Diagnose van herpes

De diagnose van herpes berust op klassieke isolatie van het virus op gevoelige celculturen, immunofluorescentie- en serologische methoden, colposcopisch onderzoek en het gebruik van moderne moleculair-biologische methoden (PCR, dot-hybridisatie), waarmee de hele groep herpesvirussen, inclusief de typen HHV-6 en HHV-7, kan worden gediagnosticeerd.

Laboratoriumdiagnostische methoden voor herpesinfectie

De belangrijkste methoden die gericht zijn op het isoleren van HSV of het detecteren van virusdeeltjes en/of hun componenten	Hulpmethoden gericht op het detecteren van antilichamen tegen HSV in biologische vloeistoffen van het menselijk lichaam
Isolatie van HSV in gevoelige cel- en dierculturen Directe en immuun elektronenmicroscopie Directe en indirecte varianten van de IPA IFA Moleculair biologische methoden Latex-agglutinatiereactie	Neutralisatiereactie RSC Bepaling van antilichamen tegen niet-structurele eiwitten van HSV-1,2

Genitale herpes (GH) wordt bij 76% van de patiënten veroorzaakt door HSV-2 en bij 24% door HSV-1. Bovendien kwam GH als mono-infectie slechts bij 22% van de patiënten voor, terwijl in 78% van de gevallen microbiële associaties werden aangetoond. Bij 46% van de personen werd parasitocenose door twee pathogenen vastgesteld, waaronder chlamydia in 40% van de gevallen. Gardnerella, Trichomonas en gonokokken werden minder vaak in uitstrijkjes aangetroffen.

Bij 27% van de patiënten werd de parasitocenose veroorzaakt door drie pathogenen, bij 5,2% door vier pathogenen. Bovendien werd een combinatie van chlamydia met gardnerella en Candida-schimmels het vaakst waargenomen. Deze gegevens onderbouwen de noodzaak van grondig bacteriologisch onderzoek bij patiënten met GH om combinaties van pathogenen te identificeren, evenals een diepgaande studie van de pathogenese van gemengde infecties van het urogenitale kanaal, wat een gedifferentieerde, complexe behandeling van herpesinfecties mogelijk maakt.

Materialen bestudeerd voor de isolatie van HSV afhankelijk van de lokalisatie van herpesletsels

Lokalisatie van laesies	Inhoud van de blaasjes	Celschrapen				CSF	Bronchiale aspiratie	Biopsie	Bloed
		1	2	3	4
Leer	+								+
Ogen			+						+
Geslachtsdelen				+					+
Anus	+				+				+
Mond	+	+							+
CZS	+					+		+	+
Longen		+					+		+
Lever								+	+
Aangeboren herpes	+	+	+				+		+

Methoden voor laboratoriumdiagnostiek van cytomegalovirusinfectie

Methoden	Benodigde tijd om resultaten te verkrijgen	Notities
VIROLOGISCHE
Elektronenmicroscopie	3 uur	Niet erg toegankelijk
Virusisolatie in celkweek (VCI)	4-20 dagen	Standaard, Langzaam
Immunofluorescentiekleuring van vroege AG met behulp van monoklonale antilichamen	6 uur	Minder specifiek
CYTOLOGISCHE	2-3 uur	Minder specifiek
SEROLOGISCHE
RSC	2 dagen	Standaard
RGA	1 dag	Arbeidsintensief
RIF	6 uur	Eenvoudig, specifiek
NRIF	6 uur	Moeilijk
RIMP	6 uur	Moeilijk
ELISA (IgM, DO)	6 uur	Snel, eenvoudig
Immunoblot	6 uur	Duur
MOLECULAIR BIOLOGISCH
MG	5-7 dagen	Duur, arbeidsintensief
PCR	3 uur	Duur

Methoden voor diagnostiek van het herpes zostervirus

Diagnostische methoden	Laboratoriumtechnieken
INDIRECT
Selectie	Weefselkweek, kippenembryo's, proefdieren, co-cultuur met permissieve cellen of helpervirussen
Identificatie van isolaten	Neutralisatiereactie, RSC, IF, PIEF, reactie van isolaten, neerslag, agglutinatie, IF
DIRECT
Cytologie	Uitstrijkjes: kleurimmunofluorescentie
Histologie	Pathomorfologie van de cel
Structuur	Embryonale microscopie, immuno-elektronenmicroscopie
Bepaling van antigenen	ALS, PIEF, RIM, IFA
Bepaling van de lokale antilichaamproductie	Ig M, Ig G, Ig A: ELISA, RIA
Moleculair biologische benaderingen	Moleculaire hybridisatie, PCR

Laboratoriumdiagnostiek van infectie veroorzaakt door het herpes zostervirus

Diagnostische problemen	Methoden	Verwachte resultaten
Acute primaire infectie	1	Detectie binnen 2 uur
	2	Het aantal antilichamen stijgt langzaam
	3	Aanwezig 3 dagen na infectie
Acute gereactiveerde infectie	1	Detectie van UUU na 2 uur
	2	Het aantal antilichamen stijgt langzaam
	4	Aanwezig 4 dagen nadat de uitslag verschijnt

1. bepaling van veg-blaasjes in vloeistof;
2. serologie: CSC, ELISA, gericht op detectie
3. serologie: ELISA gericht op het detecteren van IgM;
4. serologie: ELISA gericht op het detecteren van IgA, IgM.

Methoden voor het aangeven van de immuunrespons op een herpes zoster-virusinfectie

Benadering	Methode
Detectie van een verhoging van de antilichaamtiter in de tweede sera	RSK, RTGA, RPGA, IF-neutralisatiereactie, RIM, ELISA
Detectie van Ig G-, Ig A-klasse-specifieke antilichamen in het eerste serummonster	ELISA, IF, RIM, latexagglutinatie

Interpretatie van de resultaten van serologisch onderzoek van patiëntensera op herpesvirusinfecties (ELISA)

Naam van de infectie/marker	Gemiddelde drempelwaarden voor infecties
	Resultaten van de analyse	Interpretatie
Cytomegalie Anti-CMV IgG (1-20 U/ml) Anti-CMV IgM (100-300%)	Positief 1-6 Positief 6-10 Positief >10 Negatief Positief 100-300 Negatief <90 Twijfelachtig 90-100	Remissie Exacerbatie van de ziekte Acute fase van de ziekte Geen infectie (ziekte) Acute fase van de ziekte Herhaal de analyse in 2-3 weken
Herpes simplex 1,2 serotypen Anti-HSV 1/2 totaal (100-900%)	Positief 100-400 Positief 400-800 Positief >800 Negatief <100	Remissie Exacerbatie van de ziekte Acute fase van de ziekte Geen infectie (ziekte)

In de tabel staan de belangrijkste methoden voor laboratoriumdiagnostiek van herpesvirusinfecties vermeld, evenals de aanbevolen biologische materialen die worden onderzocht bij het isoleren van HSV, rekening houdend met de lokalisatie van herpesletsels.

Betrouwbare isolatie van herpes simplex- en CMV-virussen door infectie van gevoelige celculturen. Zo werd tijdens virologisch onderzoek bij 26 patiënten tijdens de recidiefperiode in 23 gevallen (88,4%) HSV geïsoleerd op een gevoelige Vero-celcultuur. Geïnfecteerde culturen vertoonden een beeld van cytopathische werking, typisch voor HSV: de vorming van meerkernige reuzencellen of een accumulatie van afgeronde en vergrote cellen in de vorm van clusters. In 52,1% van de gevallen konden foci van cytopathische werking van het virus al 16-24 uur na infectie worden gedetecteerd. Na 48-72 uur incubatie van geïnfecteerde culturen steeg het percentage materialen dat specifieke celvernietiging veroorzaakte tot 87%. En slechts in 13% van de gevallen werden positieve resultaten 96 uur na infectie of later, of tijdens herhaalde passage, gedetecteerd.

Methoden voor laboratoriumdiagnostiek van gegeneraliseerde herpesinfectie

De belangrijkste methoden gericht op het detecteren (isoleren) van herpesvirussen, hun deeltjes en hun componenten	Hulpmethoden gericht op het detecteren van antilichamen tegen herpesvirussen in biologische vloeistoffen, het detecteren van enzymatische verschuivingen in bloedserum
Isolatie van herpesvirussen op gevoelige cel- en dierculturen Directe en immuun-elektronenmicroscopie Directe en indirecte varianten van de immunoperoxidasemethode Directe en indirecte varianten van de fluorescerende antilichaammethode Varianten van de vaste-fase-enzymimmunoassay Varianten van de moleculaire (DNA-DNA) hybridisatiemethode Polymerasekettingreactie Latexagglutinatiereactie	Neutralisatietest Complementbindingstest Latex-agglutinatietest Indirecte versie van de fluorescerende antilichaammethode Indirecte versie van de immunoperoxidasemethode Varianten van de vaste-fase-enzymimmunoassay Immuunblottingmethode Radiale complementbindingsmethode Bepaling van alanine- en aspartaataminotransferaseniveaus

Serologische methoden worden gebruikt om infectieuze mononucleosis (een infectie veroorzaakt door EBV) te diagnosticeren. De Paul-Bunnell-reactie met rode bloedcellen van een ram, een diagnostische titer van 1:28 of hoger in een enkelvoudige bloedserumtest, of een viervoudige toename van antilichamen bij onderzoek van gepaarde sera. De Hoff-Bauer-reactie met een 4%-suspensie van geformaliniseerde rode bloedcellen van een paard wordt gebruikt. De uitslag wordt na 2 minuten verwerkt; bij infectieuze mononucleosis is de reactie zeer specifiek.

Momenteel wordt een enzymimmunoassay (EIA)-methode ontwikkeld voor de diagnose van infectieuze mononucleosis infectiosa. Hierbij worden IgG- en IgM-antilichamen in het serum van de patiënt bepaald door incubatie met lymfoblasten die geïnfecteerd zijn met EBV, gevolgd door behandeling met fluorescerende antilichamen. In de acute fase van de ziekte worden antilichamen tegen het virale capside-antigeen bepaald in een titer van 1:160 en hoger.

Bij gebruik van een aantal geïmporteerde commerciële testsystemen kan ELISA het volgende detecteren: antilichamen tegen EBV-envelopantilichamen, antilichamen tegen EBV-vroegantigeen, totale antilichamen tegen EBV-vroegantigeen, bepaald in de acute fase van de ziekte, zowel in de celkern als in het cytoplasma, en beperkte antilichamen tegen vroegantigeen, bepaald in de acute fase van de ziekte, zowel in de celkern als in het cytoplasma, beperkte antilichamen tegen EBV-vroegantigeen, bepaald op het hoogtepunt van de ziekte, alleen in het cytoplasma, en antilichamen tegen EBV-kernantigeen. Het gebruik van deze testsystemen maakt differentiële diagnostiek mogelijk van een aantal ziekten die verband houden met EBV.

Na een positieve ELISA-test die antilichamen tegen EBV aantoont, wordt een bevestigende immunoblottingreactie uitgevoerd, die de aanwezigheid van antilichamen tegen afzonderlijke EBV-markereiwitten (p-eiwitten) bepaalt: p23, p54, p72 (de aanwezigheid van dit eiwit duidt op de mogelijkheid van EBV-reproductie), p138. Bovenstaande laboratoriummethoden worden ook gebruikt om de effectiviteit van de behandeling te controleren.

De gevoeligheid van virologische methoden is 85-100%, de specificiteit is 100% en de studietijd is 2-5 dagen. De directe immunofluorescentiemethode (DIF) met polyklonale of monoklonale antilichamen tegen HSV-1 en HSV-2 wordt vaak gebruikt in de praktijk. De DIF-methode is vrij gemakkelijk reproduceerbaar in een regulier klinisch laboratorium, is niet duur, de gevoeligheid is meer dan 80% en de specificiteit is 90-95%. Immunofluorescentiemicroscopie toonde de aanwezigheid van cytoplasmatische insluitsels, morfologische kenmerken en het percentage geïnfecteerde cellen in uitstrijkjes van de urethra, het cervixkanaal, de cervix en het rectum.

De PIF-methode geeft inzicht in de morfologische eigenschappen van cellen en veranderingen in de lokalisatie van HSV-antigenen. Naast directe tekenen van celschade door herpesvirussen (detectie van specifieke luminescentie), zijn er volgens PIF-gegevens ook indirecte tekenen van herpesinfectie:

• aggregatie van kernmaterie, loslating van het karyolemma;
• de aanwezigheid van zogenaamde ‘gat’-kernen, wanneer er slechts één karyolemma overblijft van de celkern;
• de aanwezigheid van intranucleaire insluitsels - Cowdry-lichaampjes.

Bij het uitvoeren van PIF krijgt de arts niet alleen een kwalitatieve, maar ook een kwantitatieve beoordeling van de toestand van de geïnfecteerde cellen. Deze beoordeling is gebruikt om de effectiviteit van de antivirale therapie met aciclovir (AC) te beoordelen. Zo werden 80 patiënten met eenvoudige genitale herpes (GH) onderzocht met behulp van de PIF-methode in de dynamiek. Er werd aangetoond dat, vóór de behandeling met aciclovir, 88% van de patiënten een hoog percentage geïnfecteerde cellen (50-75% en hoger) in uitstrijkjes had, na één kuur met aciclovir gezonde cellen werden aangetroffen in uitstrijkjes van 44% van de patiënten, in 31% van de gevallen werden enkelvoudige geïnfecteerde cellen aangetroffen en bij 25% van de patiënten tot 10% geïnfecteerde cellen.

Inhoud van geïnfecteerde cellen in uitstrijkjes (PIF-reactie) van patiënten met genitale herpes behandeld met aciclovir

Perioden van ziekte	Percentagegehalte in uitstrijkjes
	Geïnfecteerde cellen					Normale cellen
	Meer dan 75%	50-75%	40-50%	10%	Enkele cellen in het gezichtsveld
Terugval (vóór de behandeling)	25%	63%	12%
	(20)	(50)	(10)
Remissie (na behandeling)				25%	31%	44%
				(20)	(25)	(35)

Met behulp van PIF en de dot-hybridisatiemethode is al jarenlang vastgesteld dat de resultaten van het onderzoek in bijna 100% van de gevallen overeenkomen. Om de betrouwbaarheid van de herpesdiagnostiek te vergroten, met name bij subklinische en zwak manifeste vormen van herpes, is het raadzaam om 2-3 laboratoriumdiagnostische methoden te gebruiken, met name bij het onderzoeken van zwangere vrouwen, vrouwen met een ongunstige obstetrische voorgeschiedenis en personen met een niet-gespecificeerde gynaecologische diagnose.

Bij PCR-diagnostiek van virale en bacteriële infecties van het urogenitale stelsel is het daarom noodzakelijk om de verkregen positieve resultaten te evalueren, rekening houdend met de anamnese en de aanwezigheid (of afwezigheid) van specifieke klinische symptomen van de ziekte. Als chlamydia met PCR wordt vastgesteld, is de kans op infectie groot en kunnen de behandelingsproblemen dienovereenkomstig worden opgelost. Bij detectie van mycoplasma's (ureaplasma's), opportunistische micro-organismen, zijn aanvullende cultuurstudies nodig om de diagnose te bevestigen, d.w.z. het zaaien van materiaal van de patiënt op gevoelige celculturen. Pas als de cultuuranalyse positieve resultaten oplevert, kan er sprake zijn van laboratoriumbevestiging van de diagnose mycoplasmose. Dezelfde methode maakt het mogelijk om, indien nodig, de gevoeligheid van de geïsoleerde mycoplasma's voor veelgebruikte toedieningsvormen (antibiotica, fluorochinolonen, enz.) te bepalen.

Simultane infectie met meerdere virussen van de familie Herpesviridae is mogelijk. We ontdekten vaak een infectie van één patiënt met HSV-1, HSV-2 en CMV. Patiënten met klinische en laboratoriumverschijnselen van secundaire IDS (oncohematologische, oncologische, hiv-geïnfecteerde patiënten) waren significant vaker geïnfecteerd met meerdere herpesvirussen. Zo is aangetoond dat klinische en immunologische aandoeningen die progressie vertonen bij een hiv-infectie gepaard gaan met een toename van het aantal herpesvirussen dat wordt gedetecteerd met de moleculaire hybridisatiemethode. In dit geval kan de complexe, gelijktijdige detectie van HSV-1, CMV en HHV-6 DNA als meest prognostisch significant worden beschouwd.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ]