieperiode levensvatbaar blijven aan het oppervlak en in de diepte van de regenererende wonden. De auteurs zijn van mening dat de hogere snelheid van brandwondregeneratie met het gebruik van fibroblastachtige mesenchymale stamcellen te danken is aan de afgifte van biologisch actieve groeistimulerende factoren door deze cellen tijdens het rijpingsproces.

Transplantatie van auto- of allogene keratinocyten en allogene fibroblasten voor de behandeling van brandwonden wordt ook in de klinische praktijk toegepast. Opgemerkt moet worden dat chirurgische behandeling van kinderen met uitgebreide diepe brandwonden een complexe taak is vanwege de hoge traumatische aard en de vele chirurgische ingrepen, het aanzienlijke bloedverlies en de verschillende reacties op de gebruikte infusiemedia. De grootste moeilijkheden bij het uitvoeren van huidplastische chirurgie voor uitgebreide diepe brandwonden, met een oppervlakte van meer dan 40% van het lichaamsoppervlak, zijn te wijten aan de ernst van de toestand van de slachtoffers en het gebrek aan donorhuid. Het gebruik van mesh-transplantaten met een hoge perforatiecoëfficiënt lost het probleem niet op, omdat de cellen die na perforatie worden gevormd, zeer langzaam epitheliseren en de huidflappen zelf vaak lyseren of uitdrogen. Dergelijke bedekkingen van brandwonden zoals xenoskin, allotransplantaties van lijken en synthetische filmbedekkingen zijn niet altijd effectief genoeg. Daarom worden er nieuwe methoden ontwikkeld om brandwonden te bedekken met lagen gekweekte keratinocyten en fibroblasten. In het bijzonder is een methode voorgesteld om brandwonden te bedekken met behulp van gekweekte allofibroblasten, die, wanneer getransplanteerd, een uitgesproken stimulerend effect hebben op de proliferatie van epidermocyten die bewaard blijven in de wond bij borderline brandwonden, evenals keratinocyten in de septa van mesh-transplantaten. Het werk van L. Budkevich en co-auteurs (2000) presenteert de resultaten van het gebruik van deze methode voor de behandeling van brandwonden bij kinderen. De studie omvatte 31 kinderen met thermisch trauma in de leeftijd van 1 tot 14 jaar. Bij drie kinderen was het totale oppervlak van brandwonden van graad IIIA-B-IV 40%, bij 25 - 50-70%, bij nog eens drie - 71-85% van het lichaamsoppervlak. Vroege chirurgische necrectomie werd gecombineerd met transplantatie van gekweekte allofibroblasten en autodermoplastiek. De eerste fase van de behandeling omvatte excisie van necrotisch weefsel, de tweede fase omvatte transplantatie van gekweekte allofibroblasten op dragerfilms, en de derde fase (48 uur na transplantatie van gekweekte allofibroblasten) omvatte verwijdering van de matrix en autodermoplastiek met huidflappen met een perforatieverhouding van 1:4. Drie patiënten die in de kliniek werden opgenomen met ernstige brandwonden, kregen gekweekte allofibroblasten getransplanteerd op granulerende wonden. Transplantatie van gekweekte allofibroblasten werd eenmaal uitgevoerd bij 18 kinderen, tweemaal bij 11 kinderen en driemaal bij twee patiënten. Het met celkweek bedekte wondoppervlak varieerde van 30 tot 3500 cm2. De effectiviteit van gekweekte allofibroblasten werd beoordeeld aan de hand van het totale percentage huidtransplantaat-implantatie, de genezingstijden van brandwonden en het aantal sterfgevallen door ernstig thermisch trauma. Transplantatie van het transplantaat was compleet bij 86% van de patiënten. Gedeeltelijke non-transplantatie van huidtransplantaten werd opgemerkt in 14% van de gevallen. Ondanks de behandeling overleden zes (19,3%) kinderen. De totale huidbeschadiging bij hen varieerde van 40 tot 70% van het lichaamsoppervlak.Transplantatie van gekweekte allofibroblasten werd bij geen enkele patiënt geassocieerd met mortaliteit als gevolg van brandwonden.

Bij analyse van de behandelresultaten merken de auteurs op dat voorheen diepe thermische huidbeschadiging die 35-40% van het lichaamsoppervlak beslaat, als onverenigbaar met het leven werd beschouwd (voor jongere kinderen - tot 3 jaar oud - zijn diepe brandwonden die 30% van het lichaamsoppervlak beslaan kritiek, voor oudere kinderen - meer dan 40% van het lichaamsoppervlak). Bij chirurgische necrectomie met transplantatie van gekweekte allofibroblasten en daaropvolgende autodermoplastiek met huidflappen met een hoge perforatiecoëfficiënt blijven IIIB-IV-graads brandwonden kritiek, maar momenteel zijn er in veel gevallen vooruitzichten om zelfs van dergelijke slachtoffers het leven te redden. Chirurgische necrectomie in combinatie met transplantatie van gekweekte allofibroblasten en autodermoplastiek bij kinderen met diepe brandwonden is vooral effectief gebleken bij patiënten met wijdverspreide huidletsels met een tekort aan donorplaatsen. Actieve chirurgische technieken en transplantatie van gekweekte allofibroblasten dragen bij aan een snelle stabilisatie van de algemene toestand van dergelijke patiënten, een afname van het aantal infectieuze complicaties van brandwonden, het creëren van gunstige omstandigheden voor de inplanting van transplantaten, een verkorting van de hersteltijd van verloren huid en de duur van klinische behandeling, en een afname van de frequentie van fatale afloop bij slachtoffers met uitgebreide brandwonden. Transplantatie van gekweekte allofibroblasten gevolgd door autodermoplastiek met huidflappen maakt herstel mogelijk bij kinderen met ernstige brandwonden, die voorheen als kansloos werden beschouwd.

Het is algemeen aanvaard dat het primaire doel van de behandeling van brandwonden is om de beschadigde huid zo volledig en snel mogelijk te herstellen en zo toxische effecten, infectieuze complicaties en uitdroging te voorkomen. De resultaten van het gebruik van gekweekte cellen hangen grotendeels af van de mate waarin de brandwond zelf gereed is voor transplantatie. Bij transplantatie van gekweekte keratinocyten op het wondoppervlak na chirurgische necrectomie, transplanteert gemiddeld 55% (oppervlakte) van de getransplanteerde cellen, terwijl dit percentage bij granulerende wonden afneemt tot 15%. Een succesvolle behandeling van uitgebreide diepe huidbrandwonden vereist daarom allereerst actieve chirurgische tactieken. Bij brandwonden van graad IIIB-IV wordt het brandoppervlak onmiddellijk ontdaan van necrotisch weefsel om intoxicatie te verminderen en het aantal complicaties van brandwonden te verminderen. Het gebruik van dergelijke tactieken is de sleutel tot het verkorten van de tijd tussen het oplopen van een brandwond en het sluiten van de wonden, evenals de opnameduur van patiënten met uitgebreide brandwonden in het ziekenhuis, en vermindert ook aanzienlijk het aantal sterfgevallen.

De eerste berichten over succesvol gebruik van gekweekte keratinocyten voor het bedekken van brandwonden verschenen begin jaren tachtig. Vervolgens werd deze manipulatie uitgevoerd met behulp van lagen gekweekte keratinocyten, meestal verkregen uit autocellen, veel minder vaak uit allokeratinocyten. De technologie van autokeratinocytoplastie laat echter niet toe om een cellenbank aan te leggen, terwijl de tijd die nodig is om een keratinocytentransplantaat van voldoende oppervlakte te produceren lang is en 3-4 weken bedraagt. Gedurende deze periode neemt het risico op het ontwikkelen van infectieuze en andere complicaties van brandwonden sterk toe, wat de totale ziekenhuisopname van patiënten aanzienlijk verlengt. Bovendien wortelen autokeratinocyten vrijwel niet wanneer ze getransplanteerd worden op granulerende brandwonden, en de hoge kosten van speciale groeimedia en biologisch actieve stimulatoren van de keratinocytengroei beperken hun klinische toepassing aanzienlijk. Andere biotechnologische methoden, zoals collageenplastiek, transplantatie van cryoconserveerde xenohuid en het gebruik van diverse biopolymeercoatings, verhogen de effectiviteit van de behandeling van uitgebreide oppervlakkige, maar niet diepe brandwonden. De methode om het wondoppervlak te bedekken met gekweekte fibroblasten verschilt fundamenteel doordat fibroblasten, in plaats van keratinocyten, als hoofdbestanddeel van de gekweekte cellaag worden gebruikt.

Voorwaarde voor de ontwikkeling van de methode waren de gegevens dat pericyten rond kleine bloedvaten progenitor-mesenchymcellen zijn die in staat zijn te transformeren tot fibroblasten die veel groeifactoren produceren en wondgenezing bevorderen dankzij een sterk stimulerend effect op de proliferatie en adhesie van keratinocyten. Het gebruik van gekweekte fibroblasten om wondoppervlakken te sluiten, bracht direct een aantal significante voordelen van deze methode aan het licht ten opzichte van het gebruik van gekweekte keratinocyten. Met name het verkrijgen van fibroblasten in kweek vereist geen gebruik van speciale voedingsmedia en groeistimulanten, wat de kosten van de transplantatie met meer dan een factor 10 verlaagt ten opzichte van de kosten van het verkrijgen van keratinocyten. Fibroblasten worden gemakkelijk gepassiveerd, waarbij ze gedeeltelijk hun oppervlaktehistocompatibiliteitsantigenen verliezen, wat op zijn beurt de mogelijkheid opent om allogene cellen te gebruiken voor de vervaardiging van transplantaten en het aanleggen van hun banken. De tijd die nodig is om transplantaten te verkrijgen die klaar zijn voor gebruik in een kliniek, is teruggebracht van 3 weken (voor keratinocyten) tot 1-2 dagen (voor fibroblasten). Een primaire fibroblastkweek kan worden verkregen door cellen te kweken uit huidfragmenten die tijdens autodermoplastiek zijn genomen, en de celdichtheid voor het verkrijgen van humane fibroblastsubculturen bedraagt slechts 20 x 103 ^per 1 ^cm².

Om het effect van fibroblasten en hun regulerende eiwitten op de proliferatie en differentiatie van keratinocyten te bestuderen, werd een vergelijkende analyse uitgevoerd van de morfologie en proliferatie van keratinocyten op substraten van collageentype I en III, evenals fibronectine in een gewrichtskweek met humane fibroblasten. Humane keratinocyten werden geïsoleerd uit huidfragmenten van patiënten met brandwonden, afgenomen tijdens autodermoplastiek. De seedingdichtheid van de keratinocyten was 50 x 103 cellen per 1 cm². De klinische werkzaamheid van gekweekte fibroblasttransplantatie werd beoordeeld bij 517 patiënten. Alle patiënten werden verdeeld in twee groepen: Groep 1 - volwassen slachtoffers met brandwonden van graad IIA, B - IV; Groep 2 - kinderen met diepe brandwonden van graad IIIB - IV. Evaluatie van de dynamiek van de structurele en functionele organisatie van monolaag-fibroblastculturen, rekening houdend met de rol van glycosaminoglycanen, fibronectine en collageen in de regeneratieprocessen, stelde de auteurs in staat om de derde dag te bepalen als de meest gunstige periode voor het gebruik van fibroblastculturen voor transplantaten. Een studie naar het effect van fibroblasten op de proliferatie en differentiatie van keratinocyten toonde aan dat in vitro fibroblasten een uitgesproken stimulerend effect hebben, voornamelijk op de processen van keratinocytadhesie, door het aantal aangehechte cellen en de snelheid van hun fixatie met meer dan een factor twee te verhogen. Stimulatie van adhesieprocessen gaat gepaard met een toename van de intensiteit van DNA-synthese en de proliferatie van keratinocyten. Bovendien bleek dat de aanwezigheid van fibroblasten en de daardoor gevormde extracellulaire matrix een noodzakelijke voorwaarde is voor de vorming van het tonofibrillaire apparaat van keratinocyten, intercellulaire verbindingen en uiteindelijk voor de differentiatie van keratinocyten en de vorming van het basaalmembraan. Bij de behandeling van kinderen met diepe brandwonden is een hoge klinische efficiëntie van transplantatie van allofibroblastkweek vastgesteld, met name bij patiënten met uitgebreide huidlaesies bij een donorsitedeficiëntie. Een uitgebreide morfofunctionele studie heeft aangetoond dat transplantaatfibroblasten worden gekenmerkt door actieve synthese van DNA, collageen, fibronectine en glycosaminoglycanen, die deel uitmaken van de extracellulaire matrix die door cellen wordt gevormd. De auteurs wijzen op een hoog percentage engraftment van getransplanteerde fibroblasten (tot 96%), een sterke verkorting van de tijd tot ontvangst (binnen 24-48 uur in plaats van 2-3 weken in het geval van keratinocyten), een significante versnelling van de epithelisatie van het brandwondoppervlak, evenals een significante kostenverlaging (met een factor 10) van de technologie voor het kweken van een transplantaat uit fibroblasten in vergelijking met keratinocytentransplantatie. Door het gebruik van transplantatie van gekweekte allofibroblasten is het mogelijk om het leven van kinderen met ernstige brandwonden te redden - thermische schade aan meer dan 50% van het lichaamsoppervlak,wat voorheen als onverenigbaar met het leven werd beschouwd. Opgemerkt moet worden dat met de transplantatie van allogene embryonale fibroblasten niet alleen een snellere wondregeneratie en herstel van patiënten met verschillende gradaties en gebieden van brandwonden, maar ook een significante vermindering van hun sterfte, overtuigend is aangetoond.

Autologe fibroblasten worden ook gebruikt in een complex gebied van plastische chirurgie, zoals de reconstructieve correctie van stembandletsels. Rundercollageen wordt hiervoor meestal gebruikt, waarvan de werkingsduur beperkt is door de immunogeniciteit. Omdat rundercollageen een lichaamsvreemd eiwit is, is het gevoelig voor de collagenase van de ontvanger en kan het immuunreacties veroorzaken. Om het risico hierop te verminderen, zijn technologieën ontwikkeld voor het verkrijgen van collageenpreparaten die vernet zijn met glutaraldehyde. Hun voordeel ligt in een grotere stabiliteit en lagere immunogeniciteit, wat praktische toepassing heeft gevonden bij het elimineren van defecten en atrofie van de stembanden. Injecties met autoloog collageen werden voor het eerst gebruikt in 1995. Deze techniek garandeerde het behoud van de primaire structuur van autologe collageenvezels, inclusief intramoleculaire enzymatisch gekatalyseerde vernettingen. Natuurlijke collageenvezels zijn namelijk beter bestand tegen afbraak door proteasen dan gereconstitueerd collageen, waarin de telopeptiden geknipt zijn. De integriteit van telopeptiden is belangrijk voor de quaternaire structuur van collageenvezels en de vorming van dwarsverbindingen tussen aangrenzende collageenmoleculen. In tegenstelling tot preparaten van rundercollageen veroorzaakt autoloog collageen geen immuunreacties bij de ontvanger, maar is het niet effectief genoeg als herstellend middel. Een stabiele correctie kan worden bereikt door lokale collageenproductie door transplantatie van autologe fibroblasten. Tijdens het klinisch onderzoek naar de effectiviteit van autologe fibroblasttransplantatie werden echter bepaalde moeilijkheden vastgesteld. In de eerste periode na fibroblasttransplantatie was het klinische effect zwakker in vergelijking met dat na de introductie van rundercollageen. Bij het kweken van autologe fibroblasten kan de mogelijkheid van transformatie van normale fibroblasten tot pathologische fibroblasten, de zogenaamde myofibroblasten, niet worden uitgesloten. Deze fibrose en littekenvorming, zoals blijkt uit de contractie van de collageengel veroorzaakt door de specifieke interactie tussen fibroblasten en collageenfibrillen. Bovendien verliezen fibroblasten na seriele passage in vitro het vermogen om extracellulaire matrixproteïnen te synthetiseren.

Er is echter nu experimenteel een methode ontwikkeld voor het kweken van autologe humane fibroblasten die de bovengenoemde tekortkomingen elimineert en niet resulteert in oncogene transformatie van normale fibroblasten. Autologe fibroblasten die met deze methode zijn verkregen, worden gebruikt om defecten in zachte gezichtsweefsels te herstellen. In een studie van G. Keller et al. (2000) werden 20 patiënten van 37 tot 61 jaar met rimpels en atrofische littekens behandeld. Huidbiopsieën (4 mm) van de retro-auriculaire regio werden in steriele reageerbuisjes met 10 ml kweekmedium (Eagle's medium met antibioticum, mycosepticum, pyruvaat en foetaal kalfsserum) naar het laboratorium getransporteerd. Het materiaal werd in 3-5 kweekschalen met een diameter van 60 mm geplaatst en geïncubeerd in een thermostaat met een atmosfeer die 5% CO2 bevatte. Na 1 week werden de cellen door trypsinisatie uit de schalen verwijderd en in 25 cm2 flesjes geplaatst. De cellen werden bij patiënten geïnjecteerd in een hoeveelheid van 4 x 107. Een significant en aanhoudend klinisch effect werd waargenomen bij patiënten tijdens de correctie van nasolabiale plooien, evenals bij patiënten met littekens 7 en 12 maanden na de derde transplantatie van autologe fibroblasten. Volgens flowcytometrie produceerden de gekweekte fibroblasten een grote hoeveelheid collageen type I. In-vitro-onderzoeken hebben een normale contractiliteit van de geïnjecteerde fibroblasten aangetoond. Twee maanden na de subcutane toediening van gekweekte fibroblasten in een dosis van 4 x 107 cellen werden geen tumoren gedetecteerd bij naakte muizen. De geïnjecteerde fibroblasten veroorzaakten geen littekenvorming of diffuse fibrose bij patiënten. Volgens de auteur zijn de geënte autologe fibroblasten in staat om constant collageen te produceren, wat een cosmetisch verjongingseffect zal hebben. Tegelijkertijd zijn fibroblasten die van een jonge patiënt zijn genomen effectiever dan die van oudere mensen, omdat de levensduur van gedifferentieerde cellen beperkt is. In de toekomst wordt aangenomen dat het mogelijk zal zijn om een kweek van fibroblasten, afkomstig van een jonge donor, te cryopreserveren om later zijn eigen jonge cellen te transplanteren naar een oudere patiënt. Concluderend is de conclusie dat autologe fibroblasten, mits functioneel bewaard, een ideaal middel zijn om defecten van de zachte weefsels van het gezicht te corrigeren, niet geheel correct. Tegelijkertijd merkt de auteur zelf op dat er tijdens het onderzoek enkele problematische situaties ontstonden met betrekking tot het gebruik van het autologe fibroblast-collageensysteem. Het klinische effect was vaak zwakker dan bij gebruik van rundercollageen, wat tot teleurstelling bij de patiënten leidde.

Over het algemeen lijken de literatuurgegevens over de vooruitzichten voor het klinisch gebruik van mesenchymale stamcellen vrij optimistisch. Er worden pogingen gedaan om autologe multipotente mesenchymale stamcellen uit het beenmerg te gebruiken voor de behandeling van degeneratieve gewrichtsletsels. De eerste klinische studies naar het gebruik van gekweekte mesenchymale stamcellen bij de behandeling van complexe botfracturen worden uitgevoerd. Auto- en allogene mesenchymale stromacellen uit het beenmerg worden gebruikt om kraakbeenweefsel te creëren voor transplantatie ter correctie van gewrichtskraakbeendefecten als gevolg van trauma of auto-immuunletsels. Er worden methoden ontwikkeld voor het klinisch gebruik van multipotente mesenchymale stamcellen om botdefecten te elimineren bij kinderen met een ernstige vorm van incomplete osteogenese, veroorzaakt door mutaties in het gen voor collageen type I. Na myeloablatie krijgen ontvangende kinderen een transplantatie met beenmerg van HLA-compatibele gezonde donoren, omdat ongefractioneerd beenmerg voldoende mesenchymale stamcellen kan bevatten om een ernstig botdefect te compenseren. Na transplantatie van allogeen beenmerg vertonen deze kinderen positieve histologische veranderingen in trabeculaire botten, een toename van de groeisnelheid en een afname van de incidentie van botfracturen. In sommige gevallen wordt een positief klinisch resultaat bereikt door transplantatie van nauw verwant allogeen beenmerg en osteoblasten. MSC-transplantatie wordt ook gebruikt om aangeboren botfragiliteit te behandelen die wordt veroorzaakt door een disbalans tussen osteoblasten en osteoclasten in botweefsel. In dit geval wordt herstel van de botvorming bereikt door chimerisatie van de pool van stam- en progenitorstromacellen in het botweefsel van patiënten.

De verbetering van methoden voor genetische modificatie van donormesenchymale stamcellen met het oog op correctie van genetische defecten in stromaweefsel wordt voortgezet. Er wordt aangenomen dat mesenchymale stamcellen in de nabije toekomst in de neurologie zullen worden gebruikt voor gerichte chimerisatie van hersencellen en het creëren van een gezonde celpool die in staat is om een deficiënt enzym of factor te genereren die verantwoordelijk is voor klinische manifestaties van de ziekte. Transplantatie van mesenchymale stamcellen kan worden gebruikt voor herstel van beenmergstroma bij kankerpatiënten na radio- en chemotherapie, en in combinatie met beenmergcellen voor herstel van hematopoëse. De ontwikkeling van substitutietherapie gericht op het elimineren van defecten in het bewegingsapparaat met behulp van MSC's wordt bevorderd door technische ontwikkelingen op het gebied van het ontwerpen van matrixbiomaterialen of biomimetica die raamwerken vormen die worden bevolkt door nakomelingen van mesenchymale stamcellen.

Bronnen van mesenchymale stamcellen

De belangrijkste bron van mesenchymale stamcellen is het beenmerg, waarvan de hematopoëtische stamcellen in het lichaam van zoogdieren constant differentiëren tot bloed- en immuunsysteemcellen, terwijl mesenchymale stamcellen worden vertegenwoordigd door een kleine populatie fibroblastachtige cellen in het beenmergstroma en bijdragen aan het behoud van de ongedifferentieerde toestand van hematopoëtische stamcellen. Onder bepaalde omstandigheden differentiëren mesenchymale stamcellen tot kraakbeen- en botweefselcellen. Wanneer mononucleaire stromacellen van het beenmerg worden gezaaid op een kweekmedium onder lage plantdichtheid, vormen ze kolonies van adhesieve cellen, die in feite fibroblastachtige multipotente mesenchymale voorlopercellen zijn. Sommige auteurs zijn van mening dat niet-gecommitteerde mesenchymale stamcellen zich in het beenmerg afzetten, die, dankzij hun vermogen tot zelfvernieuwing en hoge differentiatiepotentieel, alle weefsels van het lichaam voorzien van mesenchymale voorlopers van stroma-elementen gedurende het hele leven van het zoogdierorganisme.

In het beenmerg vormen stromale cellulaire elementen een netwerk dat de ruimte tussen de sinusoïden en het botweefsel vult. Het gehalte aan slapende MSC's in het beenmerg van een volwassene is vergelijkbaar met het aantal hematopoëtische stamcellen en bedraagt niet meer dan 0,01-0,001%. Mesenchymale stamcellen die uit beenmerg zijn geïsoleerd en niet zijn gekweekt, bevatten geen adhesiemoleculen. Dergelijke MSC's brengen geen CD34, ICAM, VCAM, collageentypes I en III, CD44 en CD29 tot expressie. Bijgevolg zijn het in vitro niet de mesenchymale stamcellen die zich op het kweeksubstraat fixeren, maar meer geavanceerde voorloperderivaten van mesenchymale stamcellen die al de componenten van het cytoskelet en het receptorapparaat van celadhesiemoleculen hebben gevormd. Stromacellen met het CD34-fenotype worden zelfs in perifeer bloed aangetroffen, hoewel er in het beenmerg aanzienlijk minder van zijn dan CD34-positieve mononucleaire cellen. CD34-cellen die uit het bloed zijn geïsoleerd en op kweek zijn gezet, hechten zich aan het substraat en vormen kolonies van fibroblastachtige cellen.

Het is bekend dat in de embryonale periode de stromale basis van alle organen en weefsels van zoogdieren en mensen ontstaat uit een gemeenschappelijke pool van mesenchymale stamcellen, vóór en tijdens de organogenese. Daarom wordt aangenomen dat in een volwassen organisme de meeste mesenchymale stamcellen zich in het bindweefsel en botweefsel bevinden. Vastgesteld is dat het grootste deel van de cellulaire elementen van het stroma van los bindweefsel en botweefsel wordt vertegenwoordigd door toegewijde voorlopercellen, die echter het vermogen behouden om in vitro te prolifereren en klonen te vormen. Wanneer dergelijke cellen in de bloedbaan worden geïntroduceerd, wordt meer dan 20% van de mesenchymale voorlopercellen geïmplanteerd tussen de stromale elementen van het hematopoëtische weefsel en de parenchymateuze organen.

Een potentiële bron van mesenchymale stamcellen is vetweefsel. Onder de stamcellen zijn in wisselende mate adipocytprecursoren geïdentificeerd. De minst volwassen voorlopercellen van vetweefsel zijn stroma-vasculaire cellen, die, net als multipotente mesenchymale precursorcellen van het beenmerg, onder invloed van glucocorticoïden, insulineachtige groeifactor en insuline kunnen differentiëren tot adipocyten. In kweek differentiëren stroma-vasculaire cellen tot adipocyten en chondrocyten, en in beenmergvetweefsel bevinden zich cellen die adipocyten en osteoblasten vormen.

Stromale stamcellen zijn ook in spieren aangetroffen. In de primaire celcultuur, geïsoleerd uit menselijke skeletspieren, worden stervormige cellen en meerkernige myotubes gedetecteerd. In aanwezigheid van paardenserum prolifereren stervormige cellen in vitro zonder tekenen van cytodifferentiatie, en na toevoeging van dexamethason aan het voedingsmedium wordt hun differentiatie gekenmerkt door de aanwezigheid van cellulaire elementen met het fenotype van skelet- en gladde spiercellen, bot, kraakbeen en vetweefsel. Daarom zijn er zowel gecommitteerde als ongecommitteerde multipotente mesenchymale voorlopercellen aanwezig in menselijk spierweefsel. Het is aangetoond dat de populatie van voorlopercellen in skeletspieren afkomstig is van ongecommitteerde multipotente mesenchymale voorlopercellen van het beenmerg en verschilt van myogene satellietcellen.

Adhesieve stervormige cellen die overeenkomen met multipotente mesenchymale voorlopercellen in differentiatiepotentieel, werden ook aangetroffen in het myocard van pasgeboren ratten. Onder invloed van dexamethason differentiëren ze tot adipocyten, osteoblasten, chondrocyten, gladde spiercellen, skeletspiermyotubes en cardiomyocyten. Er werd aangetoond dat vasculaire gladde spiercellen (pericyten) derivaten zijn van ongedifferentieerde perivasculaire multipotente mesenchymale voorlopercellen. In kweek brengen perivasculaire mesenchymale stamcellen gladde spier-α-actine en bloedplaatjes-afgeleide groeifactorreceptor tot expressie en zijn ze in staat om ten minste te differentiëren tot gladde spiercellen.

Een bijzondere plaats, vanuit het oogpunt van stamreserves, wordt ingenomen door kraakbeenweefsel. Het extreem lage herstelpotentieel hiervan wordt vermoedelijk veroorzaakt door een tekort aan multipotente mesenchymale stamcellen of differentiatie- en groeifactoren. Aangenomen wordt dat multipotente mesenchymale stamcellen, die zich al bezighouden met chondro- en osteogenese, vanuit andere weefselbronnen het kraakbeenweefsel binnendringen.

De weefseloorsprong en de voorwaarden waaronder mesenchymale voorlopercellen zich in pezen bevinden, zijn eveneens nog niet vastgesteld. Experimentele waarnemingen wijzen erop dat konijnenachillespeescellen in primaire culturen en bij de eerste passage in de vroege postnatale periode de expressie van type I collageen en decorine behouden, maar bij verdere kweek de differentiatiemarkers van tenocyten verliezen.

Opgemerkt moet worden dat het antwoord op de vraag of multipotente mesenchymale voorlopercellen die in verschillende weefsels gelokaliseerd zijn, daadwerkelijk permanent aanwezig zijn in hun stroma, of dat de weefselpool van mesenchymale stamcellen wordt aangevuld door de migratie van stromale stamcellen uit het beenmerg, nog niet is ontvangen.

Naast beenmerg en andere mesenchymale weefselzones van een volwassen organisme kan navelstrengbloed een andere bron van MSC's zijn. Het is aangetoond dat navelstrengbloed cellen bevat met vergelijkbare morfologische en antigene eigenschappen als multipotente mesenchymale voorlopercellen, die in staat zijn tot adhesie en niet onderdoen voor multipotente mesenchymale voorlopercellen van beenmergoorsprong wat betreft differentiatiepotentieel. In culturen van mesenchymale stamcellen van navelstrengbloed werd 5 tot 10% niet-gecommitteerde multipotente mesenchymale voorlopercellen aangetroffen. Het bleek dat hun aantal in navelstrengbloed omgekeerd evenredig is met de zwangerschapsduur, wat indirect wijst op de migratie van multipotente mesenchymale voorlopercellen naar verschillende weefsels tijdens de ontwikkeling van de foetus. De eerste informatie is verschenen over het klinische gebruik van mesenchymale stamcellen geïsoleerd uit navelstrengbloed en van stamcellen verkregen uit embryonaal biomateriaal. Deze informatie is gebaseerd op het bekende vermogen van foetale stamcellen om te integreren, zich te implanteren en te functioneren in de organen en weefselsystemen van volwassen ontvangers.

Zoektocht naar nieuwe bronnen van mesenchymale stamcellen

Het gebruik van mesenchymale stamcellen van embryonale oorsprong, evenals andere foetale cellen, brengt een aantal ethische, juridische, juridische en wetgevende problemen met zich mee. Daarom wordt de zoektocht naar extra-embryonaal donorcelmateriaal voortgezet. Een poging tot klinisch gebruik van humane huidfibroblasten was niet succesvol, wat niet alleen werd bepaald door de hoge financiële draagkracht van de technologie, maar ook door de snelle differentiatie van fibroblasten tot fibrocyten, die een significant lager proliferatiepotentieel hebben en een beperkt aantal groeifactoren produceren. Verdere vooruitgang in de studie van de biologie van MSC's en multipotente mesenchymale voorlopercellen van het beenmerg stelde ons in staat een strategie te ontwikkelen voor het klinisch gebruik van autologe mesenchymale stamcellen. De technologie van hun isolatie, kweek, ex vivo reproductie en gerichte differentiatie vereiste allereerst de bestudering van het spectrum van moleculaire markers van MSC's. Hun analyse toonde aan dat primaire culturen van humaan botweefsel verschillende soorten multipotente mesenchymale voorlopercellen bevatten. Het proosteoblastfenotype werd gedetecteerd in cellen die de marker van stromale voorlopercellen STRO-1 tot expressie brachten, maar niet de osteoblastmarker alkalische fosfatase droegen. Dergelijke cellen worden gekenmerkt door een laag vermogen om gemineraliseerde botmatrix te vormen, evenals de afwezigheid van expressie van osteopontine en parathyroïdhormoonreceptoren. Derivaten van STRO-1-positieve cellen die geen alkalische fosfatase tot expressie brengen, worden vertegenwoordigd door intermediair en volledig gedifferentieerde osteoblasten. Er werd gevonden dat cellulaire elementen van gekloonde lijnen van STRO-1-positieve humane trabeculaire botcellen in staat zijn om te differentiëren tot volwassen osteocyten en adipocyten. De richting van differentiatie van deze cellen hangt af van het effect van meervoudig onverzadigde vetzuren, pro-inflammatoire cytokines - IL-1b en tumornecrosefactor a (TNF-a), evenals anti-inflammatoire en immunosuppressieve TGF-b.

Later werd ontdekt dat multipotente mesenchymale voorlopercellen een specifiek fenotype missen dat alleen inherent is aan hen, maar een complex van markers tot expressie brengen die kenmerkend zijn voor mesenchymale, endotheel-, epitheel- en spiercellen bij afwezigheid van expressie van immunofenotypische antigenen van hematopoëtische cellen - CD45, CD34 en CD14. Bovendien produceren mesenchymale stamcellen constitutief en induceerbaar hematopoëtische en niet-hematopoëtische groeifactoren, interleukinen en chemokinen, en receptoren voor sommige cytokinen en groeifactoren worden tot expressie gebracht op multipotente mesenchymale voorlopercellen. Slapende, of rustende, cellen met een immunofenotype dat bijna identiek is aan het antigeenprofiel van met 5-fluorouracil onbehandelde multipotente mesenchymale voorlopercellen zijn gevonden tussen de cellen van de stromamatrix van het menselijk lichaam - beide cellen brengen CD117 tot expressie, wat "volwassen" stamcellen markeert.

Een celmarker die uniek is voor mesenchymale stamcellen is dus nog niet geïdentificeerd. Er wordt aangenomen dat rustende cellen een populatie van niet-gecommitteerde multipotente mesenchymale voorlopercellen vertegenwoordigen, aangezien ze geen markers tot expressie brengen van cellen die toegewijd zijn aan osteo- (Cbfa-1) of adipogenese (PPAR-y-2). Langdurige blootstelling van langzaam prolifererende rustende cellen aan foetaal runderserum leidt tot de vorming van terminaal differentiërende toegewijde voorlopercellen die worden gekenmerkt door snelle groei. De klonale expansie van dergelijke mesenchymale stamcellen wordt ondersteund door FGF2. Het lijkt erop dat het genoom van stromale stamcellen vrij strak "gesloten" is. Er zijn meldingen van de afwezigheid van spontane differentiatie in MSC's - zonder speciale voorwaarden voor commitment transformeren ze zelfs niet in cellen van de mesenchymale lijn.

Om de populatiestructuur van mesenchymale stamcelderivaten te bestuderen, wordt gezocht naar differentiatiemarkereiwitten op stromacellijnen en in primaire culturen. In-vitro-klonale analyse van kolonievormende cellen in het beenmerg heeft aangetoond dat EGF de gemiddelde koloniegrootte vergroot en de klonale expressie van alkalische fosfatase verlaagt wanneer het wordt toegepast op primaire culturen, terwijl de toevoeging van hydrocortison de expressie van alkalische fosfatase activeert, een marker voor de osteogene richting van MSC-differentiatie. Monoklonale antilichamen tegen STRO-1 maakten het mogelijk om de populatie van STRO-1-positieve adhesieve cellen te isoleren en te bestuderen in een heterogeen systeem van Dexter-culturen. Er is een spectrum van cytokinen bepaald die niet alleen de proliferatie en differentiatie van hematopoëtische en lymfoïde cellen reguleren, maar ook deelnemen aan de vorming en resorptie van skeletweefsels via para-, auto- en endocriene mechanismen. Receptor-gemedieerde afgifte van secundaire boodschappers zoals cAMP, diacylglycerol, inositoltrifosfaat en Ca2+ wordt ook gebruikt voor markeranalyse van verschillende categorieën stromaweefselcellen die de corresponderende receptoren tot expressie brengen. Het gebruik van monoklonale antilichamen als markers maakte het mogelijk om de aanwezigheid van reticulaire cellen in het stroma van lymfoïde organen in de T- en B-afhankelijke zones vast te stellen.

Gedurende enige tijd werd er wetenschappelijk gedebatteerd over de mogelijke oorsprong van MSC's uit een hematopoëtische stamcel. Wanneer beenmergcelsuspensies worden geëxplanteerd in monolaagculturen, groeien er inderdaad afzonderlijke kolonies fibroblasten in. Er werd echter aangetoond dat de aanwezigheid van voorlopers van fibroblastkolonies en verschillende uitlopers van hematopoëtische weefseldifferentiatie in het beenmerg geen bewijs is voor hun gemeenschappelijke oorsprong uit een hematopoëtische stamcel. Met behulp van discriminantanalyse van beenmergstamcellen werd vastgesteld dat de micro-omgeving tijdens heterotope beenmergtransplantatie niet wordt overgedragen door hematopoëtische cellen, wat het bestaan bewijst van een populatie MSC's in het beenmerg die histogenetisch onafhankelijk is van hematopoëtische cellen.

Bovendien maakte de selectieve kloonmethode het mogelijk om een nieuwe categorie stromale voorlopercellen te identificeren in monolaagculturen van beenmergcellen, hun aantal te bepalen en hun eigenschappen, proliferatieve en differentiërende potenties, te bestuderen. Het bleek dat stromale fibroblastachtige cellen in vitro prolifereren en diploïde kolonies vormen, die, wanneer ze terug in het lichaam worden getransplanteerd, zorgen voor de vorming van nieuwe hematopoëtische organen. De resultaten van het onderzoek van individuele klonen geven aan dat er onder de stromale voorlopercellen een populatie cellen bestaat die, door hun proliferatieve en differentiërende potentie, de rol van stamcellen van stromaweefsel kan opeisen, histogenetisch onafhankelijk van hematopoëtische stamcellen. De cellen van deze populatie worden gekenmerkt door zelfonderhoudende groei en differentiëren tot voorlopercelelementen van bot, kraakbeen en reticulair weefsel van het beenmerg.

Van groot belang zijn de resultaten van de studies van R. Chailakhyan en co-auteurs (1997-2001), die stroma-voorlopercellen uit beenmerg van konijnen, cavia's en muizen kweekten op het a-MEM voedingsmedium met toevoeging van foetaal kalfsserum. De auteurs voerden explantatie uit met een initiële dichtheid van 2-4 x 103 beenmergcellen per 1 cm². Homologe of heterologe, door straling geïnactiveerde beenmergcellen werden als feeder gebruikt in een dosis die het feedereffect behield, maar hun proliferatie volledig blokkeerde. Twee weken oude primaire, discrete kolonies fibroblasten werden getrypsiniseerd om monoklonale stammen te verkrijgen. Bewijs voor de klonale oorsprong van de kolonies werd verkregen met behulp van een chromosomale marker in gemengde beenmergculturen van mannelijke en vrouwelijke cavia's, time-lapse-fotografie van levende culturen en in gemengde culturen van syngenetisch beenmerg van CBA- en CBAT6T6-muizen. Transplantatie van een suspensie van vers geïsoleerde beenmergcellen of in vitro gekweekte stromafibroblasten onder de nierkapsel werd uitgevoerd in ivalon- of gelatineporeuze scaffolds, evenals in geïnactiveerde sponsachtige botmatrix van konijnen. Voor transplantatie van klonen in een botomhulsel werden de dijbenen van cavia's ontdaan van weke delen en periost, werden de epifysen bijgesneden en werd het beenmerg grondig uitgespoeld. Het bot werd in fragmenten (3-5 mm) gesneden, gedroogd en bestraald met een dosis van 60 Gy. Individuele fibroblastenkolonies werden in botomhulsels geplaatst en intramusculair geïmplanteerd. Voor intraperitoneale transplantatie van in vitro gekweekte stromafibroblasten werden diffusiekamers van type A (V=0,015 cm3, h=0,1 mm) en O (V=0,15 cm3, h=2 mm) gebruikt.

Bij het bestuderen van de groeidynamiek van klonale stammen ontdekten R. Chailakhyan et al. (2001) dat individuele cellen die fibroblastkolonies vormen, evenals hun nakomelingen, een enorm proliferatief potentieel hebben. Tegen de tiende passage bedroeg het aantal fibroblasten in sommige stammen 1,2-7,2 x 10 ⁹ cellen. Tijdens hun ontwikkeling voerden ze tot 31-34 celverdubbelingen uit. In dit geval resulteerde heterotope transplantatie van uit beenmerg afkomstige stammen, gevormd door stromaprecursoren van enkele tientallen klonen, in de overdracht van de beenmergmicro-omgeving en de vorming van een nieuw hematopoëtisch orgaan in de transplantatiezone. De auteurs stelden de vraag of individuele klonen in staat zijn de beenmergmicro-omgeving van stromacellen over te dragen, of dat hiervoor de samenwerking van verschillende klonogene stromaprecursoren vereist is. En als individuele klonen in staat zijn de micro-omgeving over te brengen, zal deze dan compleet zijn voor alle drie de hematopoëtische spruiten, of zorgen verschillende klonen voor de vorming van de micro-omgeving voor verschillende hematopoëtische spruiten? Om deze problemen op te lossen, werd een technologie ontwikkeld voor het kweken van stromale voorlopercellen op een collageengel, waardoor de gegroeide kolonies fibroblasten van het oppervlak konden worden verwijderd voor daaropvolgende heterotopische transplantatie. Individuele klonen van stromale fibroblasten, gekweekt uit beenmergcellen van CBA-muizen en cavia's, werden samen met een fragment van de gelcoating verwijderd en heterotopisch getransplanteerd - onder het nierkapsel van syngene muizen of in de buikspier van autologe cavia's. Na transplantatie in de spier werden de kolonies op de gel in botomhulsels geplaatst.

De auteurs ontdekten dat 50-90 dagen na transplantatie van beenmergfibroblastkolonies in 20% van de gevallen de ontwikkeling van bot of bot- en hematopoëtisch weefsel werd waargenomen in de transplantatiezone. Bij 5% van de ontvangende dieren bevatten de gevormde foci van botweefsel een holte gevuld met beenmerg. Binnen de botcilinders hadden dergelijke foci een ronde vorm en een kapsel opgebouwd uit botweefsel met osteocyten en een goed ontwikkelde osteoblastische laag. De beenmergholte bevatte reticulair weefsel met myeloïde en erytroïde cellen, waarvan de proportionele verhouding niet verschilde van die in normaal beenmerg. In de nier was het transplantaat een typisch beenmergorgaan gevormd tijdens transplantatie van natuurlijk beenmerg, waarbij het botkapsel de beenmergholte alleen vanaf de zijkant van het nierkapsel bedekte. Het hematopoëtische weefsel omvatte myeloïde, erytroïde en megakaryocytische elementen. Het stroma van de beenmergholte had een goed ontwikkeld sinussysteem en bevatte typische vetcellen. Tegelijkertijd werd botweefsel zonder tekenen van hematopoëse aangetroffen in de transplantatiezone van enkele kolonies onder het nierkapsel. De studie naar het proliferatieve en differentiërende potentieel van individuele klonen werd voortgezet met monoklonale beenmergstammen van konijnen, waarvan de cellen werden geresuspendeerd in een voedingsmedium en in een aparte ivalonspons met een massa van 1-2 mg werden getransplanteerd onder het nierkapsel van een konijn-beenmergdonor. Cellen van 21 monoklonale stammen werden aan een dergelijke autotransplantatie onderworpen. De resultaten werden na 2-3 maanden in overweging genomen. De auteurs stelden vast dat in 14% van de gevallen de getransplanteerde monoklonale stammen een beenmergorgaan vormden, bestaande uit botweefsel en een beenmergholte gevuld met hematopoëtische cellen. In 33% van de gevallen vormden de getransplanteerde stammen een compact bot van variërende grootte met osteocyten ingebed in de holtes en een ontwikkelde osteoblastische laag. In sommige gevallen ontwikkelde zich reticulair weefsel zonder bot of hematopoëtische elementen in de sponzen met getransplanteerde klonen. Soms werd reticulair stroma gevormd met een goed ontwikkeld netwerk van sinusoïden, maar niet bevolkt met hematopoëtische cellen. De verkregen resultaten waren dus vergelijkbaar met de gegevens verkregen tijdens kloontransplantatie op collageengel. Echter, als transplantatie van klonen gekweekt op een substraat resulteerde in de vorming van beenmergweefsel in 5% van de gevallen, botweefsel in 15% en reticulair weefsel in 80% van de gevallen, dan werd bij transplantatie van monoklonale stammen de vorming van beenmergelementen waargenomen in 14% van de gevallen, botweefsel in 53% en reticulair weefsel in 53% van de gevallen. Volgens de auteurs wijst dit erop dat de omstandigheden voor de implementatie van het proliferatieve en differentiërende potentieel van stromafibroblasten tijdens transplantatie op poreuze scaffolds optimaler waren dan tijdens transplantatie in botomhulsels en op een collageensubstraat.Het is mogelijk dat het gebruik van geavanceerdere methoden voor het kweken en terugplanten van klonen de omstandigheden voor de realisatie van hun differentiatiepotentieel door klonen kan verbeteren en deze verhoudingen kan veranderen. Hoe dan ook, de belangrijkste betekenis van de uitgevoerde studies is dat sommige klonen van stromacellen in staat zijn botweefsel te vormen en tegelijkertijd een stromale hematopoëtische micro-omgeving te bieden voor drie spruiten van beenmerghematopoëse: erytroïde, myeloïde en megakaryocytische, waardoor vrij grote platforms van hematopoëtisch weefsel en enige botmassa ontstaan.

De auteurs gingen vervolgens in op het vermogen van individuele klonogene stroma-voorlopercellen om dit soort celdifferentiatie te ondergaan in een gesloten systeem van diffusiekamers. Daarnaast was het noodzakelijk om te bepalen of individuele klonen polypotentie bezitten of dat de manifestatie van differentiatiepotentieel een coöperatieve interactie vereist van meerdere klonen met een vaste cytodifferentiatie-eigenschap, waarvan de verschillende verhoudingen de preferentiële vorming van bot-, reticulair of kraakbeenweefsel bepalen. Door twee methodologische benaderingen te combineren – het verkrijgen van monoklonale stammen van stroma-voorlopercellen uit het beenmerg en het transplanteren ervan in diffusiekamers – verkregen R. Chailakhyan en co-auteurs (2001) resultaten die hen in staat stelden de structurele organisatie van beenmergstroma beter te begrijpen. Transplantatie van monoklonale stammen van stromale voorlopercellen in O-type kamers resulteerde in de vorming van zowel bot- als kraakbeenweefsel, wat erop wijst dat de afstammelingen van één enkele stromale kolonievormende cel in staat zijn om gelijktijdig bot- en kraakbeenweefsel te vormen. De aanname dat bot- en kraakbeenweefsel afkomstig zijn van een gemeenschappelijke stromale voorlopercel is herhaaldelijk geopperd. Deze hypothese werd echter niet experimenteel bevestigd. De vorming van bot en kraakbeen in diffusiekamers was het noodzakelijke bewijs voor het bestaan van een gemeenschappelijke voorlopercel voor deze twee soorten weefsel onder de stromale stamcellen in het beenmerg.

Vervolgens werden 29 klonale stammen van de tweede-derde passages, verkregen uit primaire culturen van konijnenbeenmerg, in diffusiekamers geplaatst en intraperitoneaal geïmplanteerd in homologe dieren. De studies toonden aan dat 45% van de monoklonale beenmergstammen osteogeen potentieel bezitten. Negen kamers bevatten uitsluitend reticulair weefsel, maar het was samen met bot- en kraakbeenweefsel aanwezig in 13 andere kamers, die 76% van alle stammen vormden. In type O-kamers, waar differentiatie van zowel bot- als kraakbeenweefsel mogelijk was, werden 16 stammen bestudeerd. In vier kamers (25%) werd zowel bot- als kraakbeenweefsel gevormd. Nogmaals moet worden opgemerkt dat in de studies van R. Chailakhyan et al. (2001) individuele progenitorcellen 31 tot 34 verdubbelingen ondergingen binnen een celstam, en hun nakomelingen 0,9-2,0 x 10 ⁹ cellen omvatten. Het aantal mitoses dat voorlopercellen van polyklonale stammen ondergingen, was vrijwel identiek aan dat van monoklonale stammen. De ontwikkelingssnelheid van polyklonale stammen, met name in de eerste fase van hun vorming, hing in belangrijke mate af van het aantal kolonies dat werd gebruikt om de stammen te initiëren. Diploïde stammen van humane embryonale fibroblasten (WI-38) vormden, bij herklonering op het 12e-15e verdubbelingsniveau, ook kolonies die verschilden in diameter en celinhoud. Grote kolonies met meer dan 103 cellen vormden slechts 5-10%. Met een toename van het aantal delingen nam het percentage grote kolonies af. Mono- en polyklonale stammen van beenmergstromafibroblasten behielden een diploïde set chromosomen na 20 of meer verdubbelingen, en hun ontwikkelingsneiging was vergelijkbaar met de ontwikkelingsdynamiek van diploïde stammen van embryonale fibroblasten. Analyse van het differentiatiepotentieel van individuele stroma-voorlopercellen in het beenmerg, uitgevoerd door transplantatie van monoklonale stammen in diffusiekamers, toonde aan dat de helft ervan osteogeen was. Grote kolonies maakten 10% van hun totale aantal uit. Het aantal osteogene kolonievormende cellen kwam dus overeen met ongeveer 5% van hun totale populatie. De totale massa osteogene voorlopercellen die door de auteurs werd geïdentificeerd, omvatte cellen die gelijktijdig bot- en kraakbeenweefsel kunnen vormen. Bovendien werd voor het eerst vastgesteld dat deze twee soorten weefsel in een volwassen organisme een gemeenschappelijke voorlopercel hebben: 25% van de geteste klonen werd door dergelijke cellen gecreëerd en hun aandeel in de totale populatie voorlopercellen bedroeg ten minste 2,5%.

Heterotope transplantatie van individuele klonen van beenmergfibroblasten heeft dus nieuwe aspecten onthuld van de structurele organisatie van de populatie mesenchymale voorlopercellen. Er zijn stromale voorlopercellen gevonden die in staat zijn een specifieke micro-omgeving voor alle hematopoëtische spruiten tegelijk over te brengen. Het aantal hiervan onder de grote klonen die in verschillende modellen zijn bestudeerd, varieert van 5 tot 15% (0,5-1,5% van het totale aantal gedetecteerde voorlopercellen). Naast klonen die de volledige beenmergmicro-omgeving overbrengen, zijn er voorlopercellen die alleen osteogenese vertonen. Deze cellen vormen botweefsel dat de ontwikkeling van hematopoëse niet ondersteunt wanneer ze in een open systeem worden overgebracht. Hun aandeel in het totale aantal voorlopercellen bedraagt 1,5-3%. Sommige van deze cellen zijn in staat botweefsel te vormen met een beperkte periode van zelfonderhoud. Bijgevolg is de populatie stromale voorlopercellen heterogeen in zijn differentiatiepotentieel. Onder hen bevindt zich een categorie cellen die beweren stromale stamcellen te zijn, die in staat zijn om te differentiëren in alle drie de richtingen die kenmerkend zijn voor stromaweefsel in het beenmerg, en zo bot, kraakbeen en reticulair weefsel te vormen. De gepresenteerde gegevens geven ons hoop dat het met behulp van verschillende celmarkers mogelijk zal zijn om de bijdrage van elk type stromacel te bepalen aan de organisatie van een specifieke micro-omgeving en de ondersteuning van hematopoëse in Dexter-culturen.

Kenmerken van mesenchymale stamcellen

In de afgelopen jaren is vastgesteld dat in stationaire beenmergculturen multipotente mesenchymale voorlopercellen worden vertegenwoordigd door een beperkte populatie kleine agranulaire cellen (RS-1-cellen) die worden gekenmerkt door een laag kolonievormend vermogen en de afwezigheid van expressie van het Ki-67-antigeen dat specifiek is voor prolifererende cellen. De antigene parameters van slapende RS-1-cellen verschillen van het spectrum van antigenen van snel prolifererende gecommitteerde stromale voorlopercellen. Er is vastgesteld dat een hoge proliferatiesnelheid van gecommitteerde voorlopercellen alleen wordt waargenomen in de aanwezigheid van RS-1-cellen. RS-1-cellen verhogen op hun beurt hun groeisnelheid onder invloed van factoren die worden uitgescheiden door de meest volwassen derivaten van multipotente mesenchymale voorlopercellen. Het lijkt erop dat RS-1-cellen een subklasse zijn van ongecommitteerde MSC's die in staat zijn tot recycling. In vitro worden 5-fluorouracil-resistente beenmergstromavoorlopercellen gekenmerkt door een laag RNA-gehalte en een hoge expressie van het ornithinedecarboxylase-gen, een merker voor niet-prolifererende cellen.

Intensieve proliferatie van stromaprogenitorcellen begint na hun fixatie op het substraat. In dit geval wordt het markerprofiel van slecht gedifferentieerde cellen tot expressie gebracht: SH2 (TGF-(3)-receptor), SH3 (signaaleiwitdomein), collageen type I en III, fibronectine, adhesiereceptoren VCAM-1 (CD106) en ICAM (CD54), cadherine-11, CD44, CD71 (transferrinereceptor), CD90, CD120a en CD124, maar zonder de expressie van karakteristieke markers van hematopoëtische stamcellen (CD34, CD14, CD45). Klonale groei maakt herhaaldelijke passage van mesenchymale stamcellen mogelijk, met de vorming van talrijke genetisch homogene pluripotente stromaprogenitorcellen in kweek. Na 2-3 passages bereikt hun aantal 50-300 miljoen. In een kweek met voldoende dichtheid differentiëren stromale progenitorcellen, in tegenstelling tot hematopoëtische weefselfibroblasten, na het stoppen van de proliferatie tot adipocyten, myocyten, kraakbeen- en botcellen. Een combinatie van drie regulerende differentiatiesignalen, waaronder 1-methylisobutylxanthine (een inductor van intracellulaire cAMP-vorming), dexamethason (een remmer van fosfolipase A en C) en indomethacine (een remmer van cyclo-oxygenase, die ook de activiteit van tromboxaansynthase vermindert), zet tot 95% van de mesenchymale progenitorcellen om in adipocyten. De vorming van adipocyten uit onrijpe stromale elementen wordt bevestigd door de expressie van het gen voor lipoproteïnelipase, histochemische detectie van apolipoproteïnen en peroxisomale receptoren. Cellen van dezelfde kloon vormen onder invloed van TGF-β in een serumvrij medium een homogene populatie chondrocyten. De meerlagige celkweek van dit kraakbeenweefsel wordt gekenmerkt door een ontwikkelde intercellulaire matrix bestaande uit proteoglycaan en collageen type II. In een voedingsmedium met 10% fosfaat leidt het effect van een differentiatiesignaalcomplex bestaande uit β-glycerofosfaat (een anorganische fosfaatdonor), ascorbinezuur en dexamethason in dezelfde kweek van stromaprogenitorcellen tot de vorming van cellulaire aggregaten. In dergelijke cellen wordt een progressieve toename van de activiteit van alkalische fosfatase en osteopontinespiegels waargenomen, wat wijst op de vorming van botweefsel, waarvan de mineralisatie van de cellen wordt bevestigd door een progressieve toename van het intracellulaire calciumgehalte.

Volgens sommige gegevens gaat het vermogen van mesenchymale stamcellen tot onbeperkte deling en reproductie van verschillende celtypen van de mesenchymale differentiatielijn gepaard met een hoge mate van plasticiteit. Wanneer ze in de ventrikels of witte stof van de hersenen worden geïntroduceerd, migreren mesenchymale stamcellen naar het parenchym van het zenuwweefsel en differentiëren ze tot derivaten van de gliale of neuronale cellijn. Daarnaast is er informatie over de transdifferentiatie van MSC's tot hematopoëtische stamcellen, zowel in vitro als in vivo. Een meer diepgaande analyse in sommige studies heeft een uitzonderlijk hoge plasticiteit van MSC's aangetoond, wat zich uit in hun vermogen om te differentiëren tot astrocyten, oligodendrocyten, neuronen, cardiomyocyten, gladde spiercellen en skeletspiercellen. Een aantal onderzoeken naar het transdifferentiatiepotentieel van MSC's in vitro en in vivo hebben aangetoond dat multipotente mesenchymale voorlopercellen van beenmergoorsprong terminaal differentiëren tot cellijnen die bot-, kraakbeen-, spier-, zenuw- en vetweefsel vormen, evenals pezen en stroma die hematopoëse ondersteunen.

Andere studies konden echter geen tekenen van beperking van de pluripotentie van het mesenchymale stamcelgenoom en de progenitorpopulaties van stromacellen aantonen, hoewel meer dan 200 klonen van MSC's geïsoleerd uit één primaire kweek werden bestudeerd om mogelijke pluripotentie van stromacellen te testen. De overgrote meerderheid van de klonen in vitro behield het vermogen om te differentiëren in osteogene, chondrogene en adipogene richtingen. Wanneer de waarschijnlijkheid van migratie van ontvangende cellen door transplantatie van mesenchymale stamcellen onder de nierkapsel of in diffusiekamers werd uitgesloten, bleek dat stromale progenitorcellen in situ een heterogeen fenotype behouden, wat duidt op ofwel de afwezigheid van restrictiefactoren in de transplantatiezone ofwel de afwezigheid van MSC-pluripotentie als zodanig. Tegelijkertijd wordt het bestaan van een zeldzaam type somatische pluripotente stamcellen, die gemeenschappelijke voorlopers zijn van alle adulte stamcellen, toegestaan.

De multipotentie, maar niet de pluripotentie, van echte mesenchymale stamcellen, die een zeer klein deel van de beenmergcellen vormen en onder bepaalde omstandigheden tijdens in vitro-kweek kunnen prolifereren zonder te differentiëren, blijkt uit hun geïnduceerde binding aan bot-, kraakbeen-, vet- en spierweefselcellen, evenals aan tenocyten en stroma-elementen die hematopoëse ondersteunen. Langdurige blootstelling aan een kweekmedium met foetaal kalfsserum veroorzaakt doorgaans de afgifte van MSC's aan toegewijde stroma-stamcellen, waarvan de nakomelingen spontaan terminale differentiatie ondergaan. In vitro is het mogelijk om gerichte osteoblastvorming te bereiken door dexamethason, ß-glycerofosfaat en ascorbinezuur toe te voegen aan het conditioneringsmedium, terwijl een combinatie van dexamethason- en insulinedifferentiatiesignalen de vorming van adipocyten induceert.

Het is vastgesteld dat beenmerg-MSC's, voordat ze de terminale differentiatiefase ingaan, onder bepaalde kweekomstandigheden aanvankelijk differentiëren tot fibroblastachtige mesenchymale stamcellen. Derivaten van deze cellen nemen in vivo deel aan de vorming van botten, kraakbeen, pezen, vet- en spierweefsel, evenals het stroma dat hematopoëse ondersteunt. Veel auteurs begrijpen de term "multipotente mesenchymale voorlopercellen" als zowel MSC's zelf als toegewijde stromale voorlopercellen van beenmerg en mesenchymale weefsels. Klonale analyse van multipotente mesenchymale voorlopercellen van beenmergoorsprong toonde aan dat iets meer dan een derde van alle klonen differentieert tot osteo-, chondro- en adipocyten, terwijl de cellen van de resterende klonen alleen osteogeen potentieel hebben en alleen chondro- en osteocyten vormen. Een kloon van multipotente mesenchymale voorlopercellen zoals BMC-9 differentieert, onder geschikte micro-omgevingsomstandigheden, tot cellen met het fenotype en de functionele kenmerken van niet alleen osteoblasten, chondrocyten en adipocyten, maar ook van stromacellen die hematopoëse ondersteunen. Een kloon van RCJ3.1-cellen, geïsoleerd uit rattenfoetaal beenmerg, differentieert tot mesenchymale cellen met verschillende fenotypen. Onder de gecombineerde werking van ascorbinezuur, β-glycerofosfaat en dexamethason vormen de cellulaire elementen van deze kloon eerst multinucleaire myocyten en vervolgens, achtereenvolgens, adipocyten, chondrocyten en eilandjes van gemineraliseerd botweefsel. De populatie van granulaire cellen uit het periost van rattenfoetussen komt overeen met niet-gecommitteerde multipotente mesenchymale voorlopercellen. Deze populatie wordt namelijk gekenmerkt door een lage proliferatiesnelheid, vertoont geen differentiatiemarkers en differentieert onder kweekomstandigheden tot chondro-, osteo- en adipocyten, evenals gladde spiercellen.

Daarom moet worden erkend dat de vraag naar de pluri- of multipotentie van het genoom van mesenchymale stamcellen nog steeds een open vraag is, wat dienovereenkomstig ook gevolgen heeft voor de ideeën over het differentiatiepotentieel van stromale voorlopercellen, dat eveneens niet definitief is vastgesteld.

Een experimenteel bewezen en belangrijk kenmerk van mesenchymale stamcellen is hun vermogen om de weefselniche te verlaten en in de bloedbaan te circuleren. Om het genetische differentiatieprogramma te activeren, moeten dergelijke circulerende stamcellen de juiste micro-omgeving binnendringen. Het is aangetoond dat bij systematische introductie van MSC's in de bloedbaan van ontvangende dieren, onrijpe cellen worden geïmplanteerd in verschillende organen en weefsels, waar ze differentiëren tot bloedcellen, myocyten, adipocyten, chondrocyten en fibroblasten. Dientengevolge vinden er in lokale weefselzones signaalregulerende interacties plaats tussen niet-gecommitteerde en gecommitteerde stromale voorlopercellen, alsook tussen deze cellen en de omliggende rijpe cellen. Aangenomen wordt dat differentiatie wordt geïnduceerd door paracriene regulerende factoren van mesenchymale en niet-mesenchymale oorsprong (groeifactoren, eicosanoïden, extracellulaire matrixmoleculen), die zorgen voor ruimtelijke en temporele verbindingen in de micro-omgeving van multipotente mesenchymale voorlopercellen. Lokale schade aan mesenchymaal weefsel zou daarom moeten leiden tot de vorming van zones in de micro-omgeving van multipotente mesenchymale voorlopercellen die kwalitatief verschillen van het complex van regulerende signalen van intacte weefsels, waarin fysiologische in plaats van herstellende regeneratieprocessen plaatsvinden. Dit verschil is uiterst belangrijk voor de specialisatie van het cellulaire fenotype in de normale en door schade veroorzaakte micro-omgeving.

Volgens de concepten zijn hier de mechanismen ingebed die het fundamentele verschil vormen tussen de twee bekende processen – fysiologische regeneratie en inflammatoire proliferatie. De eerste eindigt met het herstel van de gespecialiseerde cellulaire samenstelling van het weefsel en zijn functie, terwijl het resultaat van de implementatie van het proliferatieproces de vorming van volwassen bindweefselelementen en het functieverlies van de beschadigde weefselzone is. Om optimale programma's te ontwikkelen voor het gebruik van multipotente mesenchymale voorlopercellen in de regeneratief-plastische geneeskunde, is daarom een grondige studie van de kenmerken van de impact van micro-omgevingsfactoren op de differentiatie van MSC's noodzakelijk.

De afhankelijkheid van de structuur van het stamcelcompartiment van cellulaire para- en autocriene regulatoren, waarvan de expressie wordt gemoduleerd door externe signalen, staat buiten kijf. Van de functies van regulerende factoren zijn de belangrijkste de controle van de asymmetrische deling van MSC's en de expressie van genen die de stadia van commitment en het aantal celdelingen bepalen. Externe signalen, waarvan de verdere ontwikkeling van MSC's afhankelijk is, worden geleverd door hun micro-omgeving. In een onvolwassen toestand prolifereren MSC's langdurig, terwijl ze het vermogen behouden om te differentiëren tot lijnen van adipocyten, myofibroblasten, hematogene weefselstroma, kraakbeen- en botcellen. Er is vastgesteld dat een beperkte populatie CD34-negatieve stroma-cellulaire elementen die in het bloed circuleren, vanuit de algemene bloedbaan terugkeert naar het beenmergstroma, waar het wordt getransformeerd tot lijnen van CD34-positieve hematopoëtische stamcellen. Deze observaties suggereren dat recirculatie van mesenchymale stamcellen in de bloedbaan de weefselbalans van stromale stamcellen in verschillende organen in stand houdt door een gemeenschappelijke pool van onrijpe stromale elementen in het beenmerg te mobiliseren. Differentiatie van MSC's tot cellen met meerdere mesenchymale fenotypes en hun deelname aan de regeneratie of het herstel van bot, kraakbeen, vetweefsel en pezen in vivo is bewezen met behulp van adoptieve transfermodellen bij proefdieren. Volgens andere auteurs wordt verre migratie van MSC's langs het vaatbed gecombineerd met korte-afstands- of lokale verplaatsing van multipotente mesenchymale stamcellen binnen het weefsel tijdens kraakbeenherstel, spierregeneratie en andere herstelprocessen.

Lokale stamreserves van de stromaweefselbasis fungeren als bron van cellen in de processen van fysiologische weefselregeneratie en worden aangevuld door transport van MSC's naar andere weefsels, naarmate de stamreserves van het stromaweefsel worden verbruikt. Wanneer echter noodmobilisatie van het herstellende cellulaire potentieel noodzakelijk is, bijvoorbeeld bij polytrauma, neemt het volledige echelon MSC's deel aan de processen van herstellende regeneratie en worden mesenchymale stamcellen van het beenmerg via de algemene bloedstroom naar de periferie gerekruteerd.

Mesenchymale stamceltransplantatie

Er kunnen bepaalde parallellen worden getrokken tussen de processen van fysiologische weefselregeneratie en hun vorming tijdens de intra-uteriene ontwikkeling. Tijdens de embryogenese bij mens en zoogdier vindt de vorming van verschillende soorten gespecialiseerde cellen plaats vanuit de ecto-, meso- en endodermale pool van kiembladen, maar met de verplichte deelname van het mesenchym. Het losse cellulaire netwerk van embryonaal mesenchymaal weefsel vervult talrijke regulerende, metabolische, raamwerk- en morfogenetische functies. De aanleg van voorlopige organen vindt pas plaats na de condensatie van het mesenchym door de klonogene groei van voorlopercellen, die de primaire morfogenetische signalen van de organogenese genereren. Stromale derivaten van het embryonale mesenchym vormen het cellulaire raamwerk van voorlopige organen en vormen de basis voor hun toekomstige energie-plastische voorziening door de groei van primaire bloed- en lymfevaten. Met andere woorden, de stromale elementen van de microcirculatie-eenheid van foetale organen ontstaan vóór de vorming van hun structurele en functionele eenheden. Bovendien zorgt actieve migratie van mesenchymale cellen tijdens de organogenese voor ruimtelijke oriëntatie van zich ontwikkelende organen door hun volumegrenzen te markeren via restrictie van homeotische Hox-typen. Het stromale raamwerk dient ook als basis voor de assemblage van structurele en functionele eenheden van parenchymateuze organen, die vaak morfogenetisch en functioneel volledig verschillende cellen omvatten. Bijgevolg zijn tijdens de embryogenese de functies van het mesenchym primair en worden deze gerealiseerd door het genereren van regulerende signalen die regionale proliferatie en differentiatie van epitheelcellen van voorlopercellen activeren. Embryonale mesenchymcellen produceren groeifactoren zoals HGF-β, HGF-β en CSF, waarvoor parenchymale voorlopercellen overeenkomstige receptoren hebben. In gedifferentieerd volwassen weefsel van een volwassen organisme genereert het stromale netwerk van cellen ook signalen om de levensvatbaarheid en proliferatie van voorlopercellen van niet-mesenchymale oorsprong te handhaven. Het spectrum van stromale regulerende signalen in postnatale ontogenese is echter verschillend (SCF, HGF, IL-6, IL-1, IL-8, IL-11, IL-12, IL-14, IL-15, GM-CSF, flt-3, LIF, enz.) en is gericht op het verzekeren van fysiologische regeneratie of herstel van beschadigde weefselzones. Bovendien zijn de spectrale karakteristieken van stromale regulerende factoren in elk type weefsel en zelfs binnen één orgaan verschillend. In het bijzonder komen hematopoëse en lymfopoëse met de proliferatie en differentiatie van hematopoëtische en immunocompetente cellen alleen voor in bepaalde organen, binnen de grenzen waarvan de stromale micro-omgeving opereert, die omstandigheden biedt voor de rijping van hematopoëtische en lymfoïde cellen. Het vermogen van hematopoëtische en lymfoïde cellen om een bepaald orgaan te herbevolken, te prolifereren en te rijpen in zijn microstructurele niches hangt af van de regulerende factoren van de micro-omgeving.

Tot de componenten van de extracellulaire matrix die multipotente mesenchymale voorlopercellen produceren, behoren fibronectine, laminine, collageen en proteoglycanen, evenals CD44 (hyaluronan- en osteopontinereceptor). Deze spelen een belangrijke rol bij het organiseren van intercellulaire interacties en de vorming van de extracellulaire matrix in het beenmerg en botweefsel. Het is bewezen dat multipotente mesenchymale voorlopercellen in het beenmerg een stroma-micro-omgeving creëren die niet alleen inductieve en regulerende signalen levert aan MSC's, maar ook aan hematopoëtische voorlopercellen en andere niet-mesenchymale stamcellen in het beenmerg. Het is bekend dat de deelname van MSC's aan hematopoëse wordt bepaald door hun vermogen om te differentiëren tot stromacellen die hematopoëse ondersteunen, en dit instructieve signaal wordt door MSC's rechtstreeks ontvangen van hematopoëtische stamcellen. Daarom fungeert het netwerk van stromaprogenitorcellen in de cultuur als voedingsbasis voor de ontwikkeling van alle klonen van hematopoëtische cellen.

In een volwassen organisme bevindt de intensiteit van hemo- en lymfopoëse zich in een toestand van dynamisch evenwicht met de "uitgave" van volwassen bloedcellen en immuunsysteemcellen in de periferie. Omdat stromacellen van het beenmerg en lymfoïde organen uiterst zelden worden vernieuwd, vindt er geen significante herstructurering van stromastructuren plaats. Het systeem kan uit dynamisch evenwicht worden gebracht door mechanische schade aan een van de organen van hemo- of lymfopoëse, wat leidt tot uniforme opeenvolgende veranderingen die niet alleen en niet zozeer de hematopoëtische of lymfoïde elementen betreffen, maar eerder de stromastructuren van het beschadigde orgaan. Tijdens het proces van herstellende regeneratie wordt eerst de stromabasis gevormd, die vervolgens wordt herbevolkt door hematopoëtische of immunocompetente cellen. Dit al lang bekende feit maakt posttraumatische regeneratie een geschikt model voor het bestuderen van de stroma-micro-omgeving van hematopoëtische organen. In het bijzonder wordt mechanische lediging van de medullaire holte van buisvormige botten gebruikt om herstellende regeneratie van beenmerg te bestuderen - curettage, wat snelle en effectieve verwijdering van hematopoëtisch weefsel uit de toestand van dynamisch evenwicht mogelijk maakt. Bij het bestuderen van de processen van herstellende regeneratie van de hematopoëtische en stromale componenten van beenmerg na mechanische lediging van de medullaire holte van de tibia bij cavia's, werd gevonden dat er geen directe correlatie bestaat tussen de regeneratie-indices van hematopoëtische en stromale cellen (het aantal hematopoëtische cellen, de concentratie en het aantal stromale progenitorcellen). Bovendien bleek dat een toename van de populatie stromale progenitorcellen eerder na curettage plaatsvindt en dat de stromale fibroblasten zelf fosfatase-positief worden, wat kenmerkend is voor osteogeen weefsel. Er is eveneens vastgesteld dat curettage van 3-5 buisvormige botten leidt tot groei van deze celpopulatie in het beenmerg van niet-geopereerde botten en zelfs in de milt, die bij cavia's een uitsluitend lymfopoëtisch orgaan is.

Het morfologische beeld van herstelprocessen in het beenmerg van gecureteerde tibiae van cavia's komt over het algemeen overeen met de in de literatuur beschreven gegevens, verkregen uit experimenten met dieren van andere diersoorten. De dynamiek van de veranderingen die optreden na verwijdering van hematopoëtisch weefsel is voor alle diersoorten gelijk en het verschil betreft alleen tijdsparameters. Morfologisch gezien bestaat de fasevolgorde van hematopoëseherstel in de geleegde medullaire holte uit opeenvolgende processen van bloedstolselorganisatie, vorming van grofvezelig botweefsel, resorptie ervan, ontwikkeling van sinusoïden en vorming van reticulair stroma, dat vervolgens wordt herbevolkt met hematopoëtische elementen. In dit geval neemt het aantal hematopoëtische stamcellen in het proces van beenmergweefselregeneratie parallel toe met de toename van het gehalte aan hematopoëtische stamcellen.

Yu. Gerasimov en co-auteurs (2001) vergeleken veranderingen in het aantal hematopoëtische cellen en het aantal stromale progenitorcellen in individuele fasen van het regeneratieproces. Het bleek dat kwantitatieve veranderingen in beenmergcellen in gecuretteerd bot overeenkomen met de dynamiek van de morfologische kenmerken van regeneratie. De auteurs associëren de afname van de celinhoud in het geregenereerde bot gedurende de eerste drie dagen met de dood van hematopoëtische cellen als gevolg van het ongunstige effect van de micro-omgeving gecreëerd door het prolifererende reticulaire weefsel in het bewaarde beenmerg in de epifyseregio, evenals met de vorming van osteoïde weefselfoci in laatstgenoemde en vasculaire schade tijdens curettage. Op de 7e-12e dag valt een toename van het aantal kernhoudende cellen samen met het verschijnen van individuele foci van myeloïde hematopoëse in de zones van proliferatie van stromale elementen. Op dag 20 verschijnen aanzienlijke gebieden met geregenereerd beenmerg en goed ontwikkelde sinussen, wat gepaard gaat met een significante toename van het totale aantal cellen. Het aantal hematopoëtische elementen bedraagt in deze periode echter 68% van het controleniveau. Dit komt overeen met eerder gepubliceerde gegevens waaruit blijkt dat het aantal hematopoëtische cellen na curettage pas op dag 35-40 na de operatie de norm bereikt.

In de vroege posttraumatische periode zijn lokale cellulaire elementen die tijdens curettage bewaard zijn gebleven de belangrijkste bron voor het herstel van hematopoëse. In latere stadia zijn stamcellen die vrije stromazones herbevolken de belangrijkste bron voor de regeneratie van hematopoëtisch beenmergweefsel. Wat betreft individuele categorieën stromacellen (endotheliaal, reticulair en osteogeen), blijven de bronnen die hun vorming tijdens de reorganisatie van de beenmergholte garanderen onduidelijk. De resultaten van de studie van Yu. V. Gerasimov en co-auteurs (2001) geven aan dat in het beenmerg dat na curettage bewaard is gebleven, de concentratie cellen die kolonies van fibroblasten vormen significant hoger is dan in normaal beenmerg. De auteurs zijn van mening dat curettage resulteert in een intensievere selectieve uitspoeling van hematopoëtische cellen in vergelijking met kolonievormende stromacellen, die deelnemen aan de vorming van het stroma en sterker geassocieerd zijn met de hoofdsubstantie ervan dan hematopoëtische cellen.

De dynamiek van de verandering in het aantal cellen dat fibroblastkolonies vormt, correleert met de intensiteit van osteogeneseprocessen, de daaropvolgende resorptie van bottrabeculae en de vorming van reticulair stroma, dat bevolkt wordt door hematopoëtische cellen. De meeste stromale progenitorcellen vormen in de gespecificeerde regeneratieperiode grof vezelig botweefsel en reticulair stroma. Bij femurfracturen onder langdurige osteosynthese nemen op de vijfde dag in de regeneratiezone de concentratie en het aantal cellen dat fibroblastkolonies vormt toe, en gedurende de periode van intensieve botvorming neemt hun aantal zes keer toe. Het is bekend dat beenmergcellen die fibroblastkolonies vormen osteogene eigenschappen hebben. Het aantal stromale progenitorcellen neemt toe vóór de vestiging van het gecureteerde beenmerggebied door hematopoëtische cellen. Dit komt goed overeen met de gegevens dat stromale cellen zorgen voor de vorming van een hematopoëtische micro-omgeving. Blijkbaar komt het ontstaan van een hematopoëtische micro-omgeving overeen met een bepaald niveau van regeneratie van stromaweefsel. Het aantal hematopoëtische cellen neemt toe naarmate het stromaplatform dat geschikt is voor hematopoëse, groter wordt.

Van het grootste belang zijn de gegevens van de auteurs die aantonen dat direct na curettage het aantal stroma-progenitorcellen in de afgelegen delen van het skelet toeneemt. Vanaf het zesde uur tot en met de twintigste dag wordt een meer dan verdubbeling waargenomen van zowel de concentratie als het aantal cellen dat fibroblastkolonies vormt in de contralaterale tibia. Het mechanisme van dit fenomeen houdt waarschijnlijk verband met het feit dat massale beenmergbeschadiging leidt tot de vorming van een groot aantal bloedstolsels met de gelijktijdige vernietiging van een aanzienlijk aantal bloedplaatjes en de afgifte van bloedplaatjes-afgeleide groeifactor (PDGF) in het bloed, waarvan bekend is dat het de proliferatie veroorzaakt van cellen die fibroblastkolonies vormen die zich in het lichaam buiten de proliferatieve pool bevinden. In experimenten met konijnen bevordert lokale toediening van MSC's het herstel van kraakbeenweefsel in het operatief beschadigde kniegewricht, wat geassocieerd kan worden met de vorming van chondrocyten afkomstig van de geïnjecteerde MSC's. De herstellende regeneratie van botdefecten bij laboratoriumratten wordt echter aanzienlijk verbeterd door het gebruik van mesenchymale stamcellen, omgeven door een keramisch frame. Daarom kan worden aangenomen dat, indien niet RBOC, een andere factor afkomstig van beschadigde stromacellen een stimulerend effect uitoefent op de proliferatie van mesenchymale stamcellen in intacte beenmergzones en hun migratie naar het gebied met het beenmergdefect stimuleert. Dit wordt echter tegengesproken door literatuurgegevens uit voorgaande jaren die erop wijzen dat stromacellen die verantwoordelijk zijn voor de micro-omgeving, in tegenstelling tot hematopoëtische cellen, niet in staat zijn tot migratie en afkomstig zijn van lokale bronnen.

Niettemin geven de resultaten van de studie van Yu. Gerasimov en co-auteurs (2001) aan dat mechanisch trauma niet alleen een scherpe herstructurering van het stromaweefsel in het gecureteerde bot veroorzaakt, maar ook significante veranderingen in het stroma in verre intacte botten, d.w.z. er is een systemische reactie van het stromaweefsel op lokaal trauma. Bovendien, wanneer polytrauma wordt toegebracht - meervoudige curettage - wordt deze reactie versterkt en wordt deze niet alleen waargenomen in het geopereerde bot en verre delen van het skelet, maar ook in de lymfoïde organen, met name in de milt. Het mechanisme van een dergelijke systemische reactie van het stromaweefsel van het beenmerg en de milt op lokaal trauma en polytrauma blijft onbekend. Er wordt aangenomen dat dit proces verband houdt met de werking van een humorale factor die wordt afgescheiden door het mesenchymale stroma van de medullaire holte van het beenmerg. De mogelijkheid dat stromacellen van het beenmerg en de milt een orgaan-niet-specifieke humorale factor produceren die verantwoordelijk is voor de proliferatie van cellen die fibroblastkolonies vormen, blijkt uit gegevens over hun koloniestimulerende activiteit in monolaagculturen van beenmerg.

In dit verband is het vermeldenswaard dat bij systemische toediening van multipotente mesenchymale stamcellen, hun derivaten niet alleen het beenmerg, maar ook andere weefsels repopuleren, wat met name wordt gebruikt voor gentherapie. Het is aangetoond dat bij intraveneuze toediening van grote hoeveelheden MSC's met een wildtype genoom aan muizen met een mutatie in het collageen I-gen, donorcellen tot 30% van de cellen in het bot- en kraakbeenweefsel van ontvangers vervangen, en dat getransfecteerde muizenmesenchymale stamcellen die humaan IL-3 afscheiden, de hematopoëse gedurende 9 maanden effectief ondersteunen bij gelijktijdige toediening met humane hematopoëtische stamcellen aan immunodeficiënte muizen.

[ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ]

Genetische modificatie van mesenchymale stamcellen

Onder de successen van experimentele genetische modificatie van MSC's is de transfectie van het factor IX-gen in humane MSC's, gevolgd door de overdracht van transfectantcellen aan immunodeficiënte muizen, vermeldenswaard. Dit leidt tot de aanwezigheid van antihemofiele factor B in het bloed gedurende 8 weken na transplantatie. In dit experiment werd posttranslationele modificatie van factor IX door α-glutamylcarboxylase uitgevoerd in de getransfecteerde cellen. Transductie van MSC's met een retrovirale vector die codeert voor humane factor IX was minder succesvol: toediening van deze cellen aan een hond met hemofilie B leverde slechts 12 dagen een therapeutisch niveau van factor IX op, met behoud van een normale intensiteit van de stollingshemostase.

Transplantatie van mesenchymale stamcellen in het hersenparenchym van dieren heeft aangetoond dat onrijpe donorcellen worden getransformeerd tot zowel neuronale als gliale populaties. Engraftatie van neuronale derivaten van gezond donormesenchymweefsel maakt het theoretisch mogelijk om genetische afwijkingen in het hersenmetabolisme te corrigeren bij patiënten met de ziekte van Gaucher en andere stoornissen in de lipiden-, gangliosiden- of koolhydraatstofwisseling.

De experimentele zoektocht naar omstandigheden voor transdifferentiatie van stromale stamcellen uit het beenmerg naar neuronale en leverweefselvoorlopercellen is nog gaande. De aandacht van de onderzoekers is gericht op combinaties van differentiatie-inductoren en speciaal geconditioneerde media. Om de primaire kweek van stromale cellen te isoleren, worden beenmergcellen, gewassen en geresuspendeerd in DMEM/F12 (1/1) kweekmedium met 10% foetaal kalfsserum, geënt met een dichtheid van 200.000 cellen/cm². Na 24 uur worden de niet-aanhechtende cellen verwijderd en worden de aan het plastic gehechte fibroblastachtige cellen een week lang gekweekt. Voor de differentiatie van beenmergstromacellen tot neuroblasten wordt een geconditioneerd medium gebruikt, verkregen door drie dagen kweken van de primaire kweek van muizenembryonale fibroblasten, evenals DMEM/F12-medium (1/1) met 2% foetaal kalfsserum en de toevoeging van 20 ng/ml NF of 10-6 M retinoïnezuur (neuro-inducerende stoffen die worden gebruikt voor neurale differentiatie van muizen- en humane embryonale stamcellen). Differentiatie van beenmergstromacellen tot hepatocytprecursorcellen wordt geïnduceerd in een geconditioneerd medium, verkregen door drie dagen kweken van de primaire kweek van muizenembryonale levercellen in DMEM/F12-medium (1/1) met de toevoeging van 10% foetaal kalfsserum.

Hier moet nogmaals worden opgemerkt dat de kolonievormende cellen van het beenmergstroma heteromorf zijn en in twee typen kunnen worden onderverdeeld. Het eerste type omvat fibroblastachtige cellen die filopodia vormen met grote kernen en één of twee nucleoli. Het tweede type wordt vertegenwoordigd door kleine spoelvormige cellen. Bij het kweken van cellen van beide typen in een geconditioneerd medium verkregen op een voedingslaag van primaire embryonale fibroblasten van muizen, verschijnen op de derde tot vierde dag cellen die lijken op neuroblasten in de kweek. In dit stadium hebben ze meestal een spoelvormige vorm met één of twee lange uitlopers die eindigen in filopodia. Minder gebruikelijk zijn piramidale of stervormige cellen met korte dendrieten. De dendrieten van sommige neuroblasten hebben karakteristieke uitlopers (groeiknoppen) en vertakkingen in hun distale deel, terwijl andere duidelijke groeikegels hebben met filopodia, waardoor de dendrieten groeien. Vergelijkbare morfologische kenmerken (knoppen en groeikegels met filopodia) die inherent zijn aan neuroblasten die differentiëren tot neuronen, zijn gedetailleerd beschreven in studies over neurogenese. Op basis hiervan concluderen sommige auteurs dat de cellen die ze in de kweek vonden neuroblasten zijn. In het bijzonder ontdekten E. Shchegelskaya en co-auteurs (2002) na het twee weken kweken van een primaire kweek van stromacellen in een geconditioneerd medium dat elke 3e tot 4e dag werd ververst, dat sommige cellen prolifereerden terwijl ze een ongedifferentieerde toestand handhaafden. Uiterlijk leken dergelijke cellen op fibroblasten en werden ze in de kweek aangetroffen samen met differentiërende neuroblasten. De meerderheid van de cellen (ongeveer 80%) bevond zich in verschillende stadia van differentiatie tot cellen van het zenuwweefsel, voornamelijk tot neuronen. De dendritische uitlopers van deze cellen stonden in nauw contact met elkaar, zodat de cellen geleidelijk secties van het zenuwnetwerk op het substraat vormden in de vorm van lange meercellige strengen. De dendritische uitlopers van neuroblasten werden significant langer, sommige overschreden de lengte van het neuronlichaam zelf met 8-10 keer. Het aandeel piramidale en stervormige cellen nam geleidelijk toe. De dendrieten van stervormige cellen vertakten zich. Volgens de auteurs komt de latere differentiatie van piramidale en stervormige cellen ten opzichte van spoelvormige cellen overeen met de volgorde van stadia van normale neurogenese bij dieren. De auteurs concluderen dat stromale stamcellen uit het beenmerg geïnduceerde neurogenese ondergaan, waarbij alle drie de hoofdtypen neuronen in vitro uit neuroblasten worden gevormd. Zenuwcelprecursoren werden ook gedetecteerd tijdens de kweek van stromale cellen uit het beenmerg gedurende 3-4 dagen in een medium met 2% foetaal serum en 20 ng/ml LIF. Maar in dit geval deelden de stamcellen zich zeer langzaam, neuroblastdifferentiatie vond slechts in 30% van de gevallen plaats en ze vormden geen neuronale netwerken. Door retinoïnezuur te gebruiken als een van de inductoren van de differentiatie van zenuwcellen, verkregen de auteurs tot 25-30% van de zenuwcellen in de kweek,met voornamelijk gliale elementen - astrocyten en oligodendrocyten. Neuronen vormden slechts een derde van alle zenuwcellen, hoewel ze vertegenwoordigd waren door alle drie de typen: spoelvormige, piramidale en stervormige cellen. Op de zesde dag van het kweken van stromacellen in een medium met retinoïnezuur, werden zenuwcellen meer gedifferentieerd en werden axonen gevonden in individuele piramidale neuronen, die bij normale neuroontogenese later verschijnen dan de vorming van dendritische uitlopers. Volgens de auteurs heeft de retinoïnezuurinductiemethode, ondanks de lage opbrengst aan zenuwcellen, zijn voordelen: oligodendrocyten en astrocyten vervullen myeliniserende en voedende functies tijdens de groei van dendrieten en axonen en zijn noodzakelijk voor de normale vorming van zenuwweefsel. Daarom is het voor het herstel van de beschadigde gebieden in vivo beter om een suspensie van neuronen verrijkt met gliacellen te gebruiken.

In de tweede reeks experimenten probeerden de auteurs de differentiatie van beenmergstromacellen tot levercellen te induceren. Na drie dagen kweken van beenmergstroma-stamcellen in een geconditioneerd medium, verkregen door incubatie van embryonale hepatocyten van muizen, werden grote, bolvormige cellen gevonden, vaak tweekernig, met cytoplasmatische insluitsels van verschillende groottes. Deze cellen bevonden zich in verschillende stadia van differentiatie en verschilden in grootte, aantal celkernen en insluitsels in het cytoplasma. Glycogeen werd in de meeste van deze cellen gedetecteerd, op basis waarvan de auteurs ze identificeerden als voorlopercellen van hepatocyten. Omdat er geen cellen werden gevonden die vergelijkbaar waren met neuroblasten in de kweek, werd geconcludeerd dat het geconditioneerde medium, verkregen door het kweken van embryonale hepatocyten, de differentiatiefactoren van zenuwcellen miste en daarentegen factoren bevatte die de differentiatie van beenmergstromacellen tot voorlopercellen van hepatocyten induceren. Concluderend suggereren de auteurs dat er sprake is van pluripotentie in stromacellen in het beenmerg, aangezien deze in vitro differentiëren tot zenuw- of leverweefselcellen, afhankelijk van de specifieke geconditioneerde media en inductoren die worden gebruikt.

Sommige studies hebben inderdaad correct de differentiatie van beenmergstromacellen tot cardiomyocyten, kraakbeen, bot- en zenuwweefselcellen aangetoond. Er zijn aanwijzingen dat er onder beenmergcellen populaties stamcellen zijn die zich kunnen differentiëren tot hepatocyten. In het licht van deze gegevens kunnen de resultaten van de bovenstaande experimenten met muizen nog steeds worden beschouwd als een verdere bevestiging van de aanwezigheid in het beenmerg van pluripotente mesenchymale stamcellen die zich kunnen differentiëren tot cellen van verschillende weefsels van een volwassen organisme.

Mesenchymale stamceltransplantatie

In de klinische transplantologie kunnen humane mesenchymale stamcellen worden gebruikt om de expansie van hematopoëtische stamcellen te garanderen, evenals hun vroege, precommitterende afstammelingen. Met name de introductie van autologe hematopoëtische stamcellen en MSC's bij kankerpatiënten na chemotherapie met hoge doseringen versnelt het herstel van het aantal neutrofielen en bloedplaatjes in het perifere bloed. Allo- en autologe transplantaties van mesenchymale stamcellen worden gebruikt voor de behandeling van multipel myeloom, aplastische anemie en spontane trombocytopenie – aandoeningen die gepaard gaan met een primair defect in het stroma van hematopoëtisch weefsel. De efficiëntie van celtherapie bij oncohematologische pathologie is in veel gevallen hoger bij gelijktijdige introductie van stromale en hematopoëtische stamcellen, wat zich manifesteert in een verkorting van de postoperatieve periode van hematopoëtische restauratie, een afname van het aantal fatale uitkomsten als gevolg van niet-selectieve vernietiging van regionale en circulerende kankercellen, waarbij de eigen hematopoëtische stamcellen van de patiënt ook afsterven. De vooruitzichten voor het gebruik van MSC's en andere multipotente mesenchymale stamcellen in de klinische praktijk zijn te danken aan het relatief gemak waarmee ze uit beenmergaspiraten kunnen worden verkregen, de uitbreiding in kweek en de transfectie van therapeutische genen. Tegelijkertijd kan lokale implantatie van multipotente mesenchymale stamcellen worden gebruikt om lokale weefseldefecten te compenseren, en in geval van systemische disfuncties van weefsels van mesenchymale oorsprong is hun introductie in de algemene bloedbaan niet uitgesloten.

De auteurs van werken waarin de vooruitzichten voor het gebruik van MSC's voor lokale, systemische transplantatie en gentherapie worden geanalyseerd vanuit het perspectief van stromacelbiologie, zijn voorzichtiger in hun redenering. Postnataal beenmerg wordt traditioneel beschouwd als een orgaan dat bestaat uit twee hoofdsystemen van duidelijk gedefinieerde cellijnen: het hematopoëtische weefsel zelf en het bijbehorende ondersteunende stroma. Daarom werden mesenchymale stamcellen uit het beenmerg aanvankelijk uitsluitend beschouwd als een bron van stroma als basis voor de productie van regulerende factoren van de hematopoëtische micro-omgeving. Vervolgens richtten onderzoekers zich op het bestuderen van de rol van MSC's als stamcelbron van skeletweefsels. De nieuwste gegevens wijzen op een onverwacht potentieel voor de differentiatie van beenmergstromacellen met de vorming van zenuw- of spierweefsel. Met andere woorden, mesenchymale stamcellen vertonen transgermale plasticiteit - het vermogen om te differentiëren tot celtypen die fenotypisch niet verwant zijn aan de cellen van het oorspronkelijke weefsel. Tegelijkertijd blijven sommige aspecten van de biologie van beenmergstromacellen onduidelijk en onopgelost, zowel in algemene biologische termen als in individuele details, waaronder de identificatie, aard, oorsprong, ontwikkeling en functie in vivo van beenmergstromacellen, evenals het toegestane differentiatiepotentieel ex vivo en de mogelijkheden voor therapeutisch gebruik in vivo. De verkregen gegevens over het potentieel van MSC's, evenals de resultaten van onderzoek naar het regeneratieve potentieel van andere stamcellen, staan in schril contrast met de dogma's die in de biologie zijn vastgesteld.

Bij kweek bij lage dichtheid vormen stromale stamcellen uit het beenmerg afzonderlijke kolonies, elk afkomstig van één enkele stamcel. Het percentage stromale stamcellen in kernhoudende beenmergcellen, bepaald door het kolonievormend vermogen, is sterk afhankelijk van zowel de kweekomstandigheden als de MSC-soort. Bij knaagdieren is bijvoorbeeld de aanwezigheid van bestraalde voedingscellen en serum in de kweek absoluut noodzakelijk om het maximale aantal stromale stamcellen te verkrijgen, terwijl bij mensen de kolonievormende efficiëntie van mesenchymale stamcellen onafhankelijk is van zowel de voedingscel als het kweekmedium. Het aantal bekende mitogene factoren dat de proliferatie van stromale stamcellen stimuleert, is beperkt. Deze omvatten PDGF, EGF, FGF, TGF-β en IGF-1. Onder optimale kweekomstandigheden kunnen polyklonale MSC-lijnen meer dan 50 celdelingen in vitro doorstaan, waardoor het mogelijk is om miljarden stromale stamcellen uit het beenmerg te verkrijgen uit 1 ml van het aspiraat.

De populatie stromacellen in het beenmerg is echter heterogeen, wat zich manifesteert in zowel variabiliteit in koloniegroottes, verschillende snelheden van hun vorming, en een verscheidenheid aan cellulaire morfologie, die het bereik bestrijkt van fibroblastachtige spoelvormige tot grote platte cellen. Tijdens de ontwikkeling van dergelijke culturen wordt ook na 20 dagen fenotypische heterogeniteit opgemerkt. Sommige kolonies worden gekenmerkt door een hoge expressie van alkalische fosfatase, andere helemaal niet, en kolonies van het derde type zijn fosfatase-positief in het centrale gebied en fosfatase-negatief in de periferie. Individuele kolonies vormen knobbeltjes botweefsel (het begin van matrixmineralisatie wordt gemarkeerd door kleuring met alizarinerood of voor calcium volgens Van Koss). In andere kolonies treedt vetophoping op, geïdentificeerd door G-kleuring met olierood. Minder vaak vormen kolonies van mesenchymale stamcellen kraakbeen gekleurd met alcianblauw.

Na ectopische transplantatie in proefdieren vormen polyklonale MGK-lijnen ectopisch bot met een reticulair stroma geassocieerd met myelopoëse en adipocyten, en, minder vaak, met kraakbeenweefsel. Bij transplantatie van monoklonale lijnen van beenmergstromacellen wordt in sommige gevallen chimerisme waargenomen, waarbij het de novo bot bestaat uit botweefselcellen, stroma en adipocyten van donoroorsprong bevat, terwijl de cellen van de hematopoëtische lijn en het vaatstelsel afkomstig zijn van de ontvanger.

De resultaten van deze studies bevestigen de stamcelkarakteristiek van de stroma-voorlopercel uit het beenmerg waaruit de klonale lijn is afgeleid. Ze geven ook aan dat niet alle cellen die in kweek klonogenetisch zijn, daadwerkelijk multipotente stamcellen zijn. Sommige onderzoekers zijn van mening, en wij delen hun mening, dat de meest betrouwbare informatie over het werkelijke differentiatiepotentieel van individuele klonen alleen in vivo na transplantatie kan worden verkregen, en niet door het fenotype van hun derivaten in vitro te bepalen. De expressie in kweek van fenotypische markers van osteo-, chondro- of adipogenese (bepaald met mRNA of histochemische technieken) en zelfs de productie van gemineraliseerde matrix weerspiegelen niet de mate van pluripotentie van een individuele kloon in vivo. Daarom is de identificatie van stamcellen in een groep stromacellen alleen a posteriori mogelijk, onder de geschikte omstandigheden van een biologische transplantatietest. Met name chondrogenese wordt zeer zelden waargenomen in open transplantatiesystemen, terwijl kraakbeenvorming verre van ongebruikelijk is in gesloten systemen zoals diffusiekamers of in-vitromicromassaculturen van stromacellen, waar lokaal een lage zuurstofspanning wordt bereikt, wat de vorming van kraakbeenweefsel bevordert. Daarom hebben zelfs de transplantatietechniek en niet-specifieke in-vitrokweekomstandigheden een aanzienlijke invloed op de differentiatie van MSC's.

Experimentele transplantatie onder gespecificeerde experimentele omstandigheden is de gouden standaard voor het bepalen van het differentiatiepotentieel van beenmergstromacellen en een sleutelelement in hun identificatie. Historisch gezien worden studies naar beenmergstromaceltransplantatie geassocieerd met de algemene problematiek van beenmergtransplantatie. Het is vastgesteld dat de hematopoëtische micro-omgeving wordt gecreëerd door transplantatie van beenmergstromacellijnen en zorgt voor ectope ontwikkeling van hematopoëtisch weefsel in de transplantatiezone. De oorsprong van de micro-omgeving van de donor en het hematopoëtische weefsel van de gastheer stelt ons in staat om ectopisch bot te beschouwen als een echte "omgekeerde" beenmergtransplantatie. Lokale transplantatie van beenmergstromacellen bevordert een effectieve correctie van botdefecten, meer uitgesproken dan bij spontane reparatieve regeneratie. Verschillende preklinische studies met experimentele modellen hebben overtuigend de mogelijkheid aangetoond van beenmergstromaceltransplantaties in de orthopedie, hoewel zeer zorgvuldig werk en analyse nodig zijn om deze methoden te optimaliseren, zelfs in de eenvoudigste gevallen. In het bijzonder zijn de optimale omstandigheden voor de expansie van osteogene stromacellen ex vivo nog niet vastgesteld. De structuur en samenstelling van de ideale drager, evenals het aantal cellen dat nodig is voor volumetrische botregeneratie, zijn nog niet ontwikkeld.

Naast het gebruik van ex vivo geëxpandeerde beenmergstromacellen voor de regeneratie van weefsels van mesenchymale oorsprong, opent de onorthodoxe plasticiteit van MSC's potentiële toepassingen voor de regeneratie van zenuwcellen of de afgifte van genproducten aan het centrale zenuwstelsel. In principe vereenvoudigt dit celtherapie voor schade aan het zenuwstelsel, aangezien er geen autologe humane zenuwstamcellen nodig zijn. Mogelijke toepassingen van beenmergcellen voor de generatie van cardiomyocyten en myogene voorlopercellen van zowel echte stromale als extrastromale oorsprong zijn gerapporteerd.

Er worden experimenten uitgevoerd met systemische transplantatie van beenmergstromacellen voor de behandeling van veelvoorkomende skeletaandoeningen. Het lijdt geen twijfel dat beenmergstromacellen de populatie zijn die verantwoordelijk is voor genetische aandoeningen bij skeletaandoeningen. Dit wordt goed geïllustreerd door de vectoroverdracht van genetische informatie met behulp van deze cellen, wat leidt tot de vorming van pathologisch botweefsel bij proefdieren. Het vermogen van stromacellen om zich te implanteren, te enten, te prolifereren en te differentiëren in skeletbotten na introductie in de algemene bloedbaan is echter nog niet bewezen.

Dit komt deels doordat bij standaard beenmergtransplantatie het stroma niet samen met het hematopoëtische weefsel wordt getransplanteerd, waardoor er nog geen strikte criteria zijn ontwikkeld voor het beoordelen van de succesvolle engraftment van systemisch toegediende stromacellen. Er moet rekening mee worden gehouden dat de aanwezigheid van markergenen in weefselextracten of de isolatie van cellen van donoroorsprong in kweek niet wijst op engraftment van de cellen, maar alleen op hun overleving. Zelfs intra-arteriële injectie van beenmergstromacellen in een muizenledematen kan leiden tot vrijwel geen engraftment, ondanks het feit dat cellen van donoroorsprong in grote aantallen worden aangetroffen in de microvasculatuur van het beenmerg. Helaas worden dergelijke cellen meestal als "geëngraft" beschreven, simpelweg op basis van de detectie van markergenen voor donorcellen in ex-vivo-kweek. Bovendien moet overtuigend bewijs worden geleverd voor de langetermijnintegratie van gedifferentieerde en functioneel actieve cellen van donoroorsprong in de bestudeerde weefsels. In veel gepubliceerde artikelen over de engraftment van beenmergstromacellen in het skelet is de afwezigheid van dergelijke duidelijke gegevens opvallend. Er dient echter opgemerkt te worden dat enkele correcte dierproeven wel degelijk een beperkte maar reële inplanting van stromaprogenitorcellen hebben aangetoond na systemische toediening.

Deze gegevens komen overeen met de resultaten van studies naar de mogelijkheid om myogene voorlopercellen uit het beenmerg via het vaatstelsel naar spieren te transporteren. Er mag echter niet worden vergeten dat zowel skelet- als spierweefsel tijdens de ontwikkeling en groei worden gevormd op basis van extravasculaire celbewegingen die gebruikmaken van migratieprocessen waarbij geen bloedcirculatie betrokken is. Als er een onafhankelijke circulatieroute bestaat voor de transport van voorlopercellen naar vastefaseweefsels, is het dan mogelijk om het bestaan van fysiologisch circulerende mesenchymale voorlopercellen aan te nemen? Wat is de oorsprong van deze cellen in zowel het zich ontwikkelende als het postnatale organisme, en hoe dringen ze de vaatwand binnen? De oplossing van deze vragen lijkt absoluut noodzakelijk en vereist de meest zorgvuldige preklinische analyse. Zelfs nadat antwoorden op deze vragen zijn gevonden, zullen problematische kinetische aspecten die verband houden met skeletgroei en bindweefselremodellering onopgelost blijven. Tegelijkertijd lijkt de behandeling van osteogenesestoornissen door de gehele populatie gemuteerde skeletvoorlopercellen te vervangen door gezonde stroma-elementen een reëel klinisch perspectief te bieden. In dit geval kunnen lokale fractuurzones of deformaties als gevolg van pathologische osteogenese, evenals destructieve veranderingen in botweefsel, worden gecorrigeerd met behulp van in vitro gekweekte stromale stamcellen. Daarom is het raadzaam om toekomstig onderzoek te richten op de problematiek rond transformatie of genetische correctie van autologe gemuteerde osteogene voorlopercellen ex vivo.

Genetische manipulatie van cellen, van korte duur of permanent, is de basis geworden van de cellulaire en moleculaire biologie en de bron van vele wetenschappelijke ontdekkingen over de rol van individuele eiwitten in het cellulaire metabolisme, zowel in vitro als in vivo. Het gebruik van moleculaire technologieën voor de correctie van erfelijke pathologie en menselijke ziekten is veelbelovend voor de praktische geneeskunde, aangezien de eigenschappen van beenmergstromacellen het mogelijk maken om unieke transplantatieschema's te ontwikkelen voor de correctie van genetische skeletaandoeningen. Tegelijkertijd kunnen mesenchymale voorlopercellen gemakkelijk worden verkregen van de toekomstige ontvanger, zijn ze vatbaar voor genetische manipulatie en kunnen ze zich in korte tijd in grote hoeveelheden vermenigvuldigen. Het gebruik van mesenchymale stamcellen maakt het mogelijk om de beperkingen en risico's te vermijden die gepaard gaan met de directe toediening van genetisch informatiemateriaal aan de patiënt via intravasculaire vectorconstructies. Een vergelijkbare strategie is toepasbaar op embryonale stamcellen, maar autologe postnatale beenmergstromacellen verdienen de voorkeur, omdat hun introductie mogelijke immunologische complicaties na de transplantatie uitsluit. Om een kortdurend effect te bereiken, bijvoorbeeld het versnellen van botregeneratie, is genetische modificatie van mesenchymale stamcellen met behulp van elektroporatie, chemische fusie, lipofectie, plasmiden en adenovirale constructen de meest optimale methode. Met name virale transfectie in beenmergstromacellen (BMP-2) is effectief gebleken in het versnellen van botregeneratie bij experimenteel polytrauma. Het creëren van adenovirale vectorconstructen verdient de voorkeur vanwege de afwezigheid van toxiciteit. Genetische modificatie van beenmergstromacellen wordt in dit geval echter gekenmerkt door een extreem lage stabiliteit. Bovendien vereisen normaal getransformeerde beenmergstromacellen het gebruik van vectoren met genetische informatie die 10 keer infectieuzer zijn dan andere celtypen, wat het percentage getransfecteerde cellen dat sterft aanzienlijk verhoogt.

De behandeling van recessieve ziekten veroorzaakt door een lage of geen biologische activiteit van bepaalde genen vereist langdurige of permanente modificatie van mesenchymale stamcellen, waarvoor adeno-geassocieerde virussen, retrovirussen, lentivirussen of adeno-retrovirale chimeren nodig zijn. De transportregio's van deze virussen zijn in staat grote DNA-transfecties (tot 8 kb) over te brengen. De wetenschappelijke literatuur heeft al melding gemaakt van de exogene biologische activiteit van beenmergstromacellen die getransfecteerd zijn met retrovirale constructen die coderen voor de synthese van regulerende en markermoleculen - IL-3, CD2, factor VIII, evenals enzymen die betrokken zijn bij de synthese van L-DOPA. Zelfs in deze studies wijzen de auteurs echter op een aantal beperkingen die moeten worden overwonnen voordat deze technologie in de praktijk kan worden toegepast. Het eerste probleem is het optimaliseren van het proces van MSC-modificatie ex vivo. Het is bekend dat langdurige (3-4 weken) proliferatie van beenmergstromacellen in vitro hun transfectie vermindert. Tegelijkertijd is het noodzakelijk om meerdere transfectiecycli uit te voeren om een hoog niveau van genetische modificatie van MSC's te bereiken. Het tweede probleem houdt verband met de duur van de therapeutische genexpressie, die nog niet langer dan vier maanden bedraagt. Een natuurlijke afname van de effectieve genexpressie is te wijten aan promotorinactivatie en de dood van gemodificeerde cellen. Gezien de algemene vooruitzichten van genetische informatieoverdracht met behulp van mesenchymale stamcellen, wijzen de resultaten van voorlopige studies op de noodzaak van verdere optimalisatie van ex-vivo-transfectiemethoden, de keuze van een geschikte promotor die de biologische activiteit in de gewenste richting reguleert, en een toename van het vermogen van gemodificeerde beenmergstromacellen om zichzelf in vivo te onderhouden na transplantatie. Opgemerkt moet worden dat het gebruik van retrovirale constructen voor het modificeren van beenmergstromacellen in de gewenste richting niet altijd hun verplichte inplanting vereist. Getransfecteerde mesenchymale stamcellen kunnen een corrigerende functie vervullen tegen de achtergrond van een stabiele residentie en zonder verplichte actieve fysieke incorporatie en functie in bindweefsel. In dit geval moeten ze worden beschouwd als een biologische minipomp die in vivo een factor produceert, waarvan het tekort de manifestatie van genetische pathologie bepaalt.

Het gebruik van getransformeerde beenmergstromacellen voor de behandeling van dominante genetische pathologie, die wordt gekenmerkt door de expressie van een gen met pathologische of abnormale biologische activiteit, is veel problematischer, omdat in dit geval de overdracht of implementatie van vervormde genetische informatie moet worden geblokkeerd. Een van de methoden voor genetische manipulatie is homologe recombinatie van embryonale stamcellen om transgene dieren te creëren. De extreem lage mate van homologe recombinatie in combinatie met de problemen van identificatie, scheiding en expansie van dergelijke recombinanten zal echter waarschijnlijk niet bijdragen aan de wijdverbreide toepassing van deze methode in de nabije toekomst, zelfs niet als er nieuwe technologische methoden worden ontwikkeld. De tweede benadering in gentherapie van dominante pathologie is gebaseerd op de automatische correctie van beschadigd DNA, aangezien genetische mutaties kunnen worden gecorrigeerd door exogeen DNA met de gewenste sequentie (korte DNA-oligonucleotiden of chimere RNA/DNA-oligonucleotiden) in te brengen, dat zich bindt aan homologen in het beschadigde genoom. De derde optie houdt in dat de overdracht van pathologische informatie wordt geblokkeerd. Dit wordt bereikt door het gebruik van speciaal ontworpen oligonucleotiden die zich aan een specifiek gen binden en zo een ternaire helixstructuur vormen, waardoor de mogelijkheid van transcriptie wordt uitgesloten.

Hoewel correctie van een genetische ziekte op genoomniveau de meest optimale en geprefereerde therapeutische methode blijft, is mRNA ook een veelbelovende vector (mogelijk zelfs toegankelijker) voor het blokkeren van een dominant negatief gen. Eiwitmoleculen met antisense-oligonucleotiden of complete sequenties die de binding van mRNA aan het cellulaire biosyntheseapparaat blokkeren, worden al lang gebruikt om translatie te remmen en/of mRNA-afbraak te verhogen. Bovendien induceert dubbelstrengs RNA snelle mRNA-afbraak, waarvan het mechanisme onduidelijk blijft. Het is echter onwaarschijnlijk dat de loutere eliminatie van mRNA's die getranscribeerd zijn van een mutant allel met korte of enkelvoudige mutaties de expressie van mRNA van het normale allel zal bevorderen. Een alternatief is het gebruik van hammerhead- en hairpin-ribosyntheses, die het vermogen hebben om te binden aan zeer specifieke mRNA-regio's met daaropvolgende inductie van hun splitsing en inactivatie tijdens translatie. De mogelijkheid om deze methode te gebruiken bij de behandeling van pathologische osteogenese wordt momenteel bestudeerd. Ongeacht wat precies het doel is - genomische of cytoplasmatische elementen - zal het succes van nieuwe gentherapietechnologieën worden bepaald door de efficiëntie van de insluiting van reagentia in beenmergstromacellen ex vivo, de optimale keuze van een specifieke vector en het stabiele vermogen van mesenchymale stamcellen om de noodzakelijke factoren in vivo tot expressie te brengen.

De ontdekking van mesenchymale stamcellen met hun onverwachte eigenschappen creëert dus een nieuw conceptueel schema voor de ontwikkeling van cellijnen. Verder interdisciplinair onderzoek is echter nodig om de biologische rol van stromale stamcellen, hun aard, hun vermogen tot transdifferentiëren of dedifferentiëren, hun fysiologische betekenis tijdens de embryonale ontwikkeling, postnatale groei, rijping en veroudering, en bij menselijke ziekten, te begrijpen.