Rol van enzymen en cytokinen in de pathogenese van artrose

De laatste jaren is er veel aandacht van onderzoekers besteed aan het identificeren van proteasen die verantwoordelijk zijn voor de afbraak van de ECM van het gewrichtskraakbeen bij artrose. Volgens moderne concepten spelen matrixmetalloproteasen (MMP's) een belangrijke rol in de pathogenese van artrose. Bij patiënten met artrose wordt een verhoogd niveau van drie MMP's gedetecteerd: collagenasen, stromelysinen en gelatinasen. Collagenase is verantwoordelijk voor de afbraak van natief collageen, stromelysine - type IV collageen, proteoglycanen en laminine, gelatinase - voor de afbraak van gelatine, collageen IV, Vh XI-typen, en elastine. Daarnaast wordt de aanwezigheid van een ander enzym - aggrecanase, dat de eigenschappen van MMP's heeft en verantwoordelijk is voor de proteolyse van kraakbeenproteoglycaanaggregaten, verondersteld.

Drie typen collagenasen zijn geïdentificeerd in menselijk gewrichtskraakbeen, waarvan de niveaus significant verhoogd zijn bij patiënten met artrose: collagenase-1 (MMP-1), collagenase-2 (MMP-8) en collagenase-3 (MMP-13). Het naast elkaar bestaan van drie verschillende typen collagenasen in gewrichtskraakbeen suggereert dat elk van hen zijn eigen specifieke rol speelt. Inderdaad, collagenasen-1 en -2 zijn voornamelijk gelokaliseerd in de oppervlakkige en bovenste tussenliggende zone van gewrichtskraakbeen, terwijl collagenase-3 wordt gevonden in de onderste tussenliggende zone en in de diepe zone. Bovendien toonden de resultaten van immunohistochemisch onderzoek aan dat naarmate artrose vordert, het niveau van collagenase-3 een plateau bereikt en zelfs afneemt, terwijl het niveau van collagenase-1 geleidelijk toeneemt. Er zijn aanwijzingen dat bij artrose collagenase-1 voornamelijk betrokken is bij het ontstekingsproces in gewrichtskraakbeen, terwijl collagenase-3 betrokken is bij weefselremodellering. Collageenase-3, dat voorkomt in het kraakbeen van patiënten met artrose, breekt collageen type II intensiever af dan collageenase-1.

Van de vertegenwoordigers van de tweede groep metalloproteasen zijn er drie geïdentificeerd in humaan stromelysine: stromelysine-1 (MMP-3), stromelysine-2 (MMP-10) en stromelysine-3 (MMP-11). Tegenwoordig is bekend dat alleen stromelysine-1 betrokken is bij het pathologische proces bij artrose. Stromelysine-2 wordt niet aangetroffen in het synoviaalmembraan van patiënten met artrose, maar wel in zeer kleine hoeveelheden in de synoviale fibroblasten van patiënten met reumatoïde artritis. Stromelysine-3 wordt ook aangetroffen in het synoviaalmembraan van patiënten met reumatoïde artritis, in de buurt van fibroblasten, met name in de fibrosezones.

In de groep gelatinases in menselijk kraakbeenweefsel zijn er slechts twee geïdentificeerd: 92 kD gelatinase (gelatinase B, of MMP-9) en 72 kD gelatinase (gelatinase A, of MMP-2). Bij patiënten met artrose wordt een verhoogd niveau van 92 kD gelatinase vastgesteld.

Onlangs is een andere groep MMP's geïdentificeerd die zich op het oppervlak van celmembranen bevinden en membraantype MMP's (MMP-MT) worden genoemd. Deze groep omvat vier enzymen: MMP-MT1 en MMP-MT-4. De expressie van MMP-MT is aangetroffen in menselijk gewrichtskraakbeen. Hoewel MMP-MT-1 collageenase-eigenschappen heeft, zijn beide enzymen MMP-MT-1 en MMP-MT-2 in staat om gelatinase-72 kDa en collageenase-3 te activeren. De rol van deze groep MMP's in de pathogenese van artrose vereist opheldering.

Proteïnasen worden uitgescheiden in de vorm van een zymogeen, dat geactiveerd wordt door andere proteïnasen of organische kwikverbindingen. De katalytische activiteit van MMP's is afhankelijk van de aanwezigheid van zink in de actieve zone van het enzym.

De biologische activiteit van MMP's wordt gereguleerd door specifieke TIMP's. Tot op heden zijn er drie soorten TIMP's geïdentificeerd die voorkomen in menselijk gewrichtsweefsel: TIMP-1–TIMP-3. Een vierde type TIMP is geïdentificeerd en gekloond, maar is nog niet gedetecteerd in menselijk gewrichtsweefsel. Deze moleculen binden specifiek aan de actieve plaats van MMP's, hoewel sommige ervan ook kunnen binden aan de actieve plaats van 72 kD progelatinase (TIMP-2, -3, -4) en 92 kD progelatinase (TIMP-1 en -3). Er zijn aanwijzingen dat er bij artrose een onevenwicht is tussen MMP's en TIMP's in gewrichtskraakbeen, wat resulteert in een relatief tekort aan remmers, mogelijk deels te wijten aan een toename van het aantal actieve MMP's in het weefsel. TIMP-1 en -2 worden aangetroffen in gewrichtskraakbeen en worden gesynthetiseerd door chondrocyten. Bij artrose wordt alleen type I TIMP gedetecteerd in het synoviaalmembraan en de synoviale vloeistof. TIMP-3 wordt uitsluitend aangetroffen in de ECM. TIMP-4 deelt bijna 50% van zijn aminozuursequentie met TIMP-2 en 38% met TIMP-1. In andere doelcellen is TIMP-4 verantwoordelijk voor het moduleren van de activering van 72 kD progelatinase op het celoppervlak, wat wijst op een belangrijke rol als weefselspecifieke regulator van ECM-remodellering.

Een ander mechanisme voor het reguleren van de biologische activiteit van MMP's is hun fysiologische activering. Aangenomen wordt dat enzymen uit de serine- en cysteïneproteasefamilie, zoals respectievelijk AP/plasmine en cathepsine B, fysiologische activatoren van MMP's zijn. Verhoogde niveaus van urokinase (uAP) en plasmine zijn aangetroffen in het gewrichtskraakbeen van patiënten met artrose.

Ondanks het feit dat verschillende soorten cathepsines in gewrichtsweefsels worden aangetroffen, wordt cathepsine-B beschouwd als de meest waarschijnlijke activator van MMP's in kraakbeen. Fysiologische remmers van serine- en cysteïneproteasen zijn aangetroffen in menselijk gewrichtsweefsel. De activiteit van de AP-1-remmer (IAI-1), evenals cysteïneproteasen, is verminderd bij patiënten met artrose. Net als bij MMP/TIMP is het de disbalans tussen serine- en cysteïneproteasen en hun remmers die de verhoogde activiteit van MMP's in het gewrichtskraakbeen van patiënten met artrose kan verklaren. Bovendien kunnen MMP's elkaar activeren. Zo activeert stromelysine-1 collagenase-1, collagenase-3 en 92 kD gelatinase; collagenase-3 activeert 92 kD gelatinase; MMP-MT activeert collagenase-3 en gelatinase-72 kDa potentieert deze activering; MMP-MT activeert ook gelatinase 72 kDa. Cytokinen kunnen worden onderverdeeld in drie groepen: destructieve (ontstekingsbevorderende), regulerende (inclusief ontstekingsremmende) en anabole (groeifactoren).

Soorten cytokines (volgens van den Berg WB et al)

Destructief	Interleukine-1 TNF-a Leukemie-remmende factor Interleukine-17
Regelgevend	Interleukine-4 Interleukine-10 Interleukine-13 Enzymremmers
Anabole	Mnsulin-achtige groeifactoren TGF-b Botmorfogenetische eiwitten Morfogenetische eiwitten afkomstig van kraakbeen

Destructieve cytokinen, met name IL-1, induceren een verhoogde proteasenafgifte en remmen de synthese van proteoglycanen en collageen door chondrocyten. Regulerende cytokinen, met name IL-4 en -10, remmen de IL-1-productie, verhogen de productie van de IL-1-receptorantagonist (IL-1RA) en verlagen de NO-synthasespiegel in chondrocyten. IL-4 werkt IL-1 dus in drie richtingen tegen: 1) vermindert de productie en voorkomt de effecten ervan, 2) verhoogt de productie van de belangrijkste "scavenger" IL-1RA en 3) vermindert de productie van de belangrijkste secundaire "boodschapper" NO. Bovendien vermindert IL-4 de enzymatische afbraak van weefsel. In vivo wordt het optimale therapeutische effect bereikt met een combinatie van IL-4 en IL-10. Anabole factoren zoals TGF-β en IGF-1 interfereren niet daadwerkelijk met de productie of werking van IL-1, maar vertonen een tegenovergestelde activiteit. Ze stimuleren bijvoorbeeld de synthese van proteoglycanen en collageen, onderdrukken de activiteit van proteasen en TGF-β remt bovendien de afgifte van enzymen en stimuleert hun remmers.

Pro-inflammatoire cytokinen zijn verantwoordelijk voor een verhoogde synthese en expressie van MMP's in gewrichtsweefsels. Ze worden gesynthetiseerd in het synoviaalmembraan en diffunderen vervolgens via de synoviale vloeistof in het gewrichtskraakbeen. Pro-inflammatoire cytokinen activeren chondrocyten, die op hun beurt ook pro-inflammatoire cytokinen kunnen produceren. In gewrichten die zijn aangetast door artrose, spelen cellen van het synoviaalmembraan de rol van ontstekingsbevorderaar voornamelijk. Het zijn de macrofaagachtige synovocyten die proteasen en ontstekingsmediatoren afscheiden. IL-f, TNF-a, IL-6, leukemie-inhiberende factor (LIF) en IL-17 zijn hiervan het meest "betrokken" bij de pathogenese van artrose.

Biologisch actieve stoffen die de afbraak van gewrichtskraakbeen bij artrose stimuleren

• Interleukine-1
• Interleukine-3
• Interleukine-4
• TNF-a
• Koloniestimulerende factoren: macrofaag (monocyt) en granulocyt-macrofaag
• Substantie P
• PGE ₂
• Plasminogeenactivatoren (weefsel- en urokinase-typen) en plasmine
• Metalloproteasen (collagenasen, ellasasen, stromelysinen)
• Cathepsines A en B
• Trilsin
• Bacteriële lipopolysacchariden
• Fosfolipase Ag

Literatuurgegevens geven aan dat IL-1 en mogelijk TNF-a de belangrijkste mediatoren zijn van gewrichtsweefselvernietiging bij osteoartrose. Het is echter nog steeds onbekend of ze onafhankelijk van elkaar werken of dat er een functionele hiërarchie tussen hen bestaat. Diermodellen van osteoartrose hebben aangetoond dat IL-1-blokkade effectief de vernietiging van gewrichtskraakbeen voorkomt, terwijl TNF-a-blokkade alleen leidt tot een afname van ontsteking in gewrichtsweefsels. Verhoogde concentraties van beide cytokinen werden gevonden in het synoviaalmembraan, synoviaalvocht en kraakbeen van patiënten. In chondrocyten zijn ze in staat om de synthese van niet alleen proteasen (voornamelijk MMP en AP), maar ook minder belangrijke collagenen, zoals typen I en III, te verhogen en de synthese van collageen typen II en IX en proteoglycanen te verminderen. Deze cytokinen stimuleren ook reactieve zuurstofsoorten en ontstekingsmediatoren zoals PGE ₂. Het gevolg van dergelijke macromoleculaire veranderingen in het gewrichtskraakbeen bij artrose is dat de herstelprocessen niet meer effectief zijn, wat leidt tot verdere afbraak van het kraakbeen.

De bovengenoemde pro-inflammatoire cytokinen moduleren de processen van MMP-onderdrukking/-activering bij artrose. Zo kan de disbalans tussen TIMP-1- en MMP-niveaus in kraakbeen bij artrose mogelijk worden gemedieerd door IL-1, aangezien een in-vitrostudie heeft aangetoond dat een verhoging van de IL-1 bèta-concentratie leidt tot een verlaging van de TIMP-1-concentratie en een toename van de MMP-synthese door chondrocyten. AP-synthese wordt ook gemoduleerd door IL-1 bèta. In-vitrostimulatie van kraakbeenchondrocyten met IL-1 veroorzaakt een dosisafhankelijke toename van de AP-synthese en een scherpe afname van de iAP-1-synthese. Het vermogen van IL-1 om de iAP-1-synthese te verlagen en de AP-synthese te stimuleren, is een krachtig mechanisme voor plasminegeneratie en MMP-activering. Bovendien is plasmine niet alleen een enzym dat andere enzymen activeert, maar neemt het ook deel aan het proces van kraakbeenafbraak door directe proteolyse.

IL-ip wordt gesynthetiseerd als een inactieve precursor met een massa van 31 kD (pre-IL-ip) en vervolgens, na splitsing van het signaalpeptide, omgezet in een actief cytokine met een massa van 17,5 kD. In gewrichtsweefsels, waaronder het synoviaal membraan, synoviaal vocht en gewrichtskraakbeen, wordt IL-ip in een actieve vorm aangetroffen. In vivo-studies hebben aangetoond dat het synoviaal membraan bij osteoartrose dit cytokine kan afscheiden. Sommige serineproteasen kunnen pre-IL-ip omzetten in zijn bioactieve vorm. Bij zoogdieren werden dergelijke eigenschappen slechts aangetroffen in één protease, dat behoort tot de familie van cysteïne-aspartaat-specifieke enzymen en IL-1β-converterend enzym (ICF, of caspase-1) wordt genoemd. Dit enzym is in staat om pre-IL-ip specifiek om te zetten in biologisch actief "rijp" IL-ip met een massa van 17,5 kD. ICF is een 45 kD pro-enzym (p45) dat zich in het celmembraan bevindt. Na proteolytische splitsing van het p45 pro-enzym worden twee subeenheden gevormd, p10 en p20, die worden gekenmerkt door enzymatische activiteit.

TNF-α wordt ook gesynthetiseerd als een membraangebonden precursor met een massa van 26 kDa; door proteolytische splitsing komt het vrij uit de cel als een actieve, oplosbare vorm met een massa van 17 kDa. Proteolytische splitsing wordt uitgevoerd door TNF-α-converterend enzym (TNF-AC), dat behoort tot de adamalizinefamilie. AR Amin et al. (1997) vonden een verhoogde expressie van TNF-AC mRNA in het gewrichtskraakbeen van patiënten met artrose.

Biologische activering van chondrocyten en synovocyten door IL-1 en TNF-a wordt gemedieerd door binding aan specifieke receptoren op het celoppervlak: IL-R en TNF-R. Voor elk cytokine zijn twee typen receptoren geïdentificeerd: IL-IP-types I en II en TNF-R-types I (p55) en II (p75). IL-1PI en p55 zijn verantwoordelijk voor de signaaloverdracht in gewrichtsweefselcellen. IL-1R-type I heeft een iets hogere affiniteit voor IL-1β dan voor IL-1a; IL-1R-type II heeft daarentegen een hogere affiniteit voor IL-1a dan voor IL-ip. Het blijft onduidelijk of IL-IP type II IL-1-signalen kan mediëren of dat het alleen dient voor competitieve remming van de associatie van IL-1 met IL-1R type I. Chondroïtiden en synoviale fibroblasten van patiënten met osteoartrose bevatten grote hoeveelheden IL-1PI en p55, wat op zijn beurt de hoge gevoeligheid van deze cellen voor stimulatie door de corresponderende cytokines verklaart. Dit proces leidt tot zowel een verhoogde secretie van proteolytische enzymen als vernietiging van gewrichtskraakbeen.

De betrokkenheid van IL-6 bij het pathologische proces bij artrose kan niet worden uitgesloten. Deze aanname is gebaseerd op de volgende observaties:

• IL-6 verhoogt het aantal ontstekingscellen in het synoviaalmembraan,
• IL-6 stimuleert de proliferatie van chondrocyten,
• IL-6 versterkt de effecten van IL-1 door de MMP-synthese te verhogen en de proteoglycaansynthese te remmen.

IL-6 kan echter de productie van TIMP's induceren, maar heeft geen invloed op de productie van MMP's. Daarom wordt aangenomen dat dit cytokine betrokken is bij het proces van het remmen van de proteolytische afbraak van gewrichtskraakbeen, wat plaatsvindt via een feedbackmechanisme.

Een ander lid van de IL-6-familie is LIF, een cytokine geproduceerd door chondrocyten afkomstig van patiënten met artrose als reactie op stimulatie door de pro-inflammatoire cytokinen IL-1p en TNF-a. LIF stimuleert de resorptie van proteoglycanen in kraakbeen, evenals de synthese van MMP en de productie van NO. De rol van deze cytokine bij artrose is nog niet volledig opgehelderd.

IL-17 is een 20-30 kD homodimeer met een IL-1-achtig effect, maar veel minder uitgesproken. IL-17 stimuleert de synthese en afgifte van een aantal pro-inflammatoire cytokinen, waaronder IL-1p, TNF-a, IL-6 en MMP in doelcellen, zoals humane macrofagen. Daarnaast stimuleert IL-17 de NO-productie door chondrocyten. Net als LIF is de rol van IL-17 in de pathogenese van artrose nog nauwelijks onderzocht.

Het anorganische vrije radicaal NO speelt een belangrijke rol bij de afbraak van gewrichtskraakbeen bij artrose. Chondrocyten geïsoleerd van patiënten met artrose produceren zowel spontaan als na stimulatie met pro-inflammatoire cytokinen hogere hoeveelheden NO dan normale cellen. Een hoog NO-gehalte is aangetroffen in synoviaalvocht en serum van patiënten met artrose - dit is het gevolg van verhoogde expressie en synthese van geïnduceerde NO-synthase (hNOC), het enzym dat verantwoordelijk is voor de NO-productie. Onlangs is het DNA van chondrocyt-specifiek hNOC gekloond en is de aminozuursequentie van het enzym bepaald. De aminozuursequentie geeft 50% identiteit en 70% gelijkenis aan met hNOC specifiek voor endotheel en zenuwweefsel.

NO remt de synthese van macromoleculen van de ECM van gewrichtskraakbeen en stimuleert de synthese van MMP. Bovendien gaat een toename van de NO-productie gepaard met een afname van de synthese van de IL-IP-antagonist (IL-1RA) door chondrocyten. Een toename van de IL-1-spiegel en een afname van IL-1RA leiden dus tot hyperstimulatie van NO in chondrocyten, wat op zijn beurt leidt tot een verhoogde afbraak van de kraakbeenmatrix. Er zijn rapporten over het therapeutische effect in vivo van een selectieve hNOC-remmer op de progressie van experimentele artrose.

Natuurlijke cytokineremmers kunnen direct voorkomen dat cytokines zich binden aan celmembraanreceptoren, waardoor hun pro-inflammatoire activiteit afneemt. Natuurlijke cytokineremmers kunnen op basis van hun werkingsmechanisme worden onderverdeeld in drie klassen.

De eerste klasse remmers omvat receptorantagonisten die de binding van de ligand aan zijn receptor voorkomen door te concurreren om de bindingsplaats. Tot op heden is een dergelijke remmer alleen gevonden voor IL-1 – dit is de bovengenoemde competitieve remmer van het IL-1/ILIP-systeem, IL-1 PA. IL-1 PA blokkeert veel effecten die worden waargenomen in gewrichtsweefsels bij artrose, waaronder de synthese van prostaglandinen door synoviale cellen, de productie van collageenase door chondrocyten en de afbraak van BM van gewrichtskraakbeen.

IL-1RA wordt in verschillende vormen aangetroffen: één oplosbare (rIL-1RA) en twee intercellulaire vormen (μIL-lPAI en μIL-1RAP). De affiniteit van de oplosbare vorm van IL-1RA is vijf keer hoger dan die van de intercellulaire vormen. Ondanks intensief wetenschappelijk onderzoek blijft de functie van laatstgenoemde onbekend. In-vitro-experimenten hebben aangetoond dat remming van de activiteit van IL-1β een 10-100 keer hogere IL-1RA-concentratie vereist dan normaal, terwijl in vivo-omstandigheden een duizendvoudige verhoging van de IL-1RA-concentratie vereist. Dit feit kan mogelijk gedeeltelijk de relatieve deficiëntie van IL-1RA en de overmaat aan IL-1 in het synovium van patiënten met artrose verklaren.

De tweede klasse natuurlijke cytokineremmers zijn oplosbare cytokinereceptoren. Voorbeelden van dergelijke remmers bij mensen die verband houden met de pathogenese van artrose zijn rIL-1R en pp55. Oplosbare cytokinereceptoren zijn verkorte vormen van normale receptoren; wanneer ze zich binden aan cytokines, voorkomen ze hun binding aan membraangeassocieerde receptoren van doelcellen, door middel van competitief antagonisme.

De belangrijkste voorloper van oplosbare receptoren is membraangebonden IL-1RP. De affiniteit van rIL-IP voor IL-1 en IL-1RA is verschillend. Zo heeft rIL-1RN een hogere affiniteit voor IL-1β dan voor IL-1RA, en vertoont rIL-1PI een hogere affiniteit voor IL-1RA dan voor IL-ip.

Er zijn ook twee soorten oplosbare receptoren voor TNF: pp55 en pp75. Net als oplosbare IL-1-receptoren worden ze gevormd door "afscheiding". In vivo worden beide receptoren aangetroffen in de weefsels van aangetaste gewrichten. De rol van oplosbare TNF-receptoren in de pathogenese van artrose is onderwerp van discussie. Aangenomen wordt dat ze in lage concentraties de driedimensionale structuur van TNF stabiliseren en de halfwaardetijd van de bioactieve cytokine verlengen, terwijl hoge concentraties van pp55 en pp75 de TNF-activiteit kunnen verminderen door competitief antagonisme. Waarschijnlijk kan pp75 fungeren als een TNF-drager en de binding ervan aan de membraangeassocieerde receptor vergemakkelijken.

De derde klasse natuurlijke cytokineremmers wordt vertegenwoordigd door een groep ontstekingsremmende cytokinen, waaronder TGF-bèta, IL-4, IL-10 en IL-13. Ontstekingsremmende cytokinen verminderen de productie van pro-inflammatoire en sommige proteasen en stimuleren de productie van IL-1RA en TIMP.