De rol van enzymen en cytokines in de pathogenese van osteoartritis

In de afgelopen jaren heeft veel onderzoek zich geconcentreerd op de identificatie van proteasen die verantwoordelijk zijn voor de afbraak van ECM van gewrichtskraakbeen bij osteoartritis. Volgens moderne ideeën speelt matrixethaloproteasen (MMP) een belangrijke rol bij de pathogenese van artrose. Patiënten met artrose hebben een verhoogde spiegel van drie vertegenwoordigers van MMP - collagenasen, stromelysins en gelatinases. Collagenase is verantwoordelijk voor de afbraak van natief collageen, stromelysine - collageen type IV, laminine en proteoglycanen, azhelatinaza - voor de afbraak van gelatine, collageen IV, XI Vh types elastine. Bovendien is de aanwezigheid van een ander enzym - aggrecanase, dat de eigenschappen van MMP's heeft en verantwoordelijk is voor de proteolyse van kraakbeenachtige proteoglycanaggregaten.

Gewrichtskraakbeen van humane collagenase worden drie soorten niveaus die zijn verhoogd in patiënten met artrose - collagenase-1 (MMP-1), collagenase-2 (MMP-8), collagenase-3 (MMP-13). Het naast elkaar bestaan van drie verschillende soorten collagenasen in het gewrichtskraakbeen wijst erop dat elk van hen een eigen specifieke rol speelt. Inderdaad zijn collagenasen-1 en -2 hoofdzakelijk gelocaliseerd in het oppervlak en de bovenste delen van de tussenzone van het gewrichtskraakbeen, terwijl collagenase-3 zich bevindt in het onderste deel van de tussenliggende en diepe zones. Bovendien zijn de resultaten van de immunohistochemische studies hebben aangetoond dat tijdens de progressie van osteoartritis niveau van collagenase-3 bereikt een plateau of zelfs afneemt, terwijl het niveau van collagenase-1 geleidelijk toeneemt. Er zijn aanwijzingen dat bij osteoartritis collagenase-1 is voornamelijk betrokken bij het ontstekingsproces in het gewrichtskraakbeen, terwijl collagenase-3 - in het weefsel remodellering. Cartilagin-3, uitgedrukt in het kraakbeen van patiënten met OA, voert type II collageenafbraak intensiever uit dan collagenase-1.

Vertegenwoordigers van de tweede groep metalloproteasen Human stromelizinovu geïdentificeerd als drie - stromelysine-1 (MMP-3), stromelysine-2 (MMP-10) en stromelysine-3 (MMP-11). Tegenwoordig is bekend dat alleen stromelysin-1 betrokken is bij het pathologische proces bij artrose. In het synoviale membraan van patiënten met artrose niet bepaald stromelysine-2, maar wordt in kleine hoeveelheden in synoviale fibroblasten van patiënten met reumatoïde artritis. Stromelysin-3 wordt ook gevonden in de synoviale membraan van patiënten met reumatoïde artritis nabij de fibroblasten, vooral in fibrosezones.

In de groep van gelatinasen in menselijk kraakbeenweefsel die slechts twee - 92 kDa gelatinase (gelatinase B of MMP-9) en 72 kDa gelatinase (gelatinase A of MMP-2); bij patiënten met artrose wordt een toename in het niveau van 92 kD gelatinase bepaald.

Nog niet zo lang geleden werd een andere groep MMP's geïdentificeerd die gelokaliseerd zijn op het oppervlak van celmembranen en die MMP-membraantype (MMP-MT) worden genoemd. Tot deze groep behoren vier enzymen - MMP-MT1-MMP-MT-4. MMP-MT-expressie wordt gevonden in het menselijke gewrichtskraakbeen. Hoewel MMP-MT-1 de eigenschappen van collagenase bezit, zijn zowel MMP-MT-1 en MMP-MT-2 in staat om gelatinase-72 kD en collagenase-3 te activeren. De rol van deze groep MMP in de pathogenese van OA vereist verfijning.

Proteinasen worden uitgescheiden in de vorm van een zymogeen, dat wordt geactiveerd door andere proteïnasen of organische kwikverbindingen. De katalytische activiteit van MMP hangt af van de aanwezigheid van zink in de actieve zone van het enzym.

De biologische activiteit van MMP wordt gecontroleerd door specifieke TIMP's. Tot op heden zijn drie typen TIMP geïdentificeerd die worden gevonden in de menselijke articulaire weefsels, TIMP-1-TIMP-3. Het vierde type TIMP wordt geïdentificeerd en gekloond, maar het is nog niet gedetecteerd in de menselijke articulaire weefsels. Deze moleculen binden specifiek aan de actieve plaats van MMP, hoewel sommige daarvan kunnen de actieve plaats van 72 kDa progelatinase (TIMP-2, -3, -4) en 92 kDa progelatinase binden (TIMP-1 en -3). De gegevens tonen dat de OA gewrichtskraakbeen in een onbalans tussen MMP's en TIMP die resulteert in een relatief tekort aan remmers die gedeeltelijk kan worden gerelateerd aan verhoogde MMP-activiteit in het weefsel. TIMP-1 en -2 worden gevonden in gewrichtskraakbeen, ze worden gesynthetiseerd door chondrocyten. Met artrose in het synoviaal membraan en gewrichtsvloeistof is alleen het eerste type TIMP gedetecteerd. TIMP-3 wordt uitsluitend in de ECM gedetecteerd. TIMP-4 heeft een bijna identieke aminozuursequentie met TIMP-2 en -ZINA van ongeveer 38% -STIMP-1 met bijna 50%. In andere doelwitcellen is TIMP-4 verantwoordelijk voor het moduleren van activering van 72 kD-progestogenase op het celoppervlak, wat een belangrijke rol aangeeft als een weefselspecifieke regulator van ECM-hermodellering.

Een ander mechanisme voor het regelen van de biologische activiteit van MMP is hun fysiologische activering. Aangenomen wordt dat enzymen uit de familie van serine en cysteïne proteasen, zoals respectievelijk AP / plasmine en cathepsine B, fysiologische activatoren van MMP zijn. In het gewrichtskraakbeen van patiënten met artrose, werd een verhoogd niveau van urokinase (UAP) en plasmine gedetecteerd.

Ondanks het feit dat verschillende soorten cathepsines worden aangetroffen in de gewrichtsweefsels, wordt cathepsine-B beschouwd als de meest waarschijnlijke activator van MMP in kraakbeen. In de weefsels van het menselijke gewricht werden fysiologische remmers van serine en cysteïne proteasen gedetecteerd. De activiteit van de remmer AP-1 (IAP-1), evenals cysteïneproteasen, is verminderd bij patiënten met artrose. Net als MMP / TIMP is het de onbalans tussen serine en cysteïne proteasen en hun remmers die de verhoogde MMP-activiteit in het gewrichtskraakbeen van patiënten met artrose kunnen verklaren. Bovendien kunnen MMP's elkaar activeren. Bijvoorbeeld activeert stromelysine-1 collagenase-1, collagenase-3 en gelatinase 92 kD; Collagenase-3 activeert 92 kD gelatinase; MMP-MT activeert collagenase-3 en gelatinase-72 kD versterkt deze activering; MMP-MT activeert ook 72 kD gelatinase. Cytokines kunnen worden onderverdeeld in drie groepen: destructieve (pro-inflammatoire), regulerende (waaronder anti-inflammatoire) en anabole (groeifactoren).

Typen cytokinen (volgens van den Berg WB et al)

Vernietigend	Interleukine-1 TNF-alpha Leukemie-remmende factor Interleukine-17
Regelgevende	Interleukine-4 Interleukine-10 Interleukine-13 Enzym-remmers
Anabole	Msulin-achtige groeifactoren TFR-b Botmorfogenetische eiwitten Morfogenetische eiwitten afgeleid van kraakbeen

Destructief cytokinen, vooral IL-1 geïnduceerde toename in de afgifte van proteasen en remmen de synthese van proteoglycanen en collagenen chondrocyten. Regulerende cytokinen, vooral IL-4 en -10, remmen de productie van IL-1 receptor antagonist, de productie van IL-1 (IL-1 RA) verhogen en verlagen van het niveau en NO-synthase activiteit in chondrocyten. Aldus IL-4 antagoniseert IL-1 op drie manieren: 1) vermindert de productie en voorkomt de effecten 2) verhoogt de productie van basis "scavenger" IL-1 Pa en 3) vermindert de productie van primaire secundaire "messenger» NO. Bovendien vermindert IL-4 enzymatische weefselafbraak. In vivo-omstandigheden wordt het optimale therapeutische effect bereikt met de combinatie van IL-4 en IL-10. Anabole factoren, zoals kakTFR-p en IGF-1, niet echt interfereren met de productie of werking van IL-1, maar toont de omgekeerde activiteit, bijvoorbeeld het stimuleren van de synthese van proteoglycan en collageen, remt proteaseactiviteit en TGF (3, remt eveneens de afgifte van enzymen en stimuleert hun remmers.

Pro-inflammatoire cytokines zijn verantwoordelijk voor de verhoogde synthese en expressie van MMP in de gewrichtsweefsels. Ze worden gesynthetiseerd in het synoviale membraan en diffunderen vervolgens in het gewrichtskraakbeen door de synoviale vloeistof. Pro-inflammatoire cytokines activeren chondrocyten, die op hun beurt ook pro-inflammatoire cytokines kunnen produceren. In de gewrichten aangetast door osteoartrose wordt de rol van de effector van ontsteking voornamelijk gespeeld door de cellen van het synoviaal membraan. Het is de synovitis van het macrofaag-type die proteasen en inflammatoire mediatoren uitscheiden. Onder hen zijn, in de pathogenese van osteoartritis, IL-f, TNF-a, IL-6, leukemisch remmende factor (LIF) en IL-17 het meest betrokken.

Biologisch actieve stoffen die articulaire kraakbeenafbraak bij osteoartritis stimuleren

• Interleukine-1
• Interleukine-3
• Interleukine-4
• TNF-alpha
• Kolonie-stimulerende factoren: macrofaag (monocytisch) en granulocyten-macrofaag
• Stof P
• PGE ₂
• Activatoren van plasminogeen (weefsel- en urokinase-typen) en plasmine
• Metalloproteasen (collagenasen, ellastasen, stromelysins)
• Cathepsins A en B
• Thriller
• Bacteriële lipopolysacchariden
• Fosfolipase Ag

De literatuurgegevens wijzen erop dat IL-ip en mogelijk TNF-a de belangrijkste bemiddelaars zijn van de vernietiging van articulaire weefsels bij osteoartritis. Het is echter nog steeds niet bekend of ze onafhankelijk van elkaar werken of dat er een functionele hiërarchie tussen bestaat. Op modellen van osteoartritis bij dieren werd aangetoond dat IL-1 blokkade effectief voorkomt de vernietiging van gewrichtskraakbeen, dat blokkade van TNF-alfa leidt tot een verzwakking van ontsteking in gewrichtsweefsels. In de synoviale membraan, synoviale vloeistof en kraakbeen van patiënten, werden verhoogde concentraties van beide cytokines gedetecteerd. De chondrocyten kunnen de synthese van niet alleen proteasen (MMPs en vooral AP) maar ook mindere collagenen verhogen, zoals type I en III, alsmede de synthese van collageen type II en IX en proteoglycanen verlagen. Deze cytokinen stimuleren ook actief zuurstofspecies en inflammatoire mediatoren zoals PGE ₂. Het resultaat van dergelijke macromoleculaire veranderingen in gewrichtskraakbeen met osteoartritis is de inefficiëntie van herstelprocessen, wat leidt tot verdere afbraak van het kraakbeen.

De bovengenoemde pro-inflammatoire cytokines moduleren de processen van remming / activering van MMP bij osteoartritis. Bijvoorbeeld kan het evenwicht tussen de voor TIMP-1 en MMP in kraakbeen in osteoarthritis worden bemiddeld door IL-ip, omdat de studie in vitro aangetoond dat verhoogde concentraties van IL-1-beta vermindert de concentratie van TIMP-1 en MMP verhoogde synthese van chondrocyten. Synthese van AP wordt ook gemoduleerd door IL-1 beta. Stimulatie van gewrichtskraakbeenchondrocyten in vitro met behulp van IL-1 veroorzaakt een dosis-afhankelijke toename in AP-synthese en een sterke afname in de synthese van IAP-1. Het vermogen van IL-1 om de synthese van IAP-1 te verminderen en de synthese van AP te stimuleren is een krachtig mechanisme voor het genereren van plasmine en de activering van MMP. Bovendien is plasmine niet alleen een enzym dat andere enzymen activeert, het neemt ook deel aan het proces van afbraak van kraakbeen door directe proteolyse.

IL-ip wordt gesynthetiseerd als een inactieve precursor massa 31 kD (pre-IL-ip), AZAT, na splitsing van de signaalpeptide, wordt omgezet in de actieve cytokine van het gewicht van 17,5 kD. In de weefsels van de gewrichten, met inbegrip van het synoviale membraan en gewrichtsvocht van gewrichtskraakbeen, IL-ip gedetecteerd in actieve vorm en in studies in vivo werd aangetoond dat het synoviale membraan artrose scheiden deze cytokine. Sommige serineproteasen zijn in staat om pre-IL-ip in zijn biologisch actieve vorm om te zetten. In zoogdieren zijn dergelijke eigenschappen in één protease dat behoort tot de familie van cysteine aspartatspetsificheskih enzymen genaamd IL-1p-omzettend enzym (IKF of caspase-1). Dit enzym is in staat om pre-IL-ip specifiek om te zetten in een biologisch actief "volwassen" IL-ip met een massa van 17,5 kD. IKF is een pro-enzym met een molecuulmassa van 45 kD (p45), die in het celmembraan is gelokaliseerd. Na proteolytische splitsing van proenzym p45 om twee subeenheden te vormen, bekend als p10 en p20, die worden gekarakteriseerd door enzymatische activiteit.

TNF-a wordt ook gesynthetiseerd als een membraangebonden voorloper met een massa van 26 kD; door proteolytische splitsing wordt het uit de cel vrijgemaakt als een actieve oplosbare vorm met een massa van 17 kD. Proteolytische splitsing wordt uitgevoerd door het TNF-a-converting enzyme (TNF-KF), dat behoort tot de familie van adamalysines. AR Amin en co-auteurs (1997) vonden verhoogde expressie van TNF-CF-mRNA in het gewrichtskraakbeen van patiënten met artrose.

De biologische activering van chondrocyten en synovitocyten IL-1 en TNF-a wordt gemedieerd door binding aan specifieke receptoren op het oppervlak van cellen - IL-R en TNF-R. Voor elk cytokine werden twee typen receptoren geïdentificeerd: IL-IP van typen I en II en TNF-P I (p55) en II (p75). Voor de transmissie van signalen in de cellen van de gewrichtsweefsels reageren IL-1PI en p55. IL-1P type I heeft een enigszins hogere affiniteit voor IL-1beta dan voor IL-1a; IL-1P type II - in tegendeel, heeft een grotere affiniteit voor IL-1a dan voor IL-ip. Het blijft onduidelijk of IL-IP II type II IL-1-signalen kan mediëren of het dient alleen om competitief IL-1-binding aan het IL-1PI-type te remmen. In hondroiitah en synoviale fibroblasten van patiënten met osteoartritis zoeken een grote hoeveelheid IL-1PI en p55, dat op zijn beurt verklaart de hoge gevoeligheid van deze cellen op stimulatie door cytokinen betrokken. Dit proces leidt zowel tot een toename van de secretie van proteolytische enzymen als tot de vernietiging van gewrichtskraakbeen.

Het is niet uitgesloten de deelname van IL-6 aan het pathologische proces bij artrose. Deze aanname is gebaseerd op de volgende opmerkingen:

• IL-6 verhoogt het aantal ontstekingscellen in de synoviale membraan,
• IL-6 stimuleert de proliferatie van chondrocyten,
• IL-6 verhoogt de effecten van IL-1 bij het verhogen van de synthese van MMP en het remmen van de synthese van proteoglycanen.

Echter, IL-6 kan de productie van TIMP induceren, maar heeft geen invloed op de productie van MMP's wordt dan ook aangenomen dat dit cytokine betrokken is bij het proces van beheersing van proteolytische afbraak van het gewrichtskraakbeen die niet door een feedbackmechanisme wordt uitgevoerd.

Andere vertegenwoordiger van de IL-6 familie is de LIF - cytokine dat wordt geproduceerd door chondrocyten verkregen van patiënten met artrose, in reactie op stimulatie door pro-inflammatoire cytokines IL-ip en TNF-a. LIF stimuleert de resorptie van proteoglycanen van kraakbeen, evenals de synthese van MMP- en NO-productie. De rol van dit cytokine bij artrose is niet volledig duidelijk.

IL-17 is een 20-30 kD homodimeer met IL-1-achtige werking, maar veel minder uitgesproken. IL-17 stimuleert de synthese en isolatie van een aantal pro-inflammatoire cytokinen, waaronder IL-ip, TNF-a, IL-6 en MMP in doelwitcellen, bijvoorbeeld in humane macrofagen. Bovendien stimuleert IL-17 NO-productie met chondrocyten. Net als het LIF, is de rol van IL-17 in de pathogenese van OA weinig bestudeerd.

Anorganisch vrije radicalen NO speelt een belangrijke rol bij de afbraak van gewrichtskraakbeen met OA. Chondrocyten verkregen van patiënten met artrose produceren meer NO zowel spontaan als na stimulatie met pro-inflammatoire cytokines in vergelijking met normale cellen. Een hoog NO-gehalte wordt gevonden in de synoviale vloeistof en het serum van patiënten met osteoartritis - het resultaat van verhoogde expressie en synthese van geïnduceerde NO-synthase (hNOC), een enzym dat verantwoordelijk is voor NO-productie. Onlangs werd het DNA van chondrocyt-specifiek hNOC gekloneerd, de aminozuursequentie van het enzym werd bepaald. De aminozuursequentie geeft een identiteit van 50% en een overeenkomst van 70% met hNOC specifiek voor het endotheel en neuraal weefsel aan.

NO remt de synthese van macromoleculen van ECM van gewrichtskraakbeen en stimuleert de synthese van MMP. Bovendien gaat een toename in NO-productie gepaard met een afname in de synthese van de antagonist IL-IP (IL-1RA) door chondrocyten. Aldus leidt een verhoging van het niveau van IL-1 en een afname van IL-1 RA tot hyperstimulatie van NO-chondrocyten, wat op zijn beurt leidt tot verhoogde afbraak van de kraakbeenmatrix. Er zijn meldingen geweest van een therapeutisch effect in vivo van een selectieve hNOC-remmer op de progressie van experimentele osteoartritis.

Natuurlijke cytokineremmers kunnen de binding van cytokinen aan de receptoren van celmembranen direct remmen, waardoor hun pro-inflammatoire activiteit wordt verminderd. Natuurlijke remmers van cytokinen kunnen volgens hun werkingswijze in drie klassen worden verdeeld.

De eerste klasse van remmers omvatten receptorantagonisten, die binding van het ligand aan zijn receptor door concurrentie voor de bindingsplaats voorkomen. Tot op heden wordt een dergelijke remmer alleen gevonden voor IL-1 - dit is de bovengenoemde competitieve remmer van het IL-1 / ILIP IL-1 PA-systeem. IL-1 RA blokkeert veel van de effecten die worden waargenomen in de weefsels van de gewrichten artrose, waaronder de synthese van prostaglandinen door synoviale cellen, de productie van collagenase door chondrocyten en afbraak van gewrichtskraakbeen in het kabinet.

IL-1PA wordt in verschillende vormen gedetecteerd: één oplosbaar (rIL-1PA) en twee intercellulair (μIL-lPAI en μIL-1APAP). De affiniteit van de oplosbare vorm van IL-1RA is 5 maal die van intercellulaire vormen. Ondanks de intensieve wetenschappelijke zoektocht, blijft de functie van de laatste onbekend. Eksperimety in vitro hebben aangetoond dat remming van IL-1-beta activiteit vereiste concentratie van IL-1Pa 10-100 maal de limieten van de omstandigheden in vivo vereist duizendvoudig verhoging van de concentratie van IL-1Pa. Dit feit kan de relatieve deficiëntie van IL-1 RA en het teveel aan IL-1 in de synovia van patiënten met artrose gedeeltelijk verklaren.

De tweede klasse van natuurlijke remmers van cytokinen wordt weergegeven door oplosbare receptoren van cytokinen. Een voorbeeld van dergelijke remmers bij mensen die verband houden met de pathogenese van osteoartrose is pIL-1P en pp55. Oplosbare cytokinereceptoren zijn afgeknotte vormen van normale receptoren door binding aan het cytokine, voorkomen ze hun binding aan membraangebonden receptoren doelcellen kan met een mechanisme competitief antagonisme.

De belangrijkste voorloper van oplosbare receptoren is membraangebonden IL-1PP. De affiniteit van rIL-IP met betrekking tot IL-1 en IL-1 PA is anders. Aldus heeft pIL-1PH een grotere affiniteit voor IL-1p dan voor IL-1 PA, en pIL-1PI vertoont een grotere affiniteit voor IL-1RA dan voor IL-ip.

Voor TNF zijn er ook twee soorten oplosbare receptoren - pp55 en pp75, zoals oplosbare IL-1-receptoren, ze worden gevormd door "schoffelen" (storten). In vivo worden beide receptoren gevonden in de weefsels van de aangetaste gewrichten. De rol van oplosbare TNF-receptoren in de pathogenese van osteoartritis wordt besproken. Er wordt gesuggereerd dat ze in lage concentraties de driedimensionale structuur van TNF stabiliseren en de halfwaardetijd van het bioactieve cytokine verhogen, terwijl hoge concentraties van pp55 en pp75 de TNF-activiteit door competitief antagonisme kunnen verminderen. Blijkbaar kan pp75 fungeren als een drager van TNF, wat de binding ervan aan de membraan-geassocieerde receptor vergemakkelijkt.

De derde klasse van natuurlijke remmers van cytokinen wordt weergegeven door een groep anti-inflammatoire cytokinen, die TGF-bèta, IL-4, IL-10 en IL-13 omvatten. Ontstekingsremmende cytokines verminderen de productie van pro-inflammatoire, evenals enkele proteasen, stimuleren de productie van IL-1RA en TIMP.