Beperkingen, gevaren en complicaties van celtransplantatie

Regeneratieve plastische geneeskunde is gebaseerd op de klinische implementatie van de toti- en pluripotente eigenschappen van embryonale en progenitorstamcellen, die in vitro en in vivo de creatie mogelijk maken van specifieke cellijnen die beschadigde weefsels en organen van een zieke persoon opnieuw bevolken.

De reële mogelijkheid om embryonale stamcellen en stamcellen van definitieve weefsels (de zogenaamde "volwassen" stamcellen) van mensen voor therapeutische doeleinden te gebruiken, staat niet langer ter discussie. Deskundigen van de National and Medical Academies of the USA (Stem cells and the future regenerative medicine, National Academy Press) en het National Institute of Health of the USA (Stem cells and the future research direction, Nat. Inst. of Health USA) adviseren echter om de eigenschappen van stamcellen nader te bestuderen in experimenten met adequate biologische modellen en alle gevolgen van transplantatie objectief te beoordelen, en pas daarna stamcellen in de kliniek te gebruiken.

Het is vastgesteld dat stamcellen deel uitmaken van de weefselderivaten van alle drie de kiembladen. Stamcellen worden aangetroffen in het netvlies, het hoornvlies, de opperhuid, het beenmerg en het perifere bloed, in bloedvaten, tandpulpa, nieren, gastro-intestinaal epitheel, pancreas en lever. Met behulp van moderne methoden is bewezen dat neurale stamcellen gelokaliseerd zijn in de hersenen en het ruggenmerg van een volwassene. Deze sensationele gegevens trokken speciale aandacht van wetenschappers en de media, aangezien neuronen in de hersenen dienden als een klassiek voorbeeld van een statische celpopulatie die niet hersteld wordt. Zowel in de vroege als in de late periode van de ontogenese worden neuronen, astrocyten en oligodendrocyten gevormd in de hersenen van dieren en mensen dankzij neurale stamcellen (Stem cells: scientific progress and future research direction. Nat. Inst. of Health USA).

Onder normale omstandigheden manifesteert de plasticiteit van stamcellen van definitieve weefsels zich echter niet. Om het plastische potentieel van stamcellen van definitieve weefsels te benutten, moeten ze worden geïsoleerd en vervolgens gekweekt in media met cytokines (LIF, EGF, FGF). Bovendien kunnen stamcelderivaten alleen succesvol innestelen wanneer ze worden getransplanteerd in het lichaam van een dier met een verzwakt immuunsysteem (γ-bestraling, cytostatica, busulfan, enz.). Tot op heden is er geen overtuigend bewijs gevonden voor de implementatie van stamcelplasticiteit bij dieren die niet zijn blootgesteld aan straling of andere effecten die diepe immunosuppressie veroorzaken.

Onder dergelijke omstandigheden manifesteert het gevaarlijke potentieel van ES-cellen zich allereerst tijdens hun transplantatie in ectopische gebieden – tijdens subcutane injectie van ES-cellen in immunodeficiënte muizen ontstaan teratocarcinomen op de injectieplaats. Bovendien komen chromosomale afwijkingen vaker voor tijdens de ontwikkeling van het menselijke embryo dan tijdens de embryogenese bij dieren. In het blastocyststadium bestaat slechts 20-25% van de menselijke embryo's uit cellen met een normaal karyotype, en de overgrote meerderheid van de vroege menselijke embryo's die na in-vitrofertilisatie zijn verkregen, vertoont chaotisch chromosomaal mozaïcisme en vertoont zeer vaak numerieke en structurele afwijkingen.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ]

Gunstige effecten van stamcellen

Voorlopige resultaten van klinische studies bevestigen het gunstige effect van stamcellen op de patiënt, maar er is nog geen informatie over de langetermijneffecten van celtransplantatie. De literatuur werd aanvankelijk gedomineerd door berichten over positieve resultaten van transplantatie van embryonale hersenfragmenten bij de ziekte van Parkinson, maar daarna kwamen er gegevens die het effectieve therapeutische effect van embryonaal of foetaal zenuwweefsel dat in de hersenen van patiënten werd getransplanteerd, ontkenden.

Halverwege de 20e eeuw werd voor het eerst het herstel van hematopoëse bij dodelijk bestraalde dieren na intraveneuze transfusie van beenmergcellen ontdekt, en in 1969 voerde de Amerikaanse onderzoeker D. Thomas de eerste beenmergtransplantatie bij mensen uit. Het gebrek aan kennis over de mechanismen van immunologische incompatibiliteit van donor- en ontvangerbeenmergcellen leidde destijds tot een hoge mortaliteit als gevolg van frequent transplantaatfalen en de ontwikkeling van een graft-versus-hostreactie. De ontdekking van het belangrijkste histocompatibiliteitscomplex, waaronder humane leukocytenantigenen (HbA), en de verbetering van hun typeringsmethoden maakten het mogelijk de overleving na beenmergtransplantatie aanzienlijk te verhogen, wat leidde tot de wijdverbreide toepassing van deze behandelmethode in de oncohematologie. Tien jaar later werden de eerste transplantaties uitgevoerd van hematopoëtische stamcellen (HSC's) verkregen uit perifeer bloed met behulp van leukaferese. In 1988 werd navelstrengbloed voor het eerst gebruikt als bron van HSC's in Frankrijk voor de behandeling van een kind met Fanconi-anemie. Sinds eind 2000 zijn er berichten in de pers verschenen over het vermogen van HSC's om te differentiëren tot cellen van verschillende weefseltypen, wat mogelijk de reikwijdte van hun klinische toepassing vergroot. Het bleek echter dat het transplantatiemateriaal, samen met HSC's, een aanzienlijk aantal niet-hematopoëtische celverontreinigingen van verschillende aard en met verschillende eigenschappen bevat. In dit verband worden methoden voor de zuivering van het transplantaat en criteria voor de beoordeling van de cellulaire zuiverheid ervan ontwikkeld. Met name positieve immunoselectie van CD34+-cellen wordt gebruikt, wat de isolatie van HSC's met behulp van monoklonale antilichamen mogelijk maakt.

[ 8 ], [ 9 ], [ 10 ], [ 11 ], [ 12 ]

Complicaties van stamceltherapie

Complicaties bij beenmergtransplantatie zijn meestal hematologisch van aard en gaan gepaard met een langdurige iatrogene pancytopenie. Infectieuze complicaties, bloedarmoede en bloedingen komen het vaakst voor. In dit verband is het uiterst belangrijk om de optimale methode voor het verzamelen, verwerken en bewaren van beenmerg te selecteren voor maximale bewaring van stamcellen, wat een snel en stabiel herstel van de hematopoëse garandeert. Bij de karakterisering van een transplantaat worden momenteel doorgaans de volgende parameters beoordeeld: het aantal mononucleaire en/of nucleërende cellen, kolonievormende eenheden en het gehalte aan CD34-positieve cellen. Helaas geven deze indicatoren slechts een indirecte beoordeling van de werkelijke hematopoëtische capaciteit van de stamcelpopulatie van het transplantaat. Momenteel zijn er geen absoluut nauwkeurige parameters om te bepalen of een transplantaat voldoende is voor langdurig herstel van de hematopoëse bij patiënten, zelfs niet bij autologe beenmergtransplantatie. Het ontwikkelen van algemene criteria is uiterst moeilijk vanwege het ontbreken van strikte normen voor de verwerking, cryopreservatie en het testen van het transplantaat. Bovendien is het noodzakelijk om rekening te houden met de vele factoren die de parameters voor succesvol herstel van de hematopoëse bij elke individuele patiënt beïnvloeden. Bij autologe beenmergtransplantatie zijn de belangrijkste het aantal eerdere chemotherapiekuren, de kenmerken van het conditioneringsregime, de ziekteperiode waarin het beenmerg werd afgenomen en de schema's voor het gebruik van koloniestimulerende factoren in de posttransplantatieperiode. Bovendien mag niet worden vergeten dat chemotherapie voorafgaand aan de transplantatie een negatief effect kan hebben op beenmergstamcellen.

De incidentie van ernstige toxische complicaties neemt significant toe tijdens allogene beenmergtransplantatie. In dit verband zijn statistische gegevens over allogene beenmergtransplantatie bij thalassemie interessant. De rapporten van de European Bone Marrow Transplantation Group hebben ongeveer 800 beenmergtransplantaties geregistreerd bij patiënten met thalassemie major. Allogene transplantatie bij thalassemie wordt in de overgrote meerderheid van de gevallen uitgevoerd bij HLA-identieke broers en zussen, wat gepaard gaat met ernstige complicaties en een hoge mortaliteit tijdens transplantatie van stamcelmateriaal van gedeeltelijk compatibele verwante of compatibele niet-verwante donoren. Om het risico op fatale infectieuze complicaties te minimaliseren, worden patiënten geplaatst in geïsoleerde aseptische boxen met laminaire luchtstroom en krijgen ze een laag- of abacterieel dieet. Voor bacteriële decontaminatie van de darm worden niet-resorbeerbare vormen van antibiotica en antischimmelmiddelen oraal voorgeschreven. Voor profylaxe wordt amfotericine B intraveneus toegediend. Preventie van systemische infecties wordt versterkt door amikacine en ceftazidim, die de dag vóór de transplantatie worden voorgeschreven en de behandeling wordt voortgezet tot ontslag van de patiënt. Alle bloedproducten worden vóór de transfusie bestraald met een dosis van 30 Gy. Parenterale voeding tijdens de transplantatie is een noodzakelijke voorwaarde en start direct na een natuurlijke voedselbeperking.

Een aantal complicaties wordt geassocieerd met de hoge toxiciteit van immunosuppressiva, die vaak misselijkheid, braken en mucositis, nierschade en interstitiële pneumonie veroorzaken. Een van de ernstigste complicaties van chemotherapie is veno-occlusieve leverziekte, die in de vroege posttransplantatieperiode tot overlijden leidt. Risicofactoren voor trombose van de venen van het portale systeem van de lever zijn onder andere de leeftijd van de patiënten, de aanwezigheid van hepatitis en leverfibrose, evenals immunosuppressieve therapie na beenmergtransplantatie. Veno-occlusieve leverziekte is vooral gevaarlijk bij thalassemie, die gepaard gaat met hemosiderose van de lever, hepatitis en fibrose - frequente begeleiders van transfusietherapie. Trombose van de venen van het portale systeem van de lever ontwikkelt zich 1-2 weken na transplantatie en wordt gekenmerkt door een snelle toename van het gehalte aan bilirubine en transaminase-activiteit in het bloed, progressie van hepatomegalie, ascites, encefalopathie en pijn in de bovenbuik. Histologisch autopsiemateriaal toont endotheelschade, subendotheliale bloedingen, schade aan centrilobulaire hepatocyten, trombotische obstructie van venulen en centrale venen van de lever. Er zijn gevallen van fatale hartstilstand beschreven bij patiënten met thalassemie in verband met de toxische effecten van cytostatica.

Tijdens de pretransplantatieperiode veroorzaken cyclofosfamide en busulfan vaak toxische hemorragische cystitis met pathologische veranderingen in uro-epitheliale cellen. Het gebruik van ciclosporine A bij beenmergtransplantatie gaat vaak gepaard met nefro- en neurotoxiciteit, hypertensiesyndroom, vochtretentie in het lichaam en hepatocytcytolyse. Seksuele en reproductieve disfunctie wordt vaker waargenomen bij vrouwen. Bij jonge kinderen wordt de puberale ontwikkeling na transplantatie meestal niet beïnvloed, maar bij oudere kinderen kan de pathologie van de seksuele ontwikkeling zeer ernstig zijn – tot aan onvruchtbaarheid toe. Complicaties die direct verband houden met de transplantatie zelf zijn onder andere afstoting van allogene beenmergcellen, ABO-incompatibiliteit, en acute en chronische vormen van graft-versus-hostziekte.

Bij patiënten met een ABO-incompatibele beenmergtransplantatie worden gedurende 330-605 dagen na de transplantatie host-versus-ABO-donorisoagglutininen geproduceerd, wat kan leiden tot verlengde hemolyse en een dramatische toename van de behoefte aan bloedtransfusies. Deze complicatie wordt voorkomen door alleen type 0 rode bloedcellen te transfunderen. Na de transplantatie ervaren sommige patiënten auto-immuun neutropenie, trombocytopenie of pancytopenie, waarvoor een splenectomie nodig is.

Bij 35-40% van de ontvangers ontwikkelt zich binnen 100 dagen na allogene HLA-identieke beenmergtransplantatie acute graft-versus-hostziekte. De mate van aantasting van huid, lever en darmen varieert van huiduitslag, diarree en matige hyperbilirubinemie tot huiddesquamatie, darmobstructie en acuut leverfalen. Bij patiënten met thalassemie is de incidentie van acute graft-versus-hostziekte graad I na beenmergtransplantatie 75%, en graad II en hoger 11-53%. Chronische graft-versus-hostziekte, een systemisch multiorgaansyndroom, ontwikkelt zich gewoonlijk binnen 100-500 dagen na allogene beenmergtransplantatie bij 30-50% van de patiënten. De huid, mondholte, lever, ogen, slokdarm en bovenste luchtwegen worden aangetast. Er wordt onderscheid gemaakt tussen een beperkte vorm van chronische graft-versus-hostziekte, waarbij de huid en/of lever zijn aangetast, en een wijdverspreide vorm, waarbij gegeneraliseerde huidafwijkingen gepaard gaan met chronische agressieve hepatitis, afwijkingen aan de ogen, speekselklieren of andere organen. De dood wordt vaak veroorzaakt door infectieuze complicaties als gevolg van ernstige immunodeficiëntie. Bij thalassemie komt een milde vorm van chronische graft-versus-hostziekte voor bij 12%, een matige vorm bij 3% en een ernstige vorm bij 0,9% van de ontvangers van allogeen HLA-compatibel beenmerg. Een ernstige complicatie van beenmergtransplantatie is afstoting van het transplantaat, die zich 50-130 dagen na de operatie ontwikkelt. De frequentie van afstoting is afhankelijk van het conditioneringsregime. Met name bij patiënten met thalassemie die tijdens de voorbereidingsperiode uitsluitend methotrexaat kregen, werd in 26% van de gevallen afstoting van het beenmergtransplantatie waargenomen, bij een combinatie van methotrexaat met ciclosporine A in 9% van de gevallen en bij toediening van uitsluitend ciclosporine A in 8% van de gevallen (Gaziev et al., 1995).

Infectieuze complicaties na beenmergtransplantatie worden veroorzaakt door virussen, bacteriën en schimmels. Hun ontwikkeling gaat gepaard met diepe neutropenie geïnduceerd door chemotherapie tijdens de conditioneringsperiode, schade aan de slijmvliesbarrière door cytostatica en de graft-versus-hostreactie. Afhankelijk van het tijdstip van ontwikkeling worden drie fasen van infectieuze complicaties onderscheiden. In de eerste fase (die zich ontwikkelt in de eerste maand na transplantatie) overheersen schade aan de slijmvliesbarrière en neutropenie, vaak vergezeld door virale infecties (herpes, Epstein-Barr-virus, cytomegalovirus, varicella zoster), evenals infecties veroorzaakt door grampositieve en gramnegatieve bacteriën, Candida-schimmels en aspergilli. In de vroege posttransplantatieperiode (de tweede en derde maand na transplantatie) is cytomegalovirus de ernstigste infectie, die vaak leidt tot de dood van patiënten in de tweede fase van infectieuze complicaties. Bij thalassemie ontwikkelt zich na beenmergtransplantatie een cytomegalovirusinfectie bij 1,7-4,4% van de ontvangers. De derde fase wordt waargenomen in de late posttransplantatieperiode (drie maanden na de operatie) en wordt gekenmerkt door ernstige gecombineerde immuundeficiëntie. Infecties veroorzaakt door varicella zoster, streptokokken, pneumocystis carinii, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae en hepatotrope virussen komen in deze periode vaak voor. Bij thalassemie wordt de mortaliteit bij patiënten na beenmergtransplantatie geassocieerd met bacteriële en fungale sepsis, idiopathische interstitiële en cytomegaloviruspneumonie, acuut respiratoir distresssyndroom, acuut hartfalen, harttamponade, hersenbloeding, veno-occlusieve leverziekte en acute graft-versus-hostziekte.

Momenteel zijn er successen geboekt bij de ontwikkeling van methoden voor het isoleren van zuivere populaties hematopoëtische stamcellen uit beenmerg. De techniek voor het verkrijgen van foetaal bloed uit de navelstreng is verbeterd en er zijn methoden ontwikkeld voor het isoleren van hematopoëtische cellen uit navelstrengbloed. Er zijn berichten in de wetenschappelijke pers dat hematopoëtische stamcellen zich kunnen vermenigvuldigen wanneer ze worden gekweekt in media met cytokines. Bij gebruik van speciaal ontworpen bioreactoren voor de expansie van hematopoëtische stamcellen neemt de biomassa van hematopoëtische stamcellen geïsoleerd uit beenmerg, perifeer bloed of navelstrengbloed aanzienlijk toe. De mogelijkheid om hematopoëtische stamcellen te expanderen is een belangrijke stap in de richting van de klinische ontwikkeling van celtransplantatie.

Vóór de in-vitropropagatie van hematopoëtische stamcellen is het echter noodzakelijk om een homogene populatie hematopoëtische stamcellen te isoleren. Dit wordt meestal bereikt met behulp van markers die selectieve labeling van hematopoëtische stamcellen mogelijk maken met monoklonale antilichamen die covalent gebonden zijn aan een fluorescerend of magnetisch label, en hun isolatie met behulp van een geschikte celsorteerder. Tegelijkertijd is de kwestie van de fenotypische kenmerken van hematopoëtische stamcellen nog niet definitief opgelost. A. Petrenko en V. Grishchenko (2003) beschouwen cellen met CD34-, AC133- en Thyl-antigenen op hun oppervlak en zonder CD38-, HLA-DR- of andere differentiatiemarkers (cellen met het CD34+Liir-fenotype) als kandidaten voor hematopoëtische stamcellen. Lineage (Lin) markers omvatten glycophorine A (GPA), CD3, CD4, CD8, CD10, CD14, CD16, CD19, CD20 (Muench, 2001). Cellen met het CD34+CD45RalüW CD71low-fenotype, evenals het CD34+Thyl+CD38low/c-kit/low-fenotype, worden als veelbelovend beschouwd voor transplantatie.

De vraag naar het aantal hematopoëtische stamcellen dat voldoende is voor een effectieve transplantatie blijft problematisch. Momenteel zijn de bronnen van hematopoëtische stamcellen beenmerg, perifeer en navelstrengbloed, en embryonale lever. Expansie van hematopoëtische stamcellen wordt bereikt door ze te kweken in aanwezigheid van endotheelcellen en hematopoëtische groeifactoren. In verschillende protocollen worden myeloproteïnen, SCF, erytropoëtine, insulineachtige groeifactoren, corticosteroïden en oestrogenen gebruikt om HSC-proliferatie te induceren. Bij gebruik van combinaties van cytokinen in vitro is het mogelijk om een significante toename van de HSC-pool te bereiken met een piek in hun output aan het einde van de tweede kweekweek.

Traditioneel wordt hematopoëtische stamceltransplantatie uit navelstrengbloed voornamelijk gebruikt voor hemoblastosen. De minimale dosis hematopoëtische cellen die nodig is voor een succesvolle navelstrengbloedtransplantatie is echter 3,7 x 107 ^kernhoudende cellen per 1 kg lichaamsgewicht van de ontvanger. Het gebruik van een kleiner aantal hematopoëtische stamcellen uit navelstrengbloed verhoogt het risico op transplantaatfalen en recidief van de ziekte aanzienlijk. Daarom wordt hematopoëtische stamceltransplantatie uit navelstrengbloed voornamelijk gebruikt voor de behandeling van hemoblastosen bij kinderen.

Helaas zijn er nog steeds geen normen voor de inkoop of gestandaardiseerde protocollen voor het klinisch gebruik van hematopoëtische cellen uit navelstrengbloed. Stamcellen uit navelstrengbloed zijn daarom zelf geen wettelijk erkende bron van hematopoëtische cellen voor transplantatie. Bovendien zijn er geen ethische of wettelijke normen die de activiteiten en organisatie van navelstrengbloedbanken regelen, zoals die in het buitenland wel bestaan. Voor een veilige transplantatie moeten alle navelstrengbloedmonsters zorgvuldig worden gecontroleerd. Voordat bloed van een zwangere vrouw wordt afgenomen, moet haar toestemming worden verkregen. Elke zwangere vrouw moet worden onderzocht op HBsAg-dragerschap en de aanwezigheid van antilichamen tegen hepatitis C, hiv en syfilis. Elk navelstrengbloedmonster moet standaard worden getest op het aantal cellen met een celkern, CD34+ en kolonievormend vermogen. Daarnaast worden HbA-typering, bloedgroepbepaling via ABO en de bijbehorende bloedgroepbepaling via de Rh-factor uitgevoerd. De benodigde testprocedures zijn bacteriologische kweek voor steriliteit, serologische tests op hiv-1- en hiv-2-infecties, HBsAg, virale hepatitis C, cytomegalovirusinfectie, HTLY-1 en HTLY-II, syfilis en toxoplasmose. Daarnaast wordt polymerasekettingreactie (PCR) uitgevoerd om cytomegalovirus- en hiv-infecties op te sporen. Het lijkt raadzaam om de testprotocollen aan te vullen met een analyse van navelstrengbloed-GSC om genetische aandoeningen zoals athalassemie, sikkelcelanemie, adenosinedeaminasedeficiëntie, Bruton-agammaglobulinemie, de ziekte van Hurler en Ponter op te sporen.

De volgende fase in de voorbereiding op transplantatie is de kwestie van het bewaren van de hematopoëtische stamcellen. De gevaarlijkste procedures voor de levensvatbaarheid van de cellen tijdens hun preparatie zijn invriezen en ontdooien. Bij het invriezen van hematopoëtische cellen kan een aanzienlijk deel ervan worden vernietigd door kristalvorming. Speciale stoffen - cryoprotectoren - worden gebruikt om het percentage celdood te verminderen. Meestal wordt DMSO als cryoprotector gebruikt in een eindconcentratie van 10%. DMSO in een dergelijke concentratie wordt echter gekenmerkt door een direct cytotoxisch effect, dat zich zelfs manifesteert bij minimale blootstelling. Een vermindering van het cytotoxisch effect wordt bereikt door strikte handhaving van de nultemperatuur tijdens de blootstellingsmodus, evenals door naleving van de voorschriften voor de verwerking van het materiaal tijdens en na het ontdooien (snelheid van alle handelingen, gebruik van meerdere wasprocedures). DMSO-concentraties van minder dan 5% mogen niet worden gebruikt, omdat dit massale hematopoëtische celdood veroorzaakt tijdens het invriezen.

De aanwezigheid van erytrocytverontreinigingen in het suspensiemengsel van hematopoëtische stamcellen brengt het risico met zich mee van een incompatibiliteitsreactie voor erytrocytantigenen. Tegelijkertijd neemt het verlies van hematopoëtische cellen aanzienlijk toe wanneer erytrocyten worden verwijderd. In dit verband is een methode voor ongefractioneerde isolatie van hematopoëtische stamcellen voorgesteld. In dit geval worden een 10% DMSO-oplossing en constante koeling (GS/min) tot -80 °C gebruikt om cellen met een celkern te beschermen tegen de schadelijke effecten van lage temperaturen, waarna de celsuspensie wordt ingevroren in vloeibare stikstof. Aangenomen wordt dat deze cryopreservatiemethode resulteert in gedeeltelijke lysis van erytrocyten, waardoor bloedmonsters niet gefractioneerd hoeven te worden. Vóór transplantatie wordt de celsuspensie ontdooid en ontdaan van vrije hemoglobine en DMSO in een oplossing van humaan albumine of in bloedserum. De conservering van hematopoëtische precursoren is met deze methode weliswaar hoger dan na fractionering van navelstrengbloed, maar er blijft een risico bestaan op transfusiecomplicaties door transfusie van ABO-incompatibele erytrocyten.

De oprichting van een banksysteem voor de opslag van HLA-geteste en getypeerde HSC-monsters zou de bovengenoemde problemen kunnen oplossen. Dit vereist echter de ontwikkeling van ethische en juridische normen, waarover momenteel slechts discussie bestaat. Voordat een banknetwerk kan worden opgezet, is het noodzakelijk om een aantal voorschriften en documenten aan te nemen over de standaardisatie van procedures voor het verzamelen, fractioneren, testen en typeren van HSC, evenals cryopreservatie. Een verplichte voorwaarde voor de effectieve werking van HSC-banken is de organisatie van een computerbasis voor interactie met de registers van de World Marrow Donor Association (WMDA) en het National Marrow Donor Program of the United States (NMDP).

Daarnaast is het noodzakelijk om de methoden voor in-vitro-expansie van HSC's te optimaliseren en te standaardiseren, met name hematopoëtische cellen uit navelstrengbloed. Expansie van HSC's uit navelstrengbloed is noodzakelijk om het aantal potentiële ontvangers dat compatibel is met het HLA-systeem te vergroten. Vanwege de kleine volumes navelstrengbloed is het aantal HSC's dat het bevat meestal niet voldoende om de beenmergrepopulatie bij volwassen patiënten te garanderen. Tegelijkertijd is het voor het uitvoeren van niet-verwante transplantaties noodzakelijk om toegang te hebben tot een voldoende aantal getypeerde HSC-monsters (van 10.000 tot 1.500.000 per ontvanger).

Transplantatie van hematopoëtische stamcellen elimineert de complicaties die gepaard gaan met beenmergtransplantatie niet. Analyse toont aan dat bij transplantatie van navelstrengbloedstamcellen ernstige vormen van acute graft-versus-hostziekte ontstaan bij 23% van de ontvangers en chronische vormen bij 25% van de ontvangers. Bij oncohematologische patiënten worden recidieven van acute leukemie in het eerste jaar na transplantatie van navelstrengbloedstamcellen in 26% van de gevallen waargenomen.

De laatste jaren zijn methoden voor transplantatie van perifere hematopoëtische stamcellen sterk in ontwikkeling. Het gehalte aan HSC in perifeer bloed is zo laag (1 HSC per 100.000 bloedcellen) dat isolatie ervan zonder speciale voorbereiding geen zin heeft. Daarom krijgt de donor eerst een kuur met medicamenteuze stimulatie van de afgifte van hematopoëtische cellen van het beenmerg aan het bloed. Hiervoor worden verre van onschadelijke medicijnen zoals cyclofosfamide en granulocytkoloniestimulerende factor gebruikt. Maar zelfs na de mobilisatieprocedure van HSC in het perifere bloed bedraagt het gehalte aan CD34+-cellen daarin niet meer dan 1,6%.

Voor de mobilisatie van hematopoëtische stamcellen in de kliniek wordt het meest gebruikgemaakt van S-SEC, dat zich kenmerkt door een relatief goede tolerantie, met uitzondering van het bijna natuurlijke optreden van botpijn. Opgemerkt dient te worden dat het gebruik van moderne bloedseparatoren de effectieve isolatie van hematopoëtische stamcellen mogelijk maakt. Onder normale hematopoëtische omstandigheden moeten echter minstens 6 procedures worden uitgevoerd om een voldoende aantal hematopoëtische stamcellen te verkrijgen dat qua repopulatiecapaciteit vergelijkbaar is met beenmergsuspensie. Voor elke procedure is 10-12 liter bloed nodig dat op de separator wordt verwerkt, wat trombocytopenie en leukopenie kan veroorzaken. De scheidingsprocedure omvat de toediening van een anticoagulans (natriumcitraat) aan de donor, wat echter contactactivering van bloedplaatjes tijdens extracorporale centrifugatie niet uitsluit. Deze factoren creëren omstandigheden voor het ontstaan van infectieuze en hemorragische complicaties. Een ander nadeel van de methode is de grote variabiliteit van de mobilisatierespons. Daarom is het nodig om het gehalte aan HSC's in het perifere bloed van donoren te controleren, wat nodig is om hun maximale niveau te bepalen.

Autogene transplantatie van hematopoëtische stamcellen elimineert, in tegenstelling tot allogene transplantatie, de ontwikkeling van een afstotingsreactie volledig. Een belangrijk nadeel van autotransplantatie van hematopoëtische stamcellen, dat het aantal indicaties voor implementatie beperkt, is echter de hoge kans op reïnfusie van leukemische klooncellen met het transplantaat. Bovendien verhoogt de afwezigheid van het immuungemedieerde "graft-versus-tumor"-effect de frequentie van recidieven van maligne bloedziekten aanzienlijk. Daarom blijft intensieve polychemotherapie met transplantatie van allogene hematopoëse de enige radicale methode om neoplastische klonale hematopoëse te elimineren en normale polyklonale hematopoëse te herstellen bij myelodysplastische syndromen.

Maar zelfs in dit geval is de behandeling van de meeste hemoblastosen alleen gericht op het verlengen van de overlevingstijd van patiënten en het verbeteren van hun kwaliteit van leven. Volgens verschillende grote onderzoeken wordt een langdurige recidiefvrije overleving na allotransplantatie van HSC's bereikt bij 40% van de oncohematologische patiënten. Bij gebruik van stamcellen van een HLA-compatibele broer of zus worden de beste resultaten waargenomen bij jonge patiënten met een korte voorgeschiedenis van de ziekte, een blastceltelling tot 10% en gunstige cytogenetica. Helaas blijft de mortaliteit geassocieerd met de procedure van allotransplantatie van HSC's bij patiënten met myelodysplastische ziekten hoog (in de meeste rapporten - ongeveer 40%). De resultaten van 10-jarig werk van het National Bone Marrow Donor Program in de VS (510 patiënten, mediane leeftijd - 38 jaar) geven aan dat de recidiefvrije overleving gedurende twee jaar 29% is met een relatief lage kans op recidief (14%). De mortaliteit die gepaard gaat met allotransplantatie van HSC's van een niet-verwante donor is echter extreem hoog en bereikt 54% over een periode van twee jaar. Vergelijkbare resultaten werden verkregen in een Europese studie (118 patiënten, mediane leeftijd - 24 jaar, recidiefvrije overleving na twee jaar - 28%, recidief - 35%, mortaliteit - 58%).

Tijdens intensieve chemotherapiekuren met daaropvolgend herstel van de hematopoëse met allogene hematopoëtische cellen treden vaak immunohematologische en transfusiecomplicaties op. Deze worden grotendeels veroorzaakt door het feit dat menselijke bloedgroepen onafhankelijk van MHC-moleculen worden overgeërfd. Zelfs als donor en ontvanger compatibel zijn voor de belangrijkste HLA-antigenen, kunnen hun erytrocyten dus verschillende fenotypen hebben. Er wordt onderscheid gemaakt tussen 'major' incompatibiliteit, wanneer de ontvanger reeds bestaande antistoffen heeft tegen de erytrocytenantigenen van de donor, en 'minor' incompatibiliteit, wanneer de donor antistoffen heeft tegen de erytrocytenantigenen van de ontvanger. Gevallen van een combinatie van 'major' en 'minor' incompatibiliteit zijn mogelijk.

De resultaten van een vergelijkende analyse van de klinische effectiviteit van allotransplantatie van hematopoëtische stamcellen uit beenmerg en navelstrengbloed bij hemoblastosen geven aan dat bij kinderen na allotransplantatie van hematopoëtische stamcellen uit navelstrengbloed het risico op het ontwikkelen van een graft-versus-hostreactie aanzienlijk afneemt, maar dat er een langere periode van herstel van het aantal neutrofielen en bloedplaatjes wordt waargenomen, met een hogere incidentie van mortaliteit 100 dagen na transplantatie.

Door het onderzoek naar de oorzaken van vroegtijdige sterfte konden de contra-indicaties voor allogene HSC-transplantatie worden verduidelijkt, waarvan de belangrijkste zijn:

• de aanwezigheid van positieve tests voor cytomegalovirusinfectie bij de ontvanger of donor (zonder preventieve behandeling);
• acute stralingsziekte;
• de aanwezigheid of zelfs het vermoeden van de aanwezigheid van een mycotische infectie bij een patiënt (zonder dat er een systemische vroege profylaxe met fungicide middelen is uitgevoerd);
• hemoblastosen, waarbij patiënten langdurig met cytostatica werden behandeld (vanwege de grote kans op een plotselinge hartstilstand en meervoudig orgaanfalen);
• transplantatie van HLA-niet-identieke donoren (zonder profylaxe van acute graft-versus-hostreactie met ciclosporine A);
• chronische virale hepatitis C (vanwege het hoge risico op het ontwikkelen van een veno-occlusieve leverziekte).

HSC-transplantatie kan dus ernstige complicaties veroorzaken, die vaak tot de dood leiden. In de vroege fase (tot 100 dagen na de transplantatie) omvatten deze complicaties infectieuze complicaties, acute graft-versus-hostziekte, afstoting van het transplantaat (falen van donor-HSC's), veno-occlusieve leverziekte, evenals weefselschade veroorzaakt door de toxiciteit van het conditioneringsregime, dat wordt gekenmerkt door een hoge remodelleringssnelheid (huid, vasculair endotheel, darmepitheel). Complicaties in de late posttransplantatieperiode zijn onder andere chronische graft-versus-hostziekte, recidieven van de onderliggende ziekte, groeiachterstand bij kinderen, disfunctie van het voortplantingssysteem en de schildklier, en oogschade.

Recentelijk is, in verband met publicaties over de plasticiteit van beenmergcellen, het idee ontstaan om HSC's te gebruiken voor de behandeling van hartaanvallen en andere ziekten. Hoewel sommige dierexperimenten deze mogelijkheid ondersteunen, moeten de conclusies over de plasticiteit van beenmergcellen nog worden bevestigd. Onderzoekers die geloven dat getransplanteerde menselijke beenmergcellen gemakkelijk kunnen worden getransformeerd tot skeletspier-, hartspier- of CZS-cellen, moeten hiermee rekening houden. De hypothese dat HSC's een natuurlijke cellulaire bron zijn voor de regeneratie van deze organen, vereist serieus bewijs.

Met name zijn de eerste resultaten gepubliceerd van een open, gerandomiseerde studie van V. Belenkov (2003). Het doel was om het effect van C-SvK (d.w.z. de mobilisatie van autologe HSC's in het bloed) op de klinische, hemodynamische en neurohumorale status van patiënten met matig tot ernstig chronisch hartfalen te bestuderen, en om de veiligheid ervan te evalueren tegen de achtergrond van standaardtherapie (ACE-remmers, bètablokkers, diuretica, hartglycosiden). In de eerste publicatie van de onderzoeksresultaten merken de auteurs van het programma op dat het enige argument vóór O-SvK de resultaten zijn van de behandeling van één patiënt, die een onbetwistbare verbetering van alle klinische en hemodynamische parameters liet zien tegen de achtergrond van therapie met dit geneesmiddel. De theorie van HSC-mobilisatie in de bloedbaan met daaropvolgende myocardregeneratie in de postinfarctzone werd echter niet bevestigd: zelfs bij een patiënt met een positieve klinische dynamiek liet stress-echocardiografie met dobutamine geen vorming van zones van levensvatbaar myocard in het littekengebied zien.

Opgemerkt moet worden dat er momenteel duidelijk onvoldoende gegevens zijn om vervangende celtherapie aan te bevelen voor brede implementatie in de dagelijkse klinische praktijk. Goed opgezette en hoogwaardige klinische studies zijn nodig om de effectiviteit van verschillende opties voor regeneratieve celtherapie te bepalen, indicaties en contra-indicaties hiervoor te ontwikkelen, evenals richtlijnen voor het gecombineerde gebruik van regeneratief-plastische therapie en traditionele chirurgische of conservatieve behandeling. Er is nog steeds geen antwoord op de vraag welke specifieke populatie beenmergcellen (hematopoëtische of stromale stamcellen) neuronen en cardiomyocyten kan voortbrengen, en het is ook onduidelijk welke condities hieraan in vivo bijdragen.

In veel landen wordt op dit gebied onderzoek gedaan. In de samenvatting van het symposium over acuut leverfalen van de National Institutes of Health in de VS worden naast levertransplantatie ook de transplantatie van xeno- of allogene hepatocyten en de extracorporale verbinding van bioreactoren met levercellen genoemd als veelbelovende behandelmethoden. Er is direct bewijs dat alleen vreemd-functioneel actieve hepatocyten de lever van de ontvanger effectief kunnen ondersteunen. Voor klinisch gebruik van geïsoleerde hepatocyten is het noodzakelijk om een celbank aan te leggen, wat de tijd tussen de isolatie van cellen en hun gebruik aanzienlijk zal verkorten. De meest acceptabele methode voor het aanleggen van een celbank met geïsoleerde hepatocyten is cryopreservatie van levercellen in vloeibare stikstof. Bij klinisch gebruik van dergelijke cellen bij patiënten met acuut en chronisch leverfalen is een vrij hoog therapeutisch effect aangetoond.

Ondanks de optimistische en bemoedigende resultaten van leverceltransplantatie in experimenten en klinische praktijk, zijn er nog steeds veel problemen die nog lang niet zijn opgelost. Deze omvatten een beperkt aantal organen dat geschikt is voor het verkrijgen van geïsoleerde hepatocyten, onvoldoende effectieve methoden voor hun isolatie, de afwezigheid van gestandaardiseerde methoden voor het bewaren van levercellen, onduidelijke ideeën over de mechanismen van groei en proliferatieregulatie van getransplanteerde cellen, en de afwezigheid van adequate methoden voor het beoordelen van de inplanting of afstoting van allogene hepatocyten. Dit omvat ook de aanwezigheid van transplantaatimmuniteit bij het gebruik van allogene en xenogene cellen, hoewel minder dan bij orthotope levertransplantatie, maar waarvoor het gebruik van immunosuppressiva, inkapseling van geïsoleerde hepatocyten of hun speciale behandeling met enzymen vereist is. Hepatocytentransplantatie leidt vaak tot een immuunconflict tussen de ontvanger en de donor in de vorm van een afstotingsreactie, waarvoor het gebruik van cytostatica noodzakelijk is. Een mogelijke oplossing voor dit probleem is het gebruik van polymere microporeuze dragers om levercellen te isoleren. Hierdoor verbetert hun overleving, aangezien het capsulemembraan de hepatocyten effectief beschermt, ondanks de immunisatie van de gastheer.

Bij acuut leverfalen is een dergelijke hepatocytentransplantatie echter ineffectief vanwege de relatief lange tijd die levercellen nodig hebben om zich in een nieuwe omgeving te nestelen en optimaal te functioneren. Een mogelijke beperking is de galsecretie tijdens ectopische transplantatie van geïsoleerde hepatocyten, en bij gebruik van bioreactoren vormt de species-mismatch tussen menselijke eiwitten en de eiwitten die door xenogene hepatocyten worden geproduceerd een belangrijke fysiologische barrière.

Er zijn berichten in de literatuur dat lokale transplantatie van stromale stamcellen uit het beenmerg effectieve correctie van botdefecten mogelijk maakt, en botweefselherstel verloopt in dit geval intensiever dan bij spontane herstelregeneratie. Verschillende preklinische studies met experimentele modellen tonen overtuigend de mogelijkheid aan van transplantaties van stromale cellen uit het beenmerg in de orthopedie, hoewel verder onderzoek nodig is om deze methoden te optimaliseren, zelfs in de eenvoudigste gevallen. Met name de optimale omstandigheden voor de ex vivo expansie van osteogene stromale cellen zijn nog niet gevonden en de structuur en samenstelling van hun ideale drager (matrix) zijn nog niet ontwikkeld. Het minimale aantal cellen dat nodig is voor volumetrische botregeneratie is nog niet vastgesteld.

Het is bewezen dat mesenchymale stamcellen transgermale plasticiteit vertonen, d.w.z. het vermogen om te differentiëren tot celtypen die fenotypisch niet verwant zijn aan de cellen van de oorspronkelijke lijn. Onder optimale kweekomstandigheden kunnen polyklonale beenmergstroma-stamcellijnen meer dan 50 delingen in vitro doorstaan, waardoor het mogelijk is om miljarden stromacellen te verkrijgen uit 1 ml beenmergaspiraat. De populatie mesenchymale stamcellen is echter heterogeen, wat zich manifesteert in zowel variabiliteit in koloniegroottes, verschillende snelheden van hun vorming, als morfologische diversiteit van celtypen, van fibroblastachtige spoelvormige tot grote platte cellen. Fenotypische heterogeniteit wordt waargenomen na slechts 3 weken kweek van stroma-stamcellen: sommige kolonies vormen knobbeltjes botweefsel, andere vormen clusters van adipocyten, en weer andere, zeldzamer, vormen eilandjes van kraakbeenweefsel.

Transplantatie van embryonaal zenuwweefsel werd aanvankelijk gebruikt voor de behandeling van degeneratieve aandoeningen van het centrale zenuwstelsel. De laatste jaren worden cellulaire elementen van neurosferen, verkregen uit neurale stamcellen, getransplanteerd in plaats van embryonaal hersenweefsel (Poltavtseva, 2001). Neurosferen bevatten toegewijde voorlopercellen van neuronen en neuroglia, wat hoop biedt op herstel van verloren hersenfuncties na transplantatie. Na transplantatie van verspreide neurosfeercellen in het striatum van de rattenhersenen werd hun proliferatie en differentiatie tot dopaminerge neuronen waargenomen, wat de motorische asymmetrie bij ratten met experimenteel hemiparkinsonisme ophief. In sommige gevallen ontwikkelden zich echter tumoren uit neurosfeercellen, wat leidde tot de dood van de dieren (Björklund, 2002).

In de kliniek leverden zorgvuldige studies van twee patiëntengroepen, waarbij noch de patiënten, noch de artsen die hen observeerden wisten (dubbelblind onderzoek), dat de ene groep patiënten een transplantatie had ondergaan met embryonaal zenuwweefsel met neuronen die dopamine produceerden, en de tweede groep een schijnoperatie, onverwachte resultaten op. Patiënten die een transplantatie hadden ondergaan met embryonaal zenuwweefsel voelden zich niet beter dan patiënten in de controlegroep. Bovendien ontwikkelden 5 van de 33 patiënten aanhoudende dyskinesie 2 jaar na transplantatie van embryonaal zenuwweefsel, wat niet het geval was bij patiënten in de controlegroep (Stem cells: scientific progress and future research direction. Nat. Inst. of Health. USA). Een van de onopgeloste problemen in klinisch onderzoek naar neurale stamcellen van de hersenen blijft de analyse van de werkelijke vooruitzichten en beperkingen van transplantatie van hun derivaten voor de correctie van aandoeningen van het centrale zenuwstelsel. Het is mogelijk dat neuronogenese in de hippocampus, geïnduceerd door langdurige aanvalsactiviteit, leidend tot een structurele en functionele reorganisatie, een factor is in de progressieve ontwikkeling van epilepsie. Deze conclusie verdient speciale aandacht, omdat deze wijst op mogelijke negatieve gevolgen van de aanmaak van nieuwe neuronen in de volgroeide hersenen en de vorming van afwijkende synaptische verbindingen door deze neuronen.

We mogen niet vergeten dat kweek in media met cytokines (mitogenen) de eigenschappen van stamcellen dichter bij die van tumorcellen brengt, aangezien er vergelijkbare veranderingen in de regulatie van celcycli in hen optreden, wat het vermogen tot onbeperkte deling bepaalt. Het is onverstandig om vroege derivaten van embryonale stamcellen in een mens te transplanteren, aangezien in dat geval de kans op het ontwikkelen van kwaadaardige neoplasmata zeer groot is. Het is veel veiliger om hun meer toegewijde nakomelingen te gebruiken, namelijk voorlopercellen van gedifferentieerde lijnen. Momenteel is er echter nog geen betrouwbare techniek ontwikkeld om stabiele lijnen van menselijke cellen te verkrijgen die in de gewenste richting differentiëren.

Het gebruik van moleculair-biologische technologieën voor de correctie van erfelijke pathologie en menselijke ziekten door middel van modificatie van stamcellen is van groot belang voor de praktische geneeskunde. De eigenschappen van het stamcelgenoom maken het mogelijk om unieke transplantatieschema's te ontwikkelen om genetische ziekten te corrigeren. Er zijn echter een aantal beperkingen op dit gebied die moeten worden overwonnen voordat genetische modificatie van stamcellen in de praktijk kan worden toegepast. Allereerst is het noodzakelijk om het proces van ex vivo stamcelgenoommodificatie te optimaliseren. Het is bekend dat langdurige (3-4 weken) proliferatie van stamcellen hun transfectie vermindert, waardoor meerdere transfectiecycli nodig zijn om een hoog niveau van genetische modificatie te bereiken. Het grootste probleem is echter de duur van therapeutische genexpressie. Tot nu toe heeft geen enkele studie de periode van effectieve expressie na transplantatie van gemodificeerde cellen langer dan vier maanden laten duren. In 100% van de gevallen neemt de expressie van getransfecteerde genen na verloop van tijd af als gevolg van inactivering van promoters en/of de dood van cellen met een gemodificeerd genoom.

Een belangrijk punt zijn de kosten van het gebruik van celtechnologieën in de geneeskunde. Zo bedraagt de geschatte jaarlijkse behoefte om alleen al de medische kosten te financieren van een beenmergtransplantatie-eenheid die is ontworpen voor 50 transplantaties per jaar, ongeveer 900.000 dollar.

De ontwikkeling van celtechnologieën in de klinische geneeskunde is een complex en meerfasenproces dat een constructieve samenwerking vereist tussen multidisciplinaire wetenschappelijke en klinische centra en de internationale gemeenschap. Tegelijkertijd vereisen kwesties rond de wetenschappelijke organisatie van onderzoek op het gebied van celtherapie speciale aandacht. De belangrijkste daarvan zijn de ontwikkeling van klinische onderzoeksprotocollen, de controle op de betrouwbaarheid van klinische gegevens, de vorming van een nationaal register van studies, de integratie in internationale programma's van multicenter klinische studies en de implementatie van resultaten in de klinische praktijk.

Ter afsluiting van de inleiding over de problematiek van de celtransplantatieologie wil ik de hoop uitspreken dat de bundeling van de inspanningen van vooraanstaande Oekraïense specialisten uit verschillende wetenschappelijke disciplines zal zorgen voor aanzienlijke vooruitgang in experimenteel en klinisch onderzoek en het in de komende jaren mogelijk zal maken om doeltreffende manieren te vinden om ernstig zieke mensen die een orgaan-, weefsel- en celtransplantatie nodig hebben, te helpen.

[ 13 ], [ 14 ], [ 15 ], [ 16 ], [ 17 ], [ 18 ]