Embryonale stamcellen

De ontdekking van embryonale stamcellen - er was geen toeval, en verscheen op de voorbereide bodem onderzoek op het gebied van de ontwikkelingsbiologie onderzoek. De term 'stamcel' werd al in 1908 geïntroduceerd op het congres van de hematologische samenleving in Berlijn door Alexander Maksimov in verband met hematopoietische cellen. Lang voor de isolatie en bereiding van stabiele lijnen van pluripotente embryonale stamcellen in de vroege ontwikkeling van het onderzoeksproces gebruikte stam terato- (embryo-carcinoomcellen waarmee bestudeerde de onbekende mechanismen van embryogenese, zoals de volgorde van de expressie van vroege genen en eiwitproducten van hun werk.

Maar is de totipotentie van het menselijk genoom onherstelbaar verloren gegaan in het proces van evolutie? Nee, en embryogenese is bewijs. Als dit zo is, wanneer zal dan in principe het tweede pad van evolutionaire ontwikkeling worden gerealiseerd? Waarschijnlijk wanneer een persoon de Cosmos verlaat, waar de omgevingscondities relatief vrij lang zullen zijn. Botverlies (botontkalking in een gewichtsloze situatie) zeer langzaam vatbaar remodellering en regeneratie kan worden beschouwd als de eerste stap menselijke aanpassingsproces als species bestaan in de ruimte. De betaling voor het tweede pad van evolutionaire ontwikkeling zal echter anders zijn - steriliteit is de prijs die moet worden terugbetaald aan alle cellen van totipotentie en absolute plasticiteit. Dus vermenigvuldig in deze wereld van "evolutionaire kameleons" zal geen meiose hebben, otpochkovaniem. Maar we zullen lang leven. Telomerase-onsterfelijkheid is de onsterfelijkheid van de amoebe. In een meercellig organisme zijn de stamcellen het substraat van een kwantitatieve en kwalitatieve levensduur.

[1], [2], [3], [4]

Bronnen van embryonale stamcellen

Vandaag bronnen van embryonale stamcellen voor laboratoriumtests Line teratocarcinoom van muizen (129 / sv, F19, F8, Zin 40, CGR 86, Rl, CCE, JM-1, E14TG2a, CGRSb) en humaan teratocarcinoom (NTERA-2, TERA-2 , H-9 kloon), en HESS Trauneona. De aanwezigheid gedetailleerd cellulaire paspoort aangeeft immuun fenotype chromosoom analyseresultaten van mRNA expressieprofielen blootgesteld receptoren en eiwitten intracellulaire signalering niet gecompenseerd belangrijke nadelen teratokartsinomnyh lijnen ESC - snel verlies van totipotentie en onmogelijkheid toepassing in de klinische studies en gemengd differentiatie in kweek is zeer moeilijk te isoleren pure gespecialiseerde lijn uit een heterogene populatie cellen. Daarom gewoonlijk een bron ESC lijnen geproduceerd voor klinische doeleinden, dient als de binnenste celmassa van de blastocyst, embryo's de blastomeren van 8-cellig stadium van ontwikkeling cellen morula latere stadia, en primaire kiemcel.

Opgemerkt moet worden dat teratocarcinoomcellen, hoewel ze de eigenschap hebben van pluripotentie, een significant lager pluripotent potentieel hebben in vergelijking met ESC. Hun integratie met embryonale cellen leidt zelden tot de vorming van chimera's, waarbij bovendien gameten met een genotype van teratocarcinoomcellen nooit worden gevormd. Er wordt aangenomen dat dit te wijten is aan de frequente verschijning van chromosomale abnormaliteiten bij het kweken van teratocarcinecellen: verlies van het Y-chromosoom, verschillende trisomie, deleties of translocaties.

Pogingen om de menselijke ESC-lijn te onderscheiden zijn vele malen ondernomen, maar deze taak kon niet worden opgelost, omdat normale menselijke blastocysten moeilijk toegang hebben tot objecten. Bovendien is bij mensen de frequentie van chromosomale abnormaliteiten hoger dan in de embryogenese van dieren. De overgrote meerderheid van de vroege menselijke embryo's verkregen na in-vitrofertilisatie vertoont chaotisch chromosomaal mozaïcisme en vaak zijn er numerieke en structurele aberraties. Zelfs later, in het blastocyststadium, bestaat slechts 20-25% van menselijke embryo's uit cellen met een normaal karyotype. Het was bijna onmogelijk om dergelijke embryo's te gebruiken om een ESC te maken, omdat zygoten meestal werden gekweekt tot de stadia van twee of vier blastomeren en vervolgens in de baarmoeder werden getransplanteerd. Slechts relatief recent was een betrouwbare techniek ontwikkeld voor het kweken van bevruchte menselijke eicellen in het blastocyststadium. De introductie van deze techniek in de praktijk van in-vitrofertilisatie verhoogde niet alleen de frequentie van succesvolle implantatieresultaten, maar maakte ook van normale blastocysten een toegankelijker object.

Andere pluripotente stamcel bron de primaire geslachtscellen, die in tegenstelling tot de meer geavanceerde progenitorpopulaties epitheel germenativnogo, niet op het oppervlak van beta-integrine, maar brengen hoge activiteit shelochnoy fosfatase. Opgemerkt moet worden dat in het experiment de populatie van stamcellen, die werden gevormd uit primaire geslachtscellen, is bestudeerd sinds de jaren 80 van de vorige eeuw. Tegelijkertijd werd een techniek ontwikkeld voor het isoleren van primaire geslachtscellen uit de rudiment van de muizenembryo-gonade. De eerste mislukte resultaten van het kweken van primordiale kiemcellen in vitro suggereert de nutteloosheid van deze inspanningen, omdat de cellen, maar overleefde, maar zich niet verspreiden en stierven binnen de eerste dag. Later werd gevonden dat primaire kiemcellen van de muis zich in vitro alleen in de aanwezigheid van oplosbare en membraangebonden specifieke polypeptidegroeifactoren in het kweekmedium reproduceren. Talrijke studies hebben aangetoond dat het noodzakelijk is de aanwezigheid in het kweekmedium niet alleen LIF, maar membrannosvyazannyh en staal oplosbare factor (SIF) voor overleving en proliferatie van primordiale kiemcellen. Deze peptiden worden geproduceerd door somatische embryo's die homozygoot zijn voor de mutatie van staal, en een daarvan is een ligand van het proto-oncogen cKit.

Primaire kiemcellen van zoogdieren en mensen zijn van extragonadale oorsprong en zijn de bron van de klonale ontwikkeling van de geslachtscellijn. Het begin van de primaire kiemcellijn, evenals alle weefsels van het embryo, evenals het extraembryonale mesoderm, geeft het epiblast (primair ectoderm) van de vroege embryo's, dat een mozaïek structurele organisatie heeft. De microchirurgische verwijdering van verschillende delen van het vroege embryo vormde een lokalisatiezone in de epiblast van een kloon van toegewijde voorlopers van primaire kiemcellen. Met behulp van rhodamine dextran, dat werd gebruikt als een cel marker, werd vastgesteld dat de voorlopers van de primaire seksuele cellen zich bevinden in het proximale epiblast gebied, naast het extra embryonale ectoderm. De primaire seksuele cellijn komt uit de 45-celkloon, waarvan de toewijzing helemaal aan het begin van gastrulatie plaatsvindt. Dan vindt de segregatie van de kloon plaats en tijdens gastrulatie komen de primaire geslachtsdelen het extra-embryonale mesoderm binnen en worden gevonden aan de basis van het allantoïsche rudiment, achter de primaire band. Van daaruit migreren de primaire geslachtscellen naar het ventrale uiteinde van het endocervix-endoderm en bewegen dan actief door het mesenterium en bevolken de genitale rollen aan het einde van de migratie. Tijdens het migratieproces, evenals in de eerste 2-3 dagen van lokalisatie in de basis van de gonaden, prolifereren de primaire seksuele cellen actief en ondergaan acht replicatieve cycli. Als er aan het begin van de migratie ongeveer 50 primaire geslachtscellen zijn, in de reproductieve cysten van muisembryo's van een 12-daagse ontwikkeling, is het aantal primaire geslachtscellen groter dan 25.000.

De functionele overeenkomst SER en primordiale kiemcellen toont volledige integratie daarvan in het vervangende blastocyst binnenste celmassa en daaropvolgende volledige ontwikkeling van het embryo, weefsel dat slechts uit nakomelingen primordiale kiemcellen. Volgens andere kenmerken muizen primaire kiemcellen PGC waren ook identiek, met de mogelijkheid om te differentiëren in verschillende richtingen, om embryoïde lichamen in vitro vormen van een in vivo vorm teratomas wanneer subcutaan in immunodeficiënte muizen lijken spontaan teratomas testis muizen leiding 129 / ter.

Het staat vast dat, wanneer toegevoegd aan LIF medium, en oplosbare membrannosvyazannogo SIF geïsoleerd primaire geslachtscellen van 8-daagse muizen-embryo's overleven en zich vermenigvuldigen in cultuur voor 4 dagen, maar dan sterven. Bovendien is de periode waarin de cultuur van de dood waargenomen primordiale kiemcellen valt samen met het stadium van de ontwikkeling van muizenembryo's (12,5-13,5 dagen), wanneer de knoppen primaire gonadale vrouwelijke kiemcellen voeren meiose, en in de mannelijke primordiale kiemcellen worden geblokkeerd mitotische afdeling. Echter, als je toe te voegen aan het milieu niet alleen groeifactoren LIF en SIF, maar ook van FGF2, de primaire kiemcellen blijven proliferirovat en subculturen worden gevormd celkoloniën kan reproduceren, zelfs nadat uit de omgeving van groeifactoren (SIF en FGF) wordt verwijderd. Dergelijke cellen kunnen lange tijd op het embryonale fibroblastsubstraat worden gekweekt zonder de toevoeging van oplosbare groeifactor LIF. Het zijn deze stabiele cellijnen afgeleid van primaire geslachtscellen waarvan werd gesuggereerd dat zij embryonale kiemcellen werden genoemd. Deze term kan niet succesvol bij kweken EG-cellen niet kunnen worden verkregen embryonale kiemcellen, die in staat zijn de volgende fasen van oogenese en spermatogenese worden beschouwd. Dit komt door het feit dat de EG-cellijnen, alhoewel afgeleid van primordiale kiemcellen, maar de cultuur van het verwerven van de eigenschappen van embryonale pluripotente stamcellen verliezen hun vermogen tot het begaan van de germenativnye lijn. Met andere woorden, de primaire geslachtscellen tijdens de teelt verliezen hun eigenschappen gameten getransformeerd in precursoren en ESC-achtige pluripotente cellen.

Opgemerkt wordt dat wanneer immunodeficiënte EG-muizen worden toegediend, er geen teratomen ontstaan. Er wordt aangenomen dat het verlies van het vermogen van menselijke EG-cellen om teratomen te initiëren het gevolg is van het feit dat deze lijnen niet direct werden gecreëerd uit gekweekte primaire geslachtscellen maar werden verkregen uit cellen die waren geïsoleerd van embryoïde lichamen. Daarom is het mogelijk dat ze afstammelingen zijn van pluripotente, maar reeds gecommitteerde cellen.

Er moet worden opgemerkt dat er fundamentele verschillen zijn tussen EG-cellen en primaire geslachtscellen. De laatste maken het niet mogelijk om chimere muizenembryo's te verkrijgen, wat wijst op het gebrek aan vermogen van primaire kiemcellen om te integreren in de interne celmassa of het trophectoderm. De kenmerken van de populatie van primaire geslachtscellen zijn meer vergelijkbaar met de toegewijde lijnen van somatische cellen van latere embryo's, waarvan de introductie in de blastocyst ook niet leidt tot de vorming van chimere embryo's.

Modificatietechnieken kweken van de embryo lichamen verkregen met EG-aggregatie van cellen door selectie toegelaten op selectieve media om een populatie van pluripotente cellen, een zogenaamd "cellen afkomstig van embryoïde lichamen (embryoid body afgeleide cellen - EBD-cellen). Het vermogen van EBD-cellen om zich gedurende een lange tijd in de kweek te vermenigvuldigen, liet toe om stabiele cellijnen van toegewijde cellen te creëren. Klonen van cellen die een breed spectrum van mRNA en eiwit-markers van gespecialiseerde cellen tot expressie brengen, werden verkregen. Deze aanpak als een gevolg bleek dat de primaire geslacht humane pluripotente cellen, en differentiëren in vitro in verschillende celtypen: neuronen, glia, vasculair endotheel, hematopoietische cellen, spieren en endodermale cellen.

Alternatieve bronnen van embryonale stamcellen

Alternatieve bronnen van menselijke ESC-lijnen kunnen hybride cellen zijn. Implantatie in de uterus van pseudo-zwangere koeien geterogenomnoy structuur verkregen bij invoegen via elektroporatie fetusa humane somatische cellen met het ei koeien, die eerder uit de pronucleus was verwijderd, maakt het mogelijk om de binnenste celmassa van pre-implantatie embryo kunstmatige ontwikkelingsstadia ontvangen. Hiervoor wordt de blastocyst uit het ei van de koe met de getransplanteerde kern van de menselijke cel in de eerste fase verkregen.

In de tweede fase wordt de embryoblast geëxtraheerd uit de blastocyst en daaruit - de ESC volgens de Thomson-methode. Het is opmerkelijk dat de beste resultaten scheiding ESC lijnen volgens deze methode werden verkregen met kernen van folliculaire cellen of primordiale kiemcellen die blijven bestaan in het menselijk lichaam in een toestand van winterslaap. Dit komt door het feit dat ei per koe getransplanteerde humane cellen nucleus neukorochennye moeten hoge activiteit en telomeer telomeazy dat voortijdige veroudering ESC klonen afgeleid van hybride ei (Repin, 2001) voorkomt hebben. Het is bekend dat de belangrijkste intracellulaire marker eiwitten PGC zijn Oct3, Oct4, Tcf, Groucho, die behoren tot de zogenaamde geluiddempers, chromatine-eiwitten. Geluiddempers bieden een bijzonder compacte verpakking van heterochromatine, die de vorming van euchromatinelussen voorkomt. Het chromatine pakket gemedieerd door deze eiwitten correleert met de totipotentie van het ESC-genoom. Tot op heden is vastgesteld dat rijpe eicellen van rundvee en mensen het enige type gespecialiseerde cellen zijn met hoge concentraties silencer-eiwitten in het cytoplasma. Op basis hiervan werd een methode ontwikkeld voor de productie van hybride SER's door somatische celkernen over te brengen naar niet-nucleaire eitjes van koeien. Voorlopige in vitro studies toonden aan dat het cytoplasma van oocyten koeien herstelt totipotentie genoom van menselijke somatische celkernen na 12-24 uur kweken.

Van bijzonder belang zijn gegevens over de kenmerken van de preimplantatieontwikkeling van menselijke embryo's, die duiden op een latere vervanging van totipotente cellen door een populatie van pluripotente cellen dan in muizen. De studie van celtransformaties toonde aan dat cellen van de interne celmassa van de menselijke blastocyst, naast ESC's, ook trofoblastcellen genereren, wat hun totale potentie aangeeft.

Het is bekend dat er in het stadium van de blastocyst twee verschillend geëngageerde celpopulaties zijn. Eén daarvan is de buitenste laag van de blastocyst, trofectoderm, afgeleid van trofoblastcellen en andere embryonale placenta-componenten. De tweede celpopulatie is gegroepeerd in een dichte massa, die contact maakt met het binnenoppervlak van het trophectoderm. De celpopulatie van de binnenste celmassa is afgeleid van alle weefsels en kiemen van de embryo-organen. In het stadium van de late blastocyst wordt een extra embryonaal endoderm gevormd uit de interne celmassa en wordt een epiblast gevormd (het primaire ectoderm). Tegelijkertijd behouden epiblastcellen pluripotentie, terwijl het vermogen om cellen van het extra germinale endoderm te differentiëren beperkt is.

[5], [6], [7], [8], [9], [10], [11]

Het verkrijgen van menselijke embryonale stamcellen

Tot voor kort werd aangenomen dat trofoblast verkregen uit hESCs onmogelijk. Echter diploïde lijn trophectoderm stamcellen uit de blastocyst in een medium dat bevat, in plaats van LIF en FGF2 heparine, woekeren voort en in stamcellen. Als u verwijdert uit het midden van FGF2, de trophectoderm cellen stoppen met fokken, ze beginnen endoreduplicatie van chromosomen en cellulaire elementen trofektodermalnye geleidelijk omgevormd tot een gigantische trofoblast cellen. Waarschijnlijk heeft LIF niet trophectoderm proliferatie van cellen te stimuleren door het feit dat FGF2 veroorzaakt een mechanisme transsignalizatsii als FGF2 binding aan cytoplasmatische receptor (FGFR2), activeert MAP kinase in het cytoplasma - ERK1 en ERK2. Wanneer derhalve opgenomen in de cellen van de blastocyst van een signaalweg (LIF - gpl30 - JAK-kinase - STAT3) binnenste celmassa worden getransformeerd tot pluripotente hESCs, terwijl als het tweede mechanisme van transmembraan signalering (FGF2 - FGFR2 - MAP kinases ERK1 / ERK2) stamcellen in de blastocyst trophectoderm gevormd. Selectie van de signaleringsroute, op zijn beurt, is afhankelijk van de activiteit van het gen Oct4. Dit gen behoren POU domein, gelegen op de locus t 17 autosomen en die tijdens oögenese in pletten periode als in cellen van de inwendige celmassa van de blastocyst, en in primordiale kiemcellen. Functionele rol oct4 gen coderend voor een transcriptiefactor die nodig zijn voor het voorkomen van pluripotente cellen, hun differentiatie en dedifferentiatie.

De expressie van het oct4-gen in de ESC varieert afhankelijk van de interactie van deze transcriptiefactor met de cofactoren. Een directionele regulatie van oct4-expressie in blastocysten liet zien dat wanneer de activiteit ervan afneemt, de helft van de cellen een trophectoderm vormt, terwijl met een toename van de geïnduceerde expressie van oct4 overwegend ESC optreedt.

In het experiment kan ESC niet worden omgezet in een lijn bij het cultiveren van totipotente blastomeren in het stadium van verplettering, maar ook in het stadium van gastrulatie en latere stadia van embryonale ontwikkeling. Muis-ESC's worden gewoonlijk toegewezen op de 3,5-4,5-dag van de zwangerschap, wat overeenkomt met de zesde (enkellaagse blastocyst) en de zevende fase (een tweelaagse blastocyst - een vroege eicel) van normale embryogenese. Het is duidelijk dat alleen in de pre-implantatieperiode de embryo's van muizen cellulaire populaties bevatten die kunnen worden omgezet in ESC. Bijgevolg is de isolatie van ESC-lijnen alleen mogelijk in bepaalde stadia van embryogenese. Totitipotent, vanuit het oogpunt van de mogelijkheid om een levensvatbaar embryo te ontwikkelen met embryonale membranen en de placenta, zijn de zygote en de blastomeren die ontstaan tijdens het crushen. Het verlies van de totale potentie van de kiemcellen begint in het late morula stadium, wanneer verdere blastomere verkleining afhankelijk is van hun locatie. Vroege Morula-blaetomeren behouden totipotentie, omdat experimentele manipulaties met veranderingen in hun locatie, bijvoorbeeld omkering van hun locatie, de ontwikkeling van een volledig embryo niet voorkomen.

Er werd gevonden dat de efficiëntie van de afgifte van ESC in de lijn wordt beïnvloed door de toestand van de blastocysten op het moment van hun explantatie. Het gebruik van blastocysten na het modelleren van een zevendaagse diapause in het genitale stelsel van muizen die op de 3,5e dag van de zwangerschap zijn ovariëctomiseerd en die progesteron ontvingen, bevordert een meer succesvolle toewijzing van embryonale stamcellijnen. Er wordt aangenomen dat onder dergelijke omstandigheden het aantal blastomeren dat de binnenste cellulaire massa vormt toeneemt. Het is ook mogelijk dat de celcyclus zich uitstrekt en dat de meeste blastomeren de GO-fase binnengaan.

Bovendien is het creëren van stabiele pluripotente hESC lijnen afhankelijk van het genotype embryo: vrij gemakkelijk van SER Murine blastocysten lijn 129, is veel moeilijker om ze te verkrijgen bij muizen CS7BL / 6 en vrijwel onmogelijk om de lijn van hESCs blastocysten CBA / Ca-muizen te isoleren. Het is duidelijk dat vroege embryo's een aantal genetische kenmerken bezitten die de ontwikkeling van de pluripotente ESC-lijn beïnvloeden. Echter, bij kweek epiblast geïsoleerd, en door de selectieve keuze differentiërende hESCs cellijn vroege embryo CBA / Ca muizen werden nog toegekend.

Een bewezen standaardtechniek voor het verkrijgen van ESK-lijnen uit blastocysten wordt gegeven in laboratoriumhandleidingen over de techniek van het experiment met vroege embryo's. Experimentele ESK-lijnen kunnen ook worden verkregen door het kweken van een geïsoleerd epiblast (primair ectoderm) van 4,5-daagse muizenembryo's met een vrij complexe microchirurgische techniek en gemodificeerde kweekomstandigheden. De complexiteit van deze procedure is gerechtvaardigd, aangezien de frequentie van vorming van ESC-lijnen veel hoger was dan bij het werken met de interne celmassa van de blastocyst.

Om de ESC-lijnen te isoleren, wordt elke kloon overgebracht naar een micro-well, een aggregaat van 40-60 cellen wordt gekweekt, het wordt opnieuw gedispergeerd. Meerdere herhalingen van deze werkwijze maakt het mogelijk om onsterfelijk ESK overeenkomstig maximale normokariotipnyh cellen proliferatiesnelheid aan de kunststof die door kanalen 50-100 totipotentie behouden en hoge telomerase-activiteit te verkrijgen. Bij het ondersteunen van ESC-lijnen is vervuiling van het milieu of serum met bacteriële endotoxinen het gevaarlijkst - zelfs sporenconcentraties van endotoxine in het kweekmedium veroorzaken massale sterfte van onvolgroeide kiemcellen. Met een zorgvuldige controle van de lineaire groei en tijdige dispersie van SER in kweek in staat zijn symmetrisch splitsing, waarbij beide dochtercellen blijven pluripotent en kan een onbeperkt aantal celcyclus voeren, het handhaven van een diploïd karyotype en het totale vermogen.

Selectie van een schone populatie van menselijke ESC's kan worden uitgevoerd na transfectie in hun genoom van recombinante DNA-moleculen die een gen coderen voor de synthese van een groen fluorescerend eiwit (GFP). GFP-expressie neemt toe met de groei van ESC in omstandigheden die hun proliferatie ondersteunen, terwijl met het begin van differentiatie het expressieniveau van dit gen wordt verlaagd, wat selectie van zuivere stabiele pluripotente cellijnen op een selectief medium mogelijk maakt. Wanneer gekweekt met GFP selectie van ESC's, is de frequentie van kolonies sterk verhoogd, omdat in de omstandigheden van selectiegewassen het krachtige antiproliferatieve effect van gedifferentieerde cellen wordt geëlimineerd.

Overbrengen van embryonale stamcellen overeenkomstig door hun winmethode van pre-implantatie embryo (stap 80-120 cellen), die na in vitro fertilisatie blijven. Hiervoor synthetisch geproduceerde "overtollige" embryo mechanisch gedispergeerd op middellange Delbekko naald. Na het merken van cellen met monoklonale antilichamen selectieve fluorescent label embryoblast geïsoleerde cellen. De embryoblast wordt gedispergeerd in individuele cellen met behulp van een mengsel van disaspase-collagenase. De gedissocieerde cellen werden gekweekt in een speciaal medium (80% Delbekko medium + 20% foetaal kalfsserum in aanwezigheid van 500 ug / ml IL-6, LIF en SCF) op de monolaag van embryonale fibroblasten voeder 3 eerste passages. Aldus overleving en proliferatie van stamcellen en progenitorcellen worden bijgehouden door blootstelling aan IL-6, LIF en SCF. In deze omgeving, de suspensie hESCs groeien klonen osharennyh ongebonden cellen worden gedissocieerd door voorzichtig pipetteren meerdere. Nieuwe klonen verschijnen in de opgeschorte cultuur op de 5e-7e dag. De maximale groeisnelheid van ESC wordt bereikt door herhaalde dissociatie van klonen in het stadium van 10-15 cellen. Vervolgens wordt elke kloon overgebracht naar een microcel en gekweekt tot een aggregaat van 40-50 cellen. De procedure wordt vele malen herhaald in de doorgangen, verhoging van de kweek tot een dichtheid 5-10 miljoen cellen per 6 cm schaaltje. Door een dergelijke Thomson passage geïsoleerd werd 10 klonen onsterfelijke menselijke SER's die door de doorgangen 100 behouden van telomerase-activiteit, het vermogen om intense proliferatie en fenotypische kenmerken minimale totale vermogen, met differentiatie één van de 350 gespecialiseerde cellijnen die afgeleid ecto-, meso- - en endoderm. Van humane ESC gestart (veranderingspogingen drager, toevoeging en verwijdering van serum LIF) met celhechting aan het substraat, waarin de ontwikkeling van het cytoskelet en expressie van adhesie receptoren. Het is belangrijk dat de onbeperkte proliferatie van menselijke SER's onderhouden normaal karyotype.

De tweede methode om menselijke ESC-lijnen te isoleren is gebaseerd op het gebruik van primaire geslachtscellen. Experimentele studies hebben aangetoond dat Eu-cellijnen kunnen worden verkregen uit de genitale plaques van 12,5 dagen oude embryo's van muizen. In deze gevallen was de frequentie van vorming van de voorlopercellijnen echter aanzienlijk lager dan in experimenten met eerdere embryo's. Tegelijkertijd zijn primaire geslachtscellen uit geslachtsklieren van muizenembryo's met een zwangerschapsduur van 13,5 dagen over het algemeen niet in staat om in lijnen om te zetten.

De eerste stabiele lijnen van pluripotente menselijke EG-cellen werden verkregen uit primaire gonocyten geïsoleerd uit de genitale knoppen van 5-9 weken oude embryo's. Geïsoleerde cellen werden gekweekt op een substraat van geïnactiveerde muizen embryonische fibroblasten in DMEM medium met foetaal serum, waaraan werd toegevoegd mercaptoethanol, forskoline, alsmede recombinant menselijk groeifactoren (FGF en LIF). Na 7-12 dagen verschenen meercellige kolonies in kweek, volgens morfologische kenmerken en moleculaire markers overeenkomend met humane EG-cellen. Na aggregatie vormden deze cellen embryoïde lichamen, met de verdere ontwikkeling waarvan gespecialiseerde cellen verschenen, kenmerkend voor de derivaten van alle drie embryonale bladeren. Gedurende 10-20 passages behouden EG-cellijnen het normale karyotype en verloren ze geen pluripotentie.

Er wordt ook aangetoond dat het gecombineerde effect van LIF, membraangebonden en oplosbare staalfactoren, evenals TGF-b, het programma voor de ontwikkeling van primaire geslachtscellen modificeert. In plaats van de mitotische delingen te stoppen en te differentiëren in de richting van oogenese of spermatogenese, blijven de primaire geslachtscellen prolifereren. Na verschillende extra mitotische cycli worden ze vergelijkbaar met epiblastcellen en verliezen ze de eigenschappen van voorlopers van kiemcellen en worden ze getransformeerd in pluripotente embryonale stam-EG-cellen.

In 1998 werden onsterfelijk gemaakte lijnen van primaire seksuele cellen voor het eerst geïsoleerd van het seksuele rudiment van menselijk foetaal autopsieweefsel. De embryogenese van menselijke primaire kiemcellen verschijnen in de dooierzak in de derde week van de ontwikkeling, en op de 4-5e weken, deze cellen migreren naar het gebied van de seksuele knobbeltje, waar ze vormen een populatie van primaire dormantnye gonocytes. In de inactieve toestand blijven primaire kiemcellen in de kiem tot de geboorte. Germ primaire cellijnen werden uit de foetale genitale knobbel 5-9 weken oude embryo opgehaald ex tempore weefsel dat wordt behandeld met een mengsel van collagenase type IV-V, hyaluronidase en DNase kwantitatieve en kwalitatieve opbrengstverhoging cel. Primaire kiemcellen in de weefsels van de foetale genitale tuberkel zijn omgeven door Sertoli-stromale (mesenchymale) cellen. Functionele doel van Sertoli cellen is de productie van anti-apoptotische factoren (Fas-ligand), mitogenen en immunosuppressiva dat seksuele stamcellen tegen immune aanval door het lichaam. Bovendien speelt de stromale micro-omgeving van de genitale tuberkel een belangrijke rol bij de rijping van gameten. De geïsoleerde primaire kiemcellen worden in de kweek geplant over de stromale laag van het voeder, bestaande uit de foetale fibroblasten van de eerste drie passages. De meest effectieve combinatie van mitogenen is een complex dat bestaat uit LIF, FGF en forskoline (een stimulerend middel voor de vorming van cAMP). Proliferatie primordiale kiemcellen in vitro vereist de toevoeging van foetaal serum, in aanwezigheid van een primair reproductie gonocytes in kweek klonen onder vorming van bolvormige, niet-hechtende cellen aan het substraat.

De Amerikaanse National Institutes of Health op basis van een samenvatting van bestaande informatie over de methoden voor de toewijzing van de menselijke ESC regels uit blastocysten werd gemaakt tot een voorlopige conclusie dat de succesvolle toewijzing van de ESC is het meest waarschijnlijk wanneer ze worden gekweekt blastocysten met goed gevormde binnenste celmassa (Stamcellen: wetenschappelijke vooruitgang en toekomstig onderzoek richtingen Nat. Inst, of Health USA). Vanuit dit oogpunt is de beste bron van SER's te creëren lijnen menselijke blastocyst 5 dagen van ontwikkeling, waarvan de verdeling van de binnenste celmassa trophectoderm zorgvuldig worden verwijderd. Geïsoleerde binnenste celmassa bestaat in dit stadium van 30-35 cellen moeten worden gekweekt op een substraat murine embryonale fibroblasten, hetgeen een beslissende voorwaarde voor de vorming van kolonies in kweek hESCs.

De analyse van de fenotypische kenmerken van embryonale stamcellen

Van bijzonder belang is de interspecifieke vergelijkende analyse van fenotypische kenmerken van ESC. Gevonden werd dat menselijke ESC kolonies - een dichte clusters van afgeplatte epitheliale cellen, terwijl muizen embryoïde kalf bestaan uit losse conglomeraat afgeronde cellen. In menselijk ESC is de index van de nucleair-plasma-ratio lager dan in muis-ESK. Embryonale stamcellen van apen vormen meer platte cel kolonies met ongelijke randen. In vroege klonen van ESC-primaten zijn afzonderlijke cellen gemakkelijk te zien. Uitdijende hESCs alle diersoorten niet tot expressie van MHC klasse I en II. Tegelijkertijd, menselijke SER een positieve respons op antilichamen TERA 1-60 en GCTM-2, waarbij de aanwezigheid op het oppervlak keratine / chondroitinesulfaatproteoglycanen, kenmerkend embryonale (teratomen) -kartsinomnyh stamcellen aangeeft. Expressie in hESCs allerlei dieren oct4 gen suggereert dat, ondanks de fenotypische verschillen tussen mens en muis SER blijkbaar geactiveerd door dezelfde set van genen verantwoordelijk voor de pluripotentie (Peru, 2001). Daarnaast heeft de ESC lijnen afgeleid van embryonale ratten, varkens, konijnen, primaten, en runderen, hebben vergelijkbare morfologische kenmerken, een gelijkaardige set van moleculaire identificatie van markers en een bijna identieke moleculaire mechanisme voor de uitvoering van de embryogenese programma waarmee u een frisse kijk op de xenotransplantatie kwestie te nemen .

In tegenstelling tot normale embryogenese in vivo, is in vitro proliferatie van hESCs niet onder vorming van kiembladen en verder naar homeotische Nohgenov achtergrond, d.w.z. Blok, zonder organogenese. Aangezien segmentatie genen niet in cultuur functioneren hESCs onmogelijk om dergelijke perioden te reproduceren embryogenese als tab somite segmentatie van de kern, de vorming van de dooierzak, allantois voorlopig en andere organen en weefsels. De kweek ESC's werden bevroren aan het begin van de vorming van 350 restrictielijnen van gespecialiseerde cellen. Aldus kloon dochteronderneming progenitorcellen en centraal gelokaliseerd PGC alleen model embryo in ontwikkeling waarbij verschillende weefselgebieden worden gevormd in één fase verschillen van gespecialiseerde cellen afkomstig evenwel van gemeenschappelijke precursoren. Hoewel het minimumniveau van receptoren op het oppervlak van hESCs behouden zij het vermogen primitieve morfogenetische processen simuleert de massa van vroege embryo structuur uitvoeren: hESCs suspensie cultuur en aggregaten vormt een structuur die lijkt blastocyst of zelfs hoger embryo (ei cilinders). Dergelijke suspensie-aggregaten werden op toepasselijke wijze eenvoudige en complexe embryoïde lichamen genoemd.

Bij menging differentiëren in verscheidene cellen van het embryo lichaam tegelijkertijd door vroege genen ectoderm (Oct3, FGF-5, nodale), endoderm (gata-4), mesoderm (brachyury), cardiogene mesoderm (PKH-2,5), neurale buis (msx3 uitgedrukt ) en hematopoiesis (elkf). Met behulp van verschillende combinaties van cytokinen en groeifactoren voor het richten van de vorming van kiemlaag cellen in vitro in een aantal gevallen vaak embryoïde lichamen te verkrijgen is, die bij voorkeur werden uitgedrukt genen ectoderm en mesoderm, dat de weg voor de modellering van gastrulatie en vroege organogenese fase opent.

Klonale groei van hESCs bewijst asymmetrische celdeling waarbij slechts één van de ESC in het centrum kloon behoudt niet beperkende voortplantingscapaciteit, terwijl de andere dochtercel aanleiding geeft tot vorming van progenitorcellen, is differentiatie al komen. Daarom kloon voortplantingssnelheid aan de omtrek van de embryoiden lichaam groter dan in het midden. Boundary groeiende cellen kloon ondergaan spontane differentiatie ontregeld migreren of sterven door apoptose mechanismen. Deze gebeurtenissen bepaalt het lot van de kloon als de proliferatiesnelheid de migratiesnelheid en apoptotische celdood overschrijdt, kloon maten blijven toenemen, stabilisatie optreedt met gelijke apoptose en de vormingssnelheid van de nieuwe cel snelheid regressie - omgekeerde verhouding tussen deze processen. Progenitorcellen delen symmetrisch, dat wil zeggen, beide dochtercellen vervolgens differentiëren tot rijpe gespecialiseerde cellijnen. De verhouding ESC / progenitorcellen varieert, maar is altijd het aantal PSC slechts een fractie van een procent van de populatie van progenitorcellen. Daarom is slechts een grondige en tijdige pipetteren opsplitsing klonen zijn in staat om het aantal van de SER in cultuur te verhogen. Disaggregatie klonen verschenen in stap 10-12 cellen het meest effectief om een maximale opbrengst te verkrijgen hESCs. De richting en mate van differentiatie van cellen in het embryoïde lichaam hangt af van hun locatie. Buiten embryoid lichaamscellen niet tot expressie het gen en Oct4 ondergaan differentiatie van primaire endoderm cellen waarvan vervolgens epithelioïde cellen en pariëtale extraembryonic viscerale endoderm gevormd. Interne embryoid lichaamscellen tot expressie oct4 behouden pluripotentie gen binnen 48 uur kweken. Maar de morfologische reorganisatie plaatsvindt in de epitheliale monolaag kweek begint en expressie van genen die de ontwikkeling van primaire ectoderm regelen. Verder produceert de werkwijze totale ongeordende cytodifferentiation begint met het verschijnen van verschillende celtypen die derivaten van alle drie kiembladen. In het proces van de spontane differentiatie van de embryoid lichaamscellen geschapen wordt aggregaten endoderm merkers in de vorm van fragmenten (cysten) dooierzak. Verder verschijnen angioblasten en endotheelcellen van groeiende capillairen in deze structuren. In de laatste fase van de spontane differentiatie van de interne cellen van de embryo lichaam ontwikkelt verschillende terminaal gedifferentieerde cellen, zoals neuronen, gliale elementen, cardiomyocyten, macrofagen en erytrocyten. In bepaalde benadering (gezien de ruimtelijke omkering van bladen vormen het embryonaal weefsel) via de embryoïde lichamen in vitro kunnen morfogenetische processen onderzoeken en analyseren van de moleculaire mechanismen van embryonale cytodifferentiation beginperiode en stelt de rol van specifieke genen in de uitvoering van deze processen.

In de kloon zitten dus cellen waarin verschillende genetische ontwikkelingsprogramma's worden ontdekt: ESC's, vroege voorlopers en differentiërende voorlopercellen. Het kweken van ESC door de werkwijzen van een hangende druppel of massacultuur zonder een toevoerlaag en zonder de toevoeging van LIF in het medium leidt onvermijdelijk tot de vorming van embryoïde lichamen. De morfologie van de cellen van de buitenste en binnenste lagen van de embryoïde lichamen is anders. De buitenste laag bestaat uit grote procescellen. Hun oppervlak, tegenover de omgeving, is bedekt met talrijke microvilli. De buitenste laag cellen is gescheiden van het interne basale membraan dat lijkt op het Reichert-membraan, terwijl de cellen van de binnenste laag van de embryoïde lichamen een cilindrisch epitheel zijn. Morfologisch gezien doet de binnenste laag, hoewel hij veel delende cellen bevat, meer denken aan ongedifferentieerde ESC-kolonies.

Kenmerken van menselijke embryonale stamcellen

Afwezigheid van parenchymale-mesenchymale interacties op het achtergrondsignaal blokkeren genen homeosis veroorzaakt ontregelde groei van PGC's in kweek, aangezien dit tabblad verbroken en de vorming infrastructuur voorlopig organen. Ongeorganiseerde groei en wanordelijk spontane differentiatie van hESC 's in de cultuur te wijten aan een gebrek aan mesenchymale markering stromale kader van toekomstige organen: in vitro is het mogelijk de vorming van miljoenen van hepatocyten, maar je kunt geen segmenten van de lever, met inbegrip van structurele en functionele elementen, zoals de sinussen, de ruimte van Disse en Kupffer cellen te krijgen.

Gemeend wordt dat de pluripotentie SER gerealiseerd uitsluitend embryogenese weefsels en organen van het embryo te vormen, terwijl de navelstreng en de placenta afkomstig trofoblast. Ingesloten in een mantel trofektodermalnuyu ESK consequent genereren celklonen voorlopig ontwikke- programma combinatoriële mRNA bulk Nohteyaov topografische matrix, waarbij de ruimtelijke rangschikking, vorm, afmeting, aantal voorlopige en definitieve orgaancellen en parenchym samenstel structurele en functionele eenheid vooraf te bepalen. Tegelijkertijd is de ESC zijn de enige celtype waarin het moleculaire mechanisme van de realisatie van hun potentieel volledig losgekoppeld van de genetische programma van de ontwikkeling en ESCO's zich beroofd van de mogelijkheid van interactie met andere cellen als gevolg van verstopping van zowel receptor percepties en transsignalizatsii systemen. Er is echter voldoende activering SER leidt tot een geleidelijke implementatie embryogenese programma einde geboorte volledig gevormd en klaar om te extrauterine het leven van een organisme bestaat uit miljarden cellen. In deze korte tijd, maar onvoorstelbaar schuld in de cellulaire ruimte pad onvermijdelijk optreden van fouten in de moleculaire mechanismen die vitale functies van cellen, en in de programma's die hun proliferatie, differentiatie en specialisatie te controleren. Daarom is in de moderne farmacogenomica afzonderlijk beschouwd ziekte moleculaire apparaten, en de ziekte cel programmering. En de actie van de meerderheid van de nieuwe geneesmiddelen die gericht zijn op het corrigeren van de naam van het programma van differentiatie, proliferatie en organogenese, alsmede de regeneratie van organen en weefsels. In het volwassen organisme via SER wordt het mogelijk om het gedrag van stam / progenitorcellen getransplanteerd in de hersenen, lever, milt, beenmerg en andere organen van het menselijk besturen om een beschadigde ontvanger parenchymale organen als gevolg van differentiatie en specialisatie donor mesenchymale cellen behouden matrix herstellen. In wezen is totipotentie programma de lancering van een andere eicel genoom niveau, zygoten en blastomeren, maar deze cellen is nog niet mogelijk te klonen en gepasseerde in de hoeveelheden die nodig zijn voor de behoeften van ervaringsleren en praktische geneeskunde. Daarom is het ESC is een unieke bron van genetische informatie die de drie-dimensionale lineaire restrictiekaart van het embryo en codes van gespecialiseerde cellijnen tijdens gastrulatie.

Vrijwel onbeperkte mogelijkheden van regeneratieve ESC vanwege het feit dat hun genoom, in tegenstelling tot de genetische inrichting van gedifferentieerde somatische cellen zorgt pluripotentie. Een uiting van slapende toestand geworteld in SER genetische informatie is de zogenaamde minimum fenotype - op het oppervlak van de ESC een beperkt aantal receptoren tot expressie brengen en dus zeer weinig programma ingezet transsignalizatsii nucleaire apparaat van de cel met het micromilieu ervan interageren. Tegen de achtergrond van winterslaap genen verantwoordelijk voor de beperking van gespecialiseerde cellijnen en differentiatie van cellen, slechts 30 van de 500 genen waarvan producten communicatiecellen de omringende micro geactiveerd. Volgens de methode van seriële analyse van genexpressie aangetoond dat het algemene karakter van de Main functionele genoom dozen reguleren energie metabolisme in somatische cellen en SER verleden bepaald extreem lage hoeveelheid mRNA van receptoren, G-eiwitten, second messengers, transcriptasen, cofactoren expressie en repressie , dat wil zeggen, het gehele systeem van transmembraan overbrenging van het regulatiesignaal naar de cel. Dit komt door het ontbreken of de zeer lage expressie van transsanaliserende genen. Tijdens de differentiatie geïnduceerd in het genoom van ESC 18 wordt gestopt synchroon werkende genen voor achtergrond activatie transsignalizatsii 61 gen regelen van de synthese van celadhesie receptoren, extracellulaire matrixcomponenten, restrictie transcriptasen messendzhernyh elementen en signaaloverdrachtsysteem voor een nucleaire eenheid met het plasmacel membraanreceptoren. Geblokkeerd tegelijk expressie van genen voor de synthese van eiwitten geluiddempers, alsmede genexpressie koingibitorov verschaffen totipotentie genoom hESCs.

Genetische markers werden gevonden voor de cellen van alle drie embryonale blaadjes. Identificatie ectodermale cellaag gedragen op de expressie van genen knooppunten, Oct3 en FGF-5, mesodermale cellen - gen Brachyury, zeta-globine, endoderm - ten gata-4 genexpressie. In normale embryogenese, tijdens gastrulatie waargenomen actief migratie van onrijpe populaties van stam- en progenitorcellen, lokaal aanwijzing gebieden van het gezicht botten van de schedel, sommige delen van de hersenen, perifere zenuwstelsel, hartgeleidingssysteem en thymus weefsel dat wordt gevormd uit klonen verplaatste cellen. Kenmerken van cellen vroege genen kiembladen maakt het voor topografische analyse van migratie van progenitor cellen in het ontwikkelende embryo. Het blijkt met name dat de cellen in aggregaten embryocarcinomen P19 expressie van het eerste gen mesoderm brachyury begint tijdens de reductie van genexpressie weefsel plasminogeen activator, een-fetoproteïne, keratine 8, en keratine 19 die markers van vroege mesoderm trekkende populaties. Bijgevolg is de vorming van weefsels van mesodermale oorsprong begint pas nadat het proces van migratie en afrekenpunt mesodermale progenitorcellen.

Met uiterst beperkte fenotypische kenmerken en de afwezigheid van de meeste blokken transsignalizatsii ESC toch een aantal receptor moleculen die gebruikt kunnen worden om ze te identificeren uiten. Het is opmerkelijk dat de antigenen zijn markers van ESC in mensen en primaten waren heel gewoon. Meestal gebruikt voor labeling hESCs gemerkte antilichamen tegen antigenen membrannosvyazannym SSEA-3, SSEA-4 (unieke lipide antigenen die complex glycolipide GL7 met siaalzuur), en hoogpolymere glycoproteïnen TRA-1-81 TRA-1-60. Bovendien hESCs expressie specifiek embryonaal antigeen SSEA-1 en endogene alkalische fosfatase, evenals een transcriptiefactor Oct4. Dit laatste is nodig voor het handhaven hESCs proliferatiemechanismen - transcriptiefactor Oct4 gen activeert de expressie van fibroblast growth factor 4 genexpressie en stabiliseert boxing verantwoordelijk voor de niet-beperkende DNA verdubbeling in onrijpe cellen. De belangrijkste intracellulaire marker eiwitten zijn Oct3, Oct4, Tcf en Groucho, gerelateerd aan eiwitten van chromatine-geluiddempers.

Vrijwel direct na de lange-termijn gekweekte SER's pogingen niet succesvol is en het organisme werd voor het eerst bereid door kweken van stamcellen geïsoleerd van blastocysten van de muis, en primaire kiemcel cultuur, begon stadium ESC pluripotentie studies capaciteit bij toediening in de vroege stadia van embryo-ontwikkeling. Er werd aangetoond dat de morula en blastocyst PGC's kunnen chimere embryo's waarbij de donor PGC nakomelingen gedetecteerd in alle somatische weefsels en zelfs in gameten te vormen. Dus in Developmental Biology behulp ESC scripting "brug" tussen de experimentele studies in vivo en in vitro, die de mogelijkheid bestuderen processen favorieten primaire weefsels en organen, hun differentiatie en embryonale organogenese aanzienlijk toegenomen.

Het is duidelijk vastgesteld dat in vivo in het proces van embryogenese, ESC's zijn geïntegreerd in de celmassa van het vroege embryo, en hun derivaten worden aangetroffen in alle organen en weefsels. ESC's koloniseren in het chimere embryo een rij geslachtscellen waarvan de afstammelingen volwaardige zaadcellen en spermatozoa vormen. Embryonale stamcellen zijn klonogene - enkele PGC's kunnen genetisch identiek is aan een kolonie van cellen met moleculaire merkers die oct4 genexpressie en alkalische fosfatase, hoge telomerase activiteit en expressie van specifieke embryonale antigenen bevatten te creëren.

De mechanismen van embryogenese gebruik van de techniek van hESCs chimerisatie morula bestuderen door een biologische structuur, die zich buitenlaag tetraploïde blastomeren ontvanger en donor PGC worden toegediend in. Aldus trofoblast gemaakt van nakomelingen tetraploïde blastomeren ontvanger die implantatie en placenta, en PGC donor als de binnenste celmassa, dat is gevormd uit een levensvatbare kiemlijn van het primaire lichaam en voorlopercellen gameten maakt. Onderzoek ESC waarde ligt niet alleen dat bij de manipulatie in vitro met hun genoom behouden pluripotentie, maar ook in het feit dat met behoud van het vermogen om te participeren in de vorming van hESCs primordiale kiemcellen van de chimere embryo. Het blijkt dat slechts een nakomeling van genetisch gemodificeerde PGC koloniseren alle primaire en ziektekiemen vormweefsel chimeer embryo verkregen door samenvoeging of co-kweek van de cellen met 8-cel embryo. Wanneer getransplanteerd in muizen morula ESR getransfecteerd met groen fluorescent eiwitgen, werd fluorescentie nakomelingen van de cellen in alle onderzochte weefsels van het ontwikkelende embryo (Shimada, 1999). Transplantatie van ESC in de morula kan levensvatbare muizen te maken, waarvan het lichaam bestaat uitsluitend uit afstammelingen schonk de ESC, dat opent mogelijkheden voor een verscheidenheid van therapeutisch klonen opties. Nu zo'n methodische aanpak met succes is toegepast op de problemen van de ontwikkelingsbiologie te bestuderen, in het bijzonder, kan het de genetische mechanismen van inactivatie van het X-chromosoom of epigenetische instabiliteit van hESCs analyseren. Transplantatie van ESC in het vroege embryo wordt ook gebruikt in de biotechnologie in de landbouw, evenals in gentherapie-experimenten.

Transplanten van genetisch gemodificeerde ESC's worden gebruikt om de doelcellen van mutante genen te testen. In vitro gekweekte ESC's worden in de biotechnologie gebruikt om knockout-muizen te maken. Om dit te doen, door homologe recombinatie, wordt het te onderzoeken gen verwijderd uit de ESC, en de cellen die dit gen missen worden geïsoleerd op selectieve media. Vervolgens wordt knock-out ESC's geïnjecteerd in de blastocyst of geaggregeerd met blastomeren van morula. De aldus verkregen chimère vroege embryo worden getransplanteerd in een ontvanger vrouwelijke en pasgeboren muizen gekozen uit individuen met gameten, nullizigotnymi van dit gen. Met deze technologie zijn er vele lijnen knock-outmuizen gemaakt, die op grote schaal worden gebruikt in experimentele biologie en experimentele geneeskunde. Op dergelijke biologische modellen wordt het belang van bepaalde genen in embryonale ontwikkeling bestudeerd, evenals hun rol in de mechanismen van ziekten en pathologische aandoeningen van de mens. Bovendien worden de lijnen van knockout-dieren gebruikt in de preklinische testfase van nieuwe werkwijzen voor gentherapie. Bijvoorbeeld met gebruikmaking van het gen transfectie in ESK normale allel van het mutante gen beheren effectief gecorrigeerd mutatie en schiet het hemopoietische systeem. Introductie van buitenaardse genen in ESC maakt het creëren van lijnen van homozygote transgene laboratoriumdieren in een versneld tempo mogelijk. Er moet echter worden opgemerkt dat de techniek gerichte recombinatie gendeletie betrouwbaar werkte nog slechts relatief ESC muizen. Met knaagdiermodellen SER dubbele knockout geïnstalleerde functionele rol specifieke cluster van genen op chromosoom 7 (kopie genomisch gebied 19 minuten humaan chromosoom) en het proximale gedeelte van het 11e chromosoom (kopieer humaan chromosoom 5d) - deletie van deze genen in ESK-muizen mochten de functie van hun analogen bij mensen evalueren.

De functie capaciteit studies van humane embryonale genen, transfectie gen dat proefdieren toegelaten hESCs name crypto verduidelijken van de rol van het gen in de lip en die de cardiogene mesoderm, pax-6 gen - bij embryogenese oog. Vormt de eerste expressie van genen in prolifererende onrijpe kaart ESC teratocarcinoom en blastocyst muizen bevestigde overweldigende onderdrukking in ESK transsignalizatsii genen. De combinatie van mutante SER 60-80 en 20-30 cellen van normale pre-implantatie muizenembryo's leidt tot de ontwikkeling van chimere embryo's waarin de bladwijzers lichaam bestaat donor en ontvangende cellen, waarmee we de rol van onbekende genen in gastrulatie en organogenese bepalen. Functionele kaart van gen ontwikkelen muizenembryo's uitgebreide gegevens over de rol van gen tab sf-1 in de bijnier en genitale primordia, wt-1 gen - in de nieren tab MyoD familie genen - in de tab van de skeletspieren genfamilie gata-1-4 - in het restrictie rijping beginselen van erythro- en lymfopoëse.

Geregisseerd off van moederlijke en vaderlijke allelen van genen in hESCs gebruik vector recombinase diende om de functies van de verschillende genen te verduidelijken tijdens de vroege embryogenese en technologie richten van menselijke onbekende genen in de muis SER's bijdragen aan de ontdekking van nieuwe gemuteerde genen die verantwoordelijk zijn voor de ontwikkeling van ernstige erfelijke ziekten. Gebruik knockout Werkwijze volgens obligate gewicht van bepaalde genen tot embryonale weefsels: gata-4 - voor infarct, gata-1 - tot erytroïde hemopoietische weefsel, MyoD - skeletspieren, brachyury - voor mesoderm restrictie transcriptase hnf3 en HNF4 - voor leverstamcellen, rag-2 - referenties op klonen van T- en B-lymfocyten (Repin, 2001). Double deletie van genen in hESCs heeft toegang geopend om de studie van de functionele rol van genen van de germinal lagen, segmentatie en homeosis en ESC transplantatie krijgen de mogelijkheid van het verkrijgen van levensvatbare soorthybride embryo's. Met de verbeterde methoden van transplantatie van donor PGC's in een enkele 8-cell embryo bewezen dat chimerisatie op cellulair niveau van vele organen van de ontvanger embryo. Merk op dat cellen spruiten worden gevonden in menselijk weefsel ontvangende muizen organen na toediening van humane hematopoietische stamcellen in een blastocyst. Gevonden werd dat in muizenembryo's tijdens de vorming van het bloed circulerende organen pluripotent hESCs. Het is mogelijk dat hun biologische functie is de organisatie van de toekomst foetale immuunsysteem. Met ESC in vitro gereproduceerd adequate modellen van menselijke genetische ziekten: dubbel knockout modellen dystrofine-gen in muizen van Duchenne spierdystrofie, shutdown atm gen (stuursignaal synthese kinase chromatine) - ataxie-teleangektaziyu. In dit geval is een dodelijke erfelijke ziekte bij kinderen als gevolg van defecten in DNA herstel ontwikkelt degeneratie van Purkinje cellen in het cerebellum, die gepaard gaat met een involutie van de thymus vanwege de dood van de prolifererende cellen. Kliniek, pathofysiologie en patomorfologija ataxie-teleangek- tazii weergegeven via de introductie in de ESC abnormale genetische informatie van muizen chimeren overeenkomen met die bij mensen. Verder ataxie-teleangektazii behulp PGC en knockout muizen ontwikkelden experimenteel model, sommige erfelijke homozygote menselijke ziekten geassocieerd met aandoeningen van koolhydraat- en lipidemetabolisme, katabolisme van aminozuren, verwijderen van koper en bilirubine, die de mogelijkheid van experimentele geneesmiddelen significant verhoogd voor preklinische testen van nieuwe werkwijzen voor het behandelen desbetreffende ziekten persoon.

[12], [13], [14], [15]

Het gebruik van cyto-hybride stamcellen

De hybride cellen verkregen door het fuseren van somatische cellen van hESCs, adequaat en veelbelovend Modelmatige stamcellen pluripotentie en herprogrammering van gedifferentieerde chromosomen. Tsitogibridy verkregen door de fusie van ESC met gedifferentieerde cellen van het volwassen dier, bieden de mogelijkheid om de verhouding tussen de genomen van verschillende "leeftijd" bestuderen: ontwikkelt een unieke situatie waarin de homologe chromosomen afkomstig van cellen van verschillende stadia van differentiatie en schommelende, in dezelfde kern, waar ze kunnen gemakkelijk transdeystvuyuschimi delen regulerende signalen. Het is moeilijk te voorspellen hoe zal reageren tsisregulyatornye epigenetische systeem van homologe chromosomen tijdens yn bestaande dividuele ontwikkeling, in antwoord op de impact transdeystvuyuschih signalen uit embryonale verwante genomen. Bovendien is in de hybride cellen voorkomt scheiding van de ouderlijke chromosomen waarmee de interactie van het genoom op verschillende chromosoomniveau bestuderen, d.w.z. Eventueel het kader van specifieke chromosomen te identificeren bij het onderhoud van pluripotentie of integendeel, een output in differentiatie.

Als het eerste experimentele model voor het bestuderen van de interactie van genomen met verschillende "geschiedenis van ontwikkeling", werden cyto -hybriden verkregen door de fusie van pluripotent teratocarcinoom en gedifferentieerde somatische cellen gebruikt. In sommige gevallen behielden dergelijke hybride cellen pluripotente eigenschappen op een voldoende hoog niveau. In het bijzonder induceerden in vivo teratocarcinoom-somatische hybride cellen de ontwikkeling van echte teratomas die de derivaten van alle drie germinale vellen bevatten, en in vitro werden embryoïde lichamen gevormd in de suspensieculturen. Zelfs in interspecifieke cytohybriden van dit type werden embryonale antigenen opgemerkt in gevallen waarin somatische partners in de fusie met teratocarcinoomcellen lymfocyten of thymocyten hadden. Het is opmerkelijk dat de cyto-hybriden gecreëerd door de fusie van teratocarcinoomcellen met fibroblasten overeenkwamen met fibroblasten volgens het fenotype.

Het belangrijkste is dat vaststaat dat in teratokartsinomno hybride somatische cellen bleek tekenen genoom herprogrammering van gedifferentieerde cellen, gekenmerkt door een reactivering van afzonderlijke genen of inactieve X-chromosoom somatische partner. De resultaten van studies over cytohybrididen zoals teratocarcinomatische somatische cellen geven dus aan dat hybride cellen vaak pluripotentie behouden en er zijn tekenen van herprogrammering van het genoom van de somatische partner.

In de experimenten embryonale intraspecifieke hybridecellen eigenschappen zoals tsitogibridov, segregatieanalyse ouderlijke chromosomen en beoordeeld pluripotentie hybride genoom te verkrijgen door het fuseren van splenocyten met de muis SER volwassen dieren bestudeerd. Voor het soorthybride cellen die door fusie teratocarcinoomcellen met somatische cellen, in het algemeen gekenmerkt door lage segregatie van chromosomen tetraploïde of nabij tetraploïde-karyotype. Een vergelijkbare chromosomale samenstelling werd waargenomen in de cytohybride door de fusie van primaire geslachtscellen met lymfocyten. Op hetzelfde moment, de soorthybride cellen verkregen als een gevolg van de fusie van de muis lymfocytceloppervlakglycoproteïne teratokartsinomnyh nertsen, was er intense scheiding van de chromosomen somatische partner.

Een kwalitatief nieuwe fase in de studie van scheiding van de ouderlijke chromosomen in soorthybriden kwam na de ontwikkeling van microsatelliet analyse onder toepassing van de polymerasekettingreactie, waarbij elke muis chromosoom gevonden enkele honderden merkers, zodat betrouwbaar onderscheid tussen twee homologe chromosomen in de hybride cellen.

Door het samenvoegen ESK (via HM-1 cellen deficiënt gipoksantinfosforiboziltransferazy activiteit, 2n = 40, XY, geïsoleerd uit blastocysten muizenstam 129 / 01a) met splenocyten van muizen congenic lijn DD / c niet de reeks hybride klonen ontvangen morfologisch moest gelijkenis met hESCs. Alle klonen werden geïsoleerd op een selectief medium waarin alleen cellen met actieve hypoxanthinefosforibosyltransferase kunnen groeien. Elektroforetische analyse onthulde de aanwezigheid van alle klonen allelische variant gipoksantinfosforiboziltransferazy karakteristieke muizen DD / c. Met behulp van cytogenetische analyse bleek dat van de vier hybride klonen drie een bijna-diploïde set chromosomen hadden. Eén bijna-tetraploïde kloon bevatte twee populaties van hybride cellen, waarvan één tetraploïde en de tweede, de kleinere, diploïde.

Analyse van microsatelliet zodat elk paar homologe chromosomen muis 129 / 01a en DD / c discrimineren, in het hybride klonen met okolodiploidnym reeks toonden aan dat klonen zich in twee verschillende preferentiële verwijdering autosomen somatische partner. De meeste autosomaal klonen HESS2 en HESS3 hadden markers lijn 129 / 01a, dat wil zeggen, pluripotent partner. De uitzondering was het chromosoom 1 en I: klonen HESS2 en HESS3, samen met markers van HM-1 cellen, een klein aantal markers aanwezig somatische partner. Deze resultaten kunnen onvolledig segregatie van chromosomen 1 en en somatische partners weerspiegelen en verenigbaar zijn met cytogenetische gegevens trisomie chromosomen die optreedt in 30-40% HESS2 en HESS3 celklonen. HESS4 kloon verschilde aanzienlijk chromosomale samenstelling: veel autosomen Deze kloon afkomstig uit het genoom ESK (chromosomen 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 13, 14 en 17), maar de chromosomen 1, 9, 11, 12, 15, 16, 18 en 19 werden vertegenwoordigd door homologen van beide ouders. De kwantitatieve verhouding van microsatelliet markers deze homologe chromosomen overeen ongeveer 1: 1. Hierdoor konden de auteurs suggereren dat homoloog is afgeleid van het genoom van de ESC en de andere - van gedifferentieerde cellen. In sommige subklonen van kloon waargenomen HESS4 alleen token aanwezigheid van chromosomen 18 en 19 somatische partner. De resultaten geven aan dat de cellen te klonen HESS4, in aanvulling op de segregatie van chromosomen somatische partner, was er de eliminatie van één of beide homologen van de hierboven chromosoom pluripotente genoom, dat wil zeggen, er was een tweezijdige segregatie van chromosomen van beide ouders - het fenomeen is vrij ongebruikelijk, omdat tsitogibridov karakteristieke segregatie van chromosomen alleen een van de ouders.

Bovendien, na 20 passage, alle klonen hybride cellen bevatten alleen het X-chromosoom merkers van de somatische partner, dat wil zeggen in de klonen werd vervangen X chromosoom ESC op het X-chromosoom van de somatische partner. Dit wordt bevestigd door in situ hybridisatiegegevens met behulp van een FITC-gelabelde probe specifiek voor het X-chromosoom van de muis: een positief signaal werd alleen op één chromosoom gedetecteerd. Opgemerkt moet worden dat in eerdere stadia van de teelt (tot de 15e passage), volgens cytogenetische gegevens, in veel cellen twee X-chromosomen waren. Bijgevolg is het gebruik van selectieve media kunt u de chromosomale samenstelling van de hybride cel manipuleren en gericht om klonen te dragen enkel chromosoom somatische partner SER's op de achtergrond genoom te selecteren.

Als een unieke eigenschap van het genoom tsitogibridov is de lokalisatie van oudergenomen in een enkele kern, natuurlijk, roept de vraag op het handhaven van de eigenschappen van pluripotente embryonale genoom ESC-somatische cel hybriden onder de omstandigheden nauw contact met het genoom van gedifferentieerde cellen. Morfologisch leek de cytohybride van ESC en somatische cellen op de ouderlijn van de ESC. De evaluatie van pluripotentie toonde aan dat alle klonen met een bijna-diploïde reeks chromosomen embryoïde lichamen konden vormen in suspensieculturen waarin derivaten van drie germinale vellen aanwezig waren.

De meeste hybride cellen bevatten het ECMA-7-antigeen, een kenmerk dat kenmerkend is voor vroege muizenembryo's, en hadden ook een hoge activiteit van alkalische fosfatase. De meest overtuigende gegevens over de hoge pluripotente eigenschappen van hybride cellen werden verkregen in experimenten voor het verkrijgen van een reeks injectiechimeren met hybride cellen van de kloon HESS2. Een analyse van biochemische markers liet zien dat afstammelingen van donor-hybride cellen werden gevonden in de meeste chimere weefsels. Dientengevolge behouden hybride cellen verkregen door fusie van ESC en somatisch gedifferentieerde cellen pluripotentie op een hoog niveau, waaronder het vermogen om chimeren te vormen wanneer ze in de blastocystholte worden ingebracht.

Klonen HESS2 en HESS4 verschilden significant in de samenstelling van de ouderchromosomen, maar ze hadden vergelijkbare pluripotente eigenschappen. Men zou kunnen geloven dat pluripotentie in het hybride genoom zich manifesteert als een dominant kenmerk, maar het is mogelijk dat niet alle chromosomen van het embryonale genoom betrokken zijn bij het proces van het behouden van pluripotentie. Als deze aanname juist is, kan worden verwacht dat de eliminatie van sommige chromosomen van de pluripotente partner uit het hybridoma-genoom niet gepaard zal gaan met een verandering in hun pluripotente status. In dit geval zou een analyse van de segregatie van ouderlijke chromosomen in embryonale hybride cellen een nauwe benadering mogelijk maken van de identificatie van chromosomen die verantwoordelijk zijn voor het beheersen van de pluripotentie van embryonale cellen.

Serov O. Et al (2001) van de 50 nakomelingen verkregen van kruisingen van de chimeren met normale muizen, die welke het genotype muizen 129 / 01a zou hebben, en die het X-chromosoom DD muizen. De auteurs zien de reden hiervoor in de vermindering van pluripotentie in hybride cellen onder invloed van het somatische genoom. Een alternatieve verklaring kan het negatieve effect van trisomie enige onbalans autosomen en sex chromosomen (XXY waargenomen in cellen die tot de 15e passage) in de hybride cellen bij passage van meiose. Het is bekend dat cellen van XXY geen meiose kunnen doormaken en gameten kunnen vormen. Trisomie kan ook een afname in proliferatieve activiteit van hybride cellen veroorzaken, waardoor het selectieve voordeel bij de ontwikkeling van chimeren tot de cellen van het ontvangende embryo kan behoren. Hieruit volgt dat om het pluripotente potentieel van hybride cellen adequaat te evalueren, het noodzakelijk is om hybride klonen te verkrijgen met een normale diploïde set chromosomen.

In experimenten Serova O. Et al (2001) Eerst toonde de mogelijkheid herprogrammeren van de X-chromosoom in het genoom van een somatische cel hybride cellen. Deze conclusie volgt uit de auteurs analyseren de expressie van chimeren HPRT-gen (X-chromosoom marker): de aanwezigheid van allelische varianten hprt DD / c muizen werd gedetecteerd in alle weefsels chimere geanalyseerd. Er zij op gewezen dat na de introductie van hybride cellen in de blastocyst holte tsitogibridy vallen in niet-selectieve omstandigheden en het behoud van het X-chromosoom in het genoom van de hybride cellen betekent dat zij een obligaat onderdeel van het genoom is geworden, doch deze niet te onderscheiden van het Y-chromosoom pluripotente partner.

Samenvattend de resultaten van de analyse van de interactie van somatische en pluripotente genomen in hybride embryonale cellen, concluderen de auteurs dat in sommige cyto-hybriden pluripotentie zich manifesteert als een dominant kenmerk. Een hybride genoom is in staat individuele chromosomen van gedifferentieerde cellen te herprogrammeren, wat echter niet de mogelijkheid uitsluit van het omgekeerde effect van het somatische genoom op de pluripotentie van het embryonale genoom. Bij de kweek van hybride cellen vindt inductie van differentiatie veel vaker plaats dan in de oorspronkelijke ouderlijn van de ESC NM-1. Een vergelijkbaar effect wordt waargenomen bij de vorming van primaire kolonies: veel primaire kolonies van embryonale hybride cellen differentiëren in de vroege stadia van vorming met grote verliezen van klonen gedurende hun selectie en vermenigvuldiging.

Dus, cytohybrides gecreëerd door de fusie van ESCs met somatische cellen, ondanks nauw contact met het genoom van gedifferentieerde cellen, behouden pluripotentie als een unieke eigenschap van het embryonale genoom. Bovendien is het in dergelijke hybride cellen mogelijk om de individuele chromosomen afkomstig van de gediffundeerde cellen te herprogrammeren. Het blijft onduidelijk hoe volledig de pluripotente eigenschappen van het embryonale genoom in hybride cellen aanhouden, in het bijzonder hun vermogen om deel te nemen aan de vorming van de embryonale route in chimera's. Hiervoor is het noodzakelijk om embryonale hybride cellen te verkrijgen met een normaal karyotype. In elk geval kan de pluripotente embryonale hybridecellen een echt model voor genetische identificatie van chromosomen betrokken bij het handhaven van pluripotentie of haar controle bilaterale segregatie van de ouderlijke chromosomen potentieel biedt een dergelijke kans.

Niet minder aantrekkelijk is de studie van het fenomeen, die O. Serov en co-auteurs (2001) definiëren als "chromosomaal geheugen". In de hybride genoom homologe chromosomen zijn twee alternatieve configuraties: homologen somatische partner eenmaal ondergaan differentiatie, terwijl homologen pluripotente partner wordt dit proces net begonnen. Daarom handhaven van hoge pluripotente eigenschappen van hybride cellen geeft aan dat "pluripotent" configuratie homologen ESC redelijk stabiel hybride genomen, ondanks het effect van transdeystvuyuschih factoren afkomstig van de somatische partner. De hierboven beschreven kenmerken van herprogrammering gedifferentieerde genoom homologe chromosomen tijdens de ontwikkeling van chimaera niet uitsluiten dat de eerste fasen van de vorming in vitro kweken en ze tsitogibridov status verworven tijdens differentiatie in vivo behouden. Volgens recente gegevens, bij het overbrengen van de embryonale hybride cellen in niet-selectief medium waarin er een intensieve enige eliminatie chromosomen somatische partner, d.w.z. Het genoom van hybride cellen gemakkelijk onderscheid homologen na in vitro kweek gedurende 10-15 passages. Aldus vormen embryonale hybride cellen een veelbelovend experimenteel model voor het bestuderen van niet alleen een dergelijke fundamentele eigenschap van het embryonale genoom als pluripotentie, maar ook de alternatieven ervan - embryonale differentiatie.

Therapeutische werkzaamheid van embryonale stamceltransplantatie

Alvorens de therapeutische werkzaamheid van ESC-transplantatie en hun derivaten te analyseren, vatten we het bovenstaande materiaal samen. Voorzieningen ESC wat betreft de volledige uitvoering van embryogenese in vitro onvoldoende vanwege defecten in dit geval door het ontbreken van mesenchymale stamcellen die in het lichaam voorkomen zelfstandig en onafhankelijk van hESCs. De genetische potentie van ESC is minder dan het genetische potentieel van de zygoot, daarom wordt het niet direct gebruikt voor het kloneren van embryo's. Het unieke biologische potentieel van ESC als de enige cellen waarin ontwikkelingsprogramma's worden ingezet in volledige sequentiële implementatie, vindt toepassing in studies over de functie van genen. Met behulp van de ESC worden de eerste combinaties van signalen die de expressie van vroege en late genen activeren die coderen voor de ontwikkeling van drie embryonale vellen, ontcijferd. Het behoud van de pluripotentie van het ESC-genoom in vitro maakt hen tot een uniek hulpmiddel voor reparatieve regeneratie, dat in staat is automatisch cellulaire verliezen bij schade aan organen en weefsels aan te vullen. Idealiter hypothetische uitvoeringsvorm kan aannemen dat "... De transplantatie van donor PGC's in het ontvangende organisme overgebracht compact verpakt programma dat onder gunstige omstandigheden worden gerealiseerd in de bouw van nieuwe tkani'7 capable" ... Effectief geïntegreerd in het lichaam van de ontvanger morfologische, zowel functioneel als functioneel. "

Natuurlijk, na de ontwikkeling van werkwijzen voor monodifferentiatie van ESC, begon de in vivo studie van de functionele activiteit van cellen verkregen in vitro uit een enkele gespecialiseerde kloon. De prolifererende ESO-kloon genereert populaties van migrerende progenitorcellen die werkelijk in staat zijn om actief te integreren in de weefselbeschadigingszones van de ontvanger, die wordt gebruikt in regeneratief-plastic geneeskunde. Er is vastgesteld dat transplantatie van Dopa-neuronen in substantia nigra klinische manifestaties bij experimenteel hemiparkinsonisme vermindert. Regionale transplantaties van donorneurale stamcellen verminderen de mate van motorische stoornissen veroorzaakt door trauma of contusie van het ruggenmerg en de hersenen. Ontvangen en de eerste positieve resultaten van stamceltransplantatie bij demyeliniserende ziekten. Het lijkt erop dat de regeneratieve-plastische potenties van ESC's onbeperkte mogelijkheden bieden voor het gebruik van cellulaire transplantatie in praktische geneeskunde. Bij transplantatie naar ectopische zones worden ESC's echter onvermijdelijk omgezet in tumoren. Bij subcutane injectie van ESC in immunodeficiënte muizen worden teratomen gevormd. Wanneer de ESK-suspensie wordt getransplanteerd onder de capsule van de testis in syngene muizen, wordt ook een teratoom gevormd, bestaande uit verschillende weefsels, waarvan de cellen zijn afgeleid van alle drie embryonale blaadjes. In dergelijke teratomen zijn de processen van verminderde organogenese uiterst zeldzaam.

Een aantal werken verschaffen informatie over de positieve resultaten van transplantatie van vroege derivaten van ESCO's aan dieren met een ex-perimentale pathologie. Cel neurotransplantatie met behulp van ESC-derivaten is verder ontwikkeld in het experiment en de eerste klinische proeven om functionele stoornissen in cerebrale en spinale letsels, de behandeling van syringomyelie en multiple sclerose te corrigeren (Repin, 2001). Met de opkomst van de techniek van neuronogenese van ESK in vitro, worden in plaats van embryonaal hersenweefsel methoden van transplantatie van derivaten van neurospheres afgeleid van embryonale zenuwweefselculturen ontwikkeld. Dergelijke transplantatiesuspensies zijn veel homogener en bevatten gecommitteerde voorlopers van neuronen en neuroglia.

Naast het standaardkweekmedium met retinolzuur in een dosis van 10 ug / ml gedurende 6 weken in embryonale lijnen (teratomen) NTERA-2 humane -kartsinomy gevormd over 80% van de post-mitotische neuronen. De volledige homogeniteit van de neuronale bevolking wordt bereikt door flow sorting gelabeld immuunfenotypische markers van volwassen neuronen die kan ontdoen van de overblijfselen teratokartsinomnyh en onrijpe cellen. Na transplantatie in verschillende gebieden van het brein van proefdieren, overleven dergelijke neuronen niet alleen, maar zijn ze ook ingebouwd in regionale neurale netwerken. Bij dieren met experimentele modellen van plaatselijke gebreken CNS neurotransplantatie vermindert klinische manifestaties van humane pathologie zoals de effecten van craniocerebraal trauma, beroerte, demyelinerende ziekten, erfelijke cerebellaire ontwikkeling afwijkingen, ziekten afzetting van lipiden en polysacchariden.

Om de regeneratieprocessen in degeneratieve ziekten van het centrale zenuwstelsel te optimaliseren, worden technologieën voor de bereiding van myeline-producerende oligodendrocyten van ESK ontwikkeld. De eerste fase omvat traditioneel de proliferatie van ESC's met de vermenigvuldiging van het aantal cellen dat nodig is voor transplantatie. In de tweede fase wordt gerichte differentiatie van cellen in een populatie van myeline-producerende oligodendrocytvoorlopers uitgevoerd, die wordt gecontroleerd door selectieve merkerantigenen.

Sommige vooruitzichten in gebruik genomen derivaten SER op werkwijzen voor het corrigeren van immunodeficiëntie veroorzaakt door genetische defecten in de maturatie van de thymus ontwikkelen. In studies bij knock-out (rag 1) muizen met geïnduceerde gendefect - overtredingen recombinatiemechanisme V (D) J-gen loei TCR, leidt tot een verlies van functie van T-lymfocyten, transplantatie vroege derivaten van PGC's in thymus dier herstelt rijping van normale populaties van immuuncellen klonen belast cellulaire immuniteit. Klinische proeven met transplantatie voorgevormd in vitro hESCs voor de behandeling van dodelijke erfelijke bloedarmoede bij kinderen.

Bezwaren tegen de snelle introductie van stamceltransplantatie in de kliniek worden gerechtvaardigd door een beperkt aantal stabiele lijnen van menselijke embryonale stamcellen en de behoefte aan hun standaardisatie. Om de zuiverheid van gestandaardiseerde ESC-lijnen, evenals volwassen stamcellen te verhogen, wordt voorgesteld om de methode van lijnselectie te gebruiken op basis van de moleculair genetische analyse van korte tandem-DNA-herhalingen. Het is ook nodig om de ESC-lijnen te testen op de aanwezigheid van kleine chromosomale herschikkingen en genetische mutaties, de potentiële mogelijkheid van hun optreden onder omstandigheden van celcultuur is voldoende hoog. Thesis zich verplicht testen van de eigenschappen van alle soorten PGC en regionale pluripotente stamcellen, aangezien hun propagatie in vitro tot nieuwe kenmerken niet inherent aan embryonale stamcellen tot blijvende of weefsels kan geven. In het bijzonder wordt aangenomen dat langdurige kweek in medium met cytokinen Hess dichter bij de tumorcellen, aangezien zij ook gelijkwaardig veranderende routes celcyclus reguleren van de overname van de mogelijkheid om een onbeperkt aantal celdelingen voeren. Sommige auteurs beschouwen, op basis van het potentieel voor de ontwikkeling van tumoren, menselijke transplantatie van vroege derivaten van embryonale stamcellen als roekeloosheid. Naar hun mening is het veel veiliger om de toegewijde afstammelingen van het ESC, dat wil zeggen de lijnen van de voorouders van gedifferentieerde cellen, te gebruiken. Een betrouwbare techniek voor het verkrijgen van stabiele menselijke cellijnen die in de juiste richting differentiëren, is echter nog niet ontwikkeld.

Zo zijn er in de literatuur meer en meer gegevens over het positieve therapeutische effect van transplantatie van menselijke embryonale stamcelderivaten. Veel van deze werken zijn echter onderhevig aan herziening en kritiek. Sommige onderzoekers geloven dat de resultaten van vroege klinische onderzoeken voorlopig van aard zijn en suggereren alleen dat stamcellen een gunstig effect kunnen hebben op het klinische beloop van een ziekte. Daarom is het noodzakelijk om gegevens te verkrijgen over de langetermijnresultaten van celtransplantatie. Als argument worden de stadia van ontwikkeling van klinische neurotransplantologie gegeven. Inderdaad, in de literatuur, aanvankelijk gedomineerd door de publicatie van het hoge rendement van de hersentransplantaties fragmenten van embryo's bij de ziekte van Parkinson, maar begon toen te ontkennen rapporten therapeutische effectiviteit van embryonaal of foetaal neuraal weefsel getransplanteerd in de hersenen van patiënten lijken.

Voerde de eerste klinische proeven beoordeling van de veiligheid van transplantatie neuroblast - derivaten van PGC NTERA-2 teratocarcinoom werden onrijpe cellen die prolifereren in kweek blootgesteld aan opslag 100000000 celmassa. Sommige van de aldus verkregen cellen werden gebruikt voor het karakteriseren van het fenotype en voor het bepalen van celverontreinigingen, evenals voor het testen op mogelijke contaminatie door virussen en bacteriën. Uit het kweekmedium verwijderd LIF en voedende laag van stromale cellen en foetale voorwaarden geschapen voor gerichte differentiatie van hESCs in neuroblasts met een combinatie van cytokinen en groeifactoren. Vervolgens werden de neuroblasten gezuiverd uit onrijpe teratocarcinoomcellen op een stroomkorf-sorteerder. Na de tweede zuivering en karakterisering van het fenotype van getransplanteerde cellen neuroblasts (10-12000000) suspensie met een speciale injectiespuit en microcannulas stereotaxie en onder besturing van CT geïnjecteerd in de nucleus basalis van de hersenen van de patiënten (de zevende maand na hemorragische beroerte). Een post-transplantatieonderzoek van één jaar van de gevolgen van neuronale transplantatie in de beroerte-zone vertoonde geen bijwerkingen en ongewenste effecten. De helft van de patiënten ondervond een verbetering in de motorische functie in de periode van 6 tot 12 maanden na de transplantatie. Positieve klinische veranderingen gingen gepaard met een verhoging van de bloedtoevoer slaggebied na transplantatie van cellen: gemiddelde absorptie verhoging van de fluorescentie-gelabelde 2-deoxyglucose, volgens positronemissietomografie bereikte 18%, en bij sommige patiënten - 35%.

Het Amerikaanse National Institute of Health heeft echter een onafhankelijke studie uitgevoerd naar de klinische werkzaamheid van neurotransplantatie bij patiënten met parkinsonisme. Patiënten in de eerste groep werden getransplanteerd met embryonaal zenuwweefsel dat dopamine produceerde, terwijl de tweede groep patiënten een foutieve operatie onderging. De resultaten wijzen op een nul klinische werkzaamheid van dergelijke neurotransplantatie, ondanks het feit dat dopamine-producerende embryonale neuronen in de hersenen van ontvangers overleefden. Bovendien, na 2 jaar na transplantatie van neurale weefsel in 15% van de patiënten ontwikkelden aanhoudende dyskinesie, die afwezig is bij patiënten in de placebogroep (Stamcellen: wetenschappelijke vooruitgang en toekomstig onderzoek richtingen Nat Inst, of Health USA ...). Waarnemingen van de verdere ontwikkeling van de ziekte bij deze patiënten gaan door.

Sommige auteurs schrijven de tegenstrijdige literatuur over de evaluatie van de klinische werkzaamheid neurotransplantatie gegevens met een andere benadering van de selectie van patiënten groepen, onvoldoende keuze van objectieve methoden voor het beoordelen van hun conditie en, belangrijker nog, verschillende termen van de ontwikkeling van de foetus zenuwweefsel en in verschillende delen van de hersenen van waaruit het weefsel werd geproduceerd in verschillende maten transplantatie en methodische kenmerken van chirurgie.

Opgemerkt moet worden dat pogingen om pluripotente embryonale stamcellen in het striatum van de hersenen van de rat te transplanteren met experimenteel hemiparkinsonisme gepaard gingen met proliferatie van ESC en hun differentiatie in dopaminerge neuronen. Aangenomen moet worden dat de nieuw gevormde neuronen effectief ingebouwd in het neuronale netwerk SER na transplantatie correctie van afwijkingen in gedrag en motorische asymmetrie waargenomen in apomorfineproef. Tegelijkertijd stierven enkele van de dieren als gevolg van de transformatie van getransplanteerde ESK in de hersentumor.

Experts van het Amerikaanse Nationale en Medische Academie, specialisten van de National Institutes of Health zijn van mening dat de klinische potentieel van hESCs verdient serieuze aandacht, echter, aandringen op de noodzaak van een gedetailleerde studie van hun eigenschappen, de kans op complicaties en lange-termijn effecten in experimenten met voldoende biologische modellen van menselijke ziekten (Stamcellen en de toekomstige regeneratieve geneeskunde National Academy Press;. Stamcellen en het toekomstig onderzoek richtingen Nat Inst, of Health USA)...

Vanuit dit oogpunt is het belangrijk dat de vergelijkende histologische analyse van experimentele teratoma verkregen door transplantatie in testis slurry PGC met teratomas die zijn ontstaan als gevolg van transplantatie vroege embryo die ook inclusief onderhavige ESC gebleken dat ESK ongeacht hun oorsprong of interactie met door die of andere omliggende cellen op dezelfde manier hun tumorigene potenties realiseren. Bewezen dat dergelijke teratomas een klonale oorsprong, aan een tumor SER optreden, bestaat uit de derivaten van alle drie kiembladen (.Rega, 2001). Het is opmerkelijk dat wanneer getransplanteerd in immunodeficiënte muizen gekloond PGC's met een normaal karyotype en teratomas gevormd uit verschillende soorten gedifferentieerde somatische cellen. Deze experimentele gegevens zijn het perfecte bewijs van de klonale oorsprong van de teratom. Vanuit het perspectief van de ontwikkelingsbiologie, suggereren ze dat het geen veelvoud van gecommitteerde progenitorcellen en pluripotente stamcel identiteit van de bron van gedifferentieerde derivaten van alle drie kiembladen, teratoma componenten. In de praktijk celtransplantatie resultaten van deze onderzoeken zijn, zo niet prohibitief dan een waarschuwing van potentieel gevaar, omdat inoculatie ESC of primordiale kiemcellen in verschillende weefsels van volwassen immunodeficiënte muizen onvermijdelijk veroorzaakt de ontwikkeling van tumoren van de getransplanteerde stamcellen. Neoplastische degeneratie ectopisch getransplanteerd ESC gepaard met het ontstaan van satelliet populaties van gedifferentieerde cellen - door gedeeltelijke differentiatie zeker SER's en voorlopercellen klonen huurlijnen. Het is interessant dat de transplantatie hESCs in de skeletspier cellen in de buurt van teratokartsinomnymi neuronen vormen vaker. In toedienen PGC Foelie ei of blastocyst vergezeld van de integratie in de geslachtscellen zonder de vorming van neoplastische cellen. Op hetzelfde moment dat de ESC ingebed in bijna alle organen en weefsels van het embryo, waaronder seksuele rudiment. Zoals allofennye dieren werden eerst bereid door de teratocarcinoom cel 129 in de vroege stadia van embryo's in 8-100 cellen. In allofennyh muizen populaties geterogenomnyh cel afgeleide donor PGC's worden in het beenmerg, darmen, huid, lever en genitaliën, die het mogelijk maakt om het experiment ook interspecies cel chimaera. Hoe kleiner de tijd van de vroege embryo, hoe hoger het percentage van de cel chimerisatie, de hoogste graad chimerisatie waargenomen in het hematopoietische systeem, huid, zenuwstelsel, de lever en de dunne darm allofennogo embryo. In het volwassen organisme het weefsel geschikt chimerisatie beschermd tegen blootstelling aan het immuunsysteem van de ontvanger gistogematicalkie barrières: transplantatie primordiale kiemcellen in de testis parenchym vergezeld door insertie van donor stamcellen in het ontvangende weefsel germenativny laag. Echter ESC transplantatie in een blastocystvorming chimeer primordia genitaliën met opwekking donor primordiale kiemcellen niet optreden. ESC pluripotentie bij het maken van bijzondere voorwaarden en kan worden gebruikt voor klonering: ESC transplantatie muizen 8-16 cellen muizenembryo celmitose waarbij tsitokalazinom geblokkeerd, draagt bij tot de normale embryogenese bij de ontwikkeling van het embryo donor PGC.

Bijgevolg is een alternatief transplantatie van allogeen ESC therapeutisch klonen op basis van somatische celkernen transplantatie in een ontkernde eicel om een blastocyst binnenste celmassa waaruit vervolgens verdeeld lijn van genetisch identieke donor PGC somatische celkern te maken. Technisch gezien is dit idee haalbaar is, aangezien de mogelijkheid van de vorming van hESC lijnen uit blastocysten verkregen na transplantatie van somatische kernen in ontkernde eicel herhaaldelijk aangetoond in experimenten met proefdieren (Nagy, 1990; Munsie, 2000). Met name bij muizen die homozygoot zijn voor de mutatie rag2 fibroblasten verkregen door het kweken subepidermal weefselcellen werden als donorkernen worden getransplanteerd in ontkernde eicellen. Na activering oocyten "zygote" gekweekt tot blastocyst vorming van de binnenste celmassa is geïsoleerd PGC en leiden daarvan in een leiding voor het mutante gen nullizigotnyh cellen (rag2 ~ / ~). Door homologe recombinatie in dergelijke ESC's werd de mutatie van één allelisch gen gecorrigeerd. In de eerste reeks experimenten uit hESCs teruggewonnen recombinant gen embryoïde lichamen werden daarvan bereid getransfecteerde cellen met een recombinant retrovirus (HoxB4i / GFP) en na propagatie in muizen geïnjecteerd ader rag2 ~ / ~. In de tweede reeks werden tetraploïde blastomeren geaggregeerd met genetisch gemodificeerde ESC's en getransplanteerd naar hun vrouwelijke ontvangers. De geboren immunocompetente muizen dienden als beenmergdonoren voor transplantatie aan mutante muizen rag2 ~ / ~. In beide reeksen was het resultaat positief: na 3-4 weken werden alle normale muizen en lymfoïde cellen gevonden die in staat waren immunoglobulinen te produceren. Aldus kan transplantatie in de eicel kernen van somatische cellen niet alleen gebruikt om hESC lijnen, maar ook tsitogenoterapii produceren - Correctie van erfelijke afwijkingen met behulp ESC als een vector voor het transport van het corrigeren van genetische informatie. Maar in deze richting van celtransplantatie zijn er, naast bio-ethische problemen, beperkingen. Het is niet duidelijk hoe veilig de transplantatie van therapeutisch gekloonde cellen met een genotype identiek aan het genotype van een bepaalde patiënt zal zijn, omdat dergelijke cellen mutaties kunnen introduceren die vatbaar zijn voor andere ziekten. Normale menselijke eieren ontoegankelijk object, terwijl ook bij transplanteren somatische kernen in ontkernde eicel dier slechts 15-25% ontwikkelt "zygote" ontwikkelen tot het blastocyst stadium. Er is niet bepaald hoeveel blastocyst nodig is om een enkele lijn van pluripotente gekloneerde ESC's te verkrijgen. Opgemerkt dient te worden en hoge financiële kosten verbonden aan de complexiteit van de therapeutische kloonmethodologie.

Concluderend, de ESC pluripotentie hypomethylated genoom DNA wordt gecombineerd met een hoge telomerase-activiteit en korte C ^ celcyclus fase, die intensieve en potentieel oneindige vermeerdering, waarin de PGC behouden diploïde chromosomen en "jeugdige" aantal fenotypische eigenschappen verzekert. Klonale groei van PGC's in cultuur sluit niet uit dat ze differentiëren in gespecialiseerde cel van het organisme op een stopstreep proliferatie en het toevoegen van de juiste regulerende signalen. Beperking differentiatie van hESCs in lijn in vitro somatische cellen wordt gerealiseerd zonder de deelname van mesenchym, Nohteyaov omzeilen, is organogenese en zonder de vorming van het embryo. Ectopische in vivo toediening PGC onvermijdelijk leidt tot de vorming teratocarcinoom. ESC transplantatie in een blastocyst of vroege embryo vergezeld van hun integratie in de weefsels van het embryo en zijn stabiele chimerisatie organen.

Regeneratieve en kunststof technologieën op basis van celtransplantatie is het snijpunt van de belangen van de leden van celbiologie, ontwikkelingsbiologie, experimentele genetica, immunologie, neurologie, cardiologie, hematologie, en vele andere gebieden van de experimentele en praktische geneeskunde. De belangrijkste experimentele resultaten bewijzen de mogelijkheid herprogrammeren van de stamcellen met de richting van de verandering van hun eigenschappen, die opent perspectieven voor het besturen cytodifferentiation processen groeifactoren - voor myocardiale regeneratie, herstel van CNS letsels en normalisatie van de functie van de eilandjes inrichting van de alvleesklier. De algemene invoering transplantatie derivaten ESC medische praktijk moeten de eigenschappen van menselijke stamcellen nader en verdere experimenten met PGC in experimentele modellen van ziekten te onderzoeken.

Bio-ethische kwesties en het probleem van de afstoting van allogene celtransplantatie kan de waargenomen plasticiteit van het genoom van de regionale volwassen stamcellen op te lossen. De eerste informatie is dat wanneer het transplanteren van de lever geïsoleerd en grondig kenmerk autologe hematopoietische cellen, waarvan er nieuwe hepatocyten, opnemen in het hepatische lobben, worden momenteel beoordeeld en bekritiseerd. Echter gepubliceerde gegevens die de transplantatie van neurale stamcellen in de thymus is de vorming van nieuwe kiemen van donor-T-en B-lymfocyten en transplanteren neurale stamcellen van de hersenen in het beenmerg leidt tot de vorming van hematopoietische kiem aanhoudende donor myeloïde en erythropoiese . Bijgevolg bij volwassen organen worden bewaard pluripotente stamcellen in staat zijn genoom herprogrammering van ESC capaciteit.

Het menselijke embryo blijft de bron van het ontvangen van het ESC voor medische doeleinden, die de onvermijdelijkheid bepaalt van een nieuwe kruising van morele, ethische, morele, wettelijke en religieuze problemen op het moment van de geboorte van het menselijk leven. De ontdekking van SER's gaf een krachtige impuls aan de hervatting van harde discussies over waar de grens tussen levende cellen en materie, substantie en persoonlijkheid ligt. Tegelijkertijd zijn er geen universele normen, regels en wetten met betrekking tot het gebruik van ESC in de geneeskunde, ondanks herhaalde pogingen om ze te creëren en te accepteren. Elke staat binnen zijn wetgeving lost dit probleem alleen op. Van hun kant blijven artsen van over de hele wereld proberen om regeneratieve plastic geneeskunde te ontwikkelen die verder gaat dan dergelijke discussies, voornamelijk door het gebruik van niet-embryonale stamcellen en de stamcelreserves van een volwassen organisme.

Een deel van de geschiedenis van embryonale stamcelisolatie

Terato- (embryo) cellen werden geïsoleerd uit -kartsinomnye spontaan optredende testicular teratomas muizenstam 129 / ter-Sv, spontane ovariale teratomas muizenlijnen Lt / Sv en van teratomen, ektopichno bron werden getransplanteerde cellen of embryonaal weefsel. Onder aldus verkregen terato- stabiele muizenlijnen (embryo) -kartsinomnyh sommige cellen zijn pluripotent, anderen werden onderworpen aan differentiatie alleen in cellen van een bepaald type, en sommige zijn in het algemeen niet in staat geweest cytodifferentiation.

Op dat moment lag de nadruk onderzoek dat een mogelijke terugkeer terato- (embryo) -kartsinomnyh cellen om normaal fenotype toonden na hun introductie in het zich ontwikkelende embryo weefsel, evenals het werk te creëren in vitro genetisch gemodificeerde terato- (embryo) -kartsinomnyh cellen, met behulp waarvan mutante muizen werden verkregen voor biologische modellering van menselijke erfelijke pathologie.

Geconditioneerde suspensiekweek werd gebruikt om de lijnen van terato-embryo-carcinoomcellen te isoleren. In kweek terato- (embryo) -kartsinomnye cellen, zoals SER, groeien embryoiden organen te vormen en moeten worden omgezet in een leiding bindende dissociatie handhaven pluripotentie op een voedingslaag embryonale fibroblasten of suspensie kweken in geconditioneerd medium. Terato- pluripotente cellen (embryo) - carcinoma grote lijnen, bolvormig, hebben een hoge activiteit van alkalische fosfatase, aggregaten vormen en kunnen multidirectionele differentiatie. Indien ingebracht in een blastocyst geaggregeerd met morulae, leidt tot de vorming van chimere embryo's in diverse organen en weefsels die derivaten vinden terato- (embryo) -kartsinomnyh cellen. De overgrote meerderheid van dergelijke chimere embryo's sterven in utero en in organen overlevende chimeren pasgeboren vreemde cellen en zelden gedetecteerd met een lage dichtheid. Op hetzelfde moment dat de incidentie van tumoren (fibrosarcoom, rhabdomyosarcoom, en andere soorten kwaadaardige zwelling en adenoma pancreas) sterk toeneemt en neoplastische degeneratie komt vaak zelfs in utero chimeer embryo.

De meeste van de terato-embryo-carcinoomcellen in de micro-omgeving van normale embryonale cellen krijgen bijna vanzelfsprekend kwaadaardige neoplastische kenmerken. Er wordt aangenomen dat onomkeerbare maligniteit te wijten is aan de activering van proto-oncogenen in het proces van structurele herschikkingen. Een uitzondering vormen de cellijnen embriokartsinomnoy SST3, teratoom afgeleid van muriene testis (line 129 / Sv-ter), die een hoge capaciteit om te integreren in de weefsels en organen van de foetus zonder daaropvolgende vorming van tumoren bij muizen chimerische vertonen. Derivaten van terato-embryo-carcinoomcellijnen in chimere muizen nemen praktisch niet deel aan de vorming van primaire gonocyten. Uiteraard is het verbonden met een hoge frequentie van chromosoomafwijkingen voor de meeste terato- (embryo) -kartsinomnyh lijnen waarin cellen waargenomen als aneuploïdie of chromosomale afwijkingen.

In het laboratorium werden verschillende stabiele lijnen van menselijke terato-embryo-carcinomen, gekenmerkt door pluripotentie, hoge proliferatieve activiteit en het vermogen om te differentiëren met groei in kweken, verkregen. In het bijzonder werd de lijn menselijke terato-embryo-carcinoomcellen NTERA-2 gebruikt om de mechanismen van neurale cytodifferentiatie te bestuderen. Na transplantatie van cellen van deze lijn in het subventriculaire gebied van de voorhersenen van pasgeboren ratten, werden hun migratie en neuronogenese waargenomen. Er zijn zelfs pogingen om neuronale terato- verkregen door het kweken van cellen (embryonale) -kartsinomnoy lijn NTERA-2, transplantatie patiënten met beroerte, die volgens de auteurs, leidend tot klinische verbetering van de ziekte. Tegelijkertijd werden gevallen van kwaadaardige getransplanteerde cellen van de terato-embryo-carcinoomlijn NTERA-2 niet waargenomen bij patiënten met een beroerte.

Evans en Martin ontvingen de eerste lijnen van niet-gedifferentieerde pluripotente embryonale stamcellen van muizen in de vroege jaren 80 van de vorige eeuw, waardoor ze werden geïsoleerd van de interne celmassa van de blastocyst, de embryoblast. De geïsoleerde ESC-lijnen voor een lange tijd bewaarden pluripotentie en het vermogen om te differentiëren in verschillende soorten cellen onder invloed van factoren van een speciaal kweekmedium.

De term "pluripotent embryonale stamcel" behoort Leroy Stevens dat het onderzoek tabaksteer invloed op de frequentie van tumorontwikkeling gewezen op het optreden van spontane testiculaire teratocarcinoma lineair (129 / v) van muizen van de controlegroep. Testiculaire teratocarcinoomcellen werden gekenmerkt door een hoge proliferatiesnelheid en bij aanwezigheid van vloeistof meer in de buikholte onder vorming van spontane differentiatie van neuronen, keratinocyten, chondrocyten, cardiomyocyten, evenals haar en botfragmenten, maar zonder enige indicatie van een geordende cytoarchitectonics geschikte weefsels. Bij het planten in teratocarcinoom celkweek gekweekt niet gehecht aan het substraat pluripotente klonen en vormden embryoïde lichamen werden daarna afgeschrikt en aan spontane splijting wanordelijke differentiëren tot neuronen, glia, spiercellen en hartspiercellen. Stevens gevonden dat teratocarcinoom muis 129 / v bevat minder dan 1% van de cellen kunnen differentiëren tot verschillende gespecialiseerde somatische leiding en zich differentiatie hangt af van factoren die hen aangaan (samenstelling peritoneale vloeistof, de producten toegevoegd aan de kweek van volwassen cellen of weefsels). Leroy Stevenson aanname voor de aanwezigheid onder teratocarcinoomcellen embryonale voorlopercellen seksuele kiemcellen bevestigd: de suspensie embryoblast implantatie embryo cellen in volwassen muizen weefsels gevormd teratocarcinoom en van elkaar gescheiden zijn zuivere cellijnen na intraperitoneale toediening aan ontvangende dieren waren gedifferentieerd tot neuronen, hartcellen en andere somatische kletki derivaten van alle drie kiembladen. In experimenten in vivo transplantatie ESK (verkregen van embryoblast maar niet trofoblast) in muizenembryo's in verschillende stadia lijnen 8-32 blastomere beëindigd geboorte van het chimere dieren (geen tumorvorming) in organen waarin spruiten donorweefsel detecteert. Chimerisme werd zelfs in de lijn van geslachtscellen waargenomen.

Primaire voorlopercellen kiemcellen geïsoleerd uit muizenembryo kiem geslacht, morfologie, immunologische fenotype en functionele eigenschappen om hESCs afgeleid van teratocarcinoom Stevenson en embryoblast. Op chimaera geboren na toediening van hESCs in een blastocyst, allofenny orgel morfogenese kenmerk mozaïek afwisselende donor en ontvanger structurele en functionele eenheden van de lever, longen en nieren. In een aantal gevallen werd de vorming van intestinale crypten of kwabjes van de lever, die gelijktijdig bestond uit de ontvangende en donorcellen, waargenomen. Echter, de realisatie van morfogenese vond altijd plaats volgens het genetische programma van de soort waartoe de ontvanger behoorde, en het chimerisme was alleen beperkt tot het cellulaire niveau.

Vervolgens werd vastgesteld dat de verspreiding van hESCs zonder cytodifferentiation op een feeder-laag afgeleide mesenchymale cellen (foetale fibroblasten) plaatsvindt bij aanwezigheid van LIF binding in selectieve voedingsmedia die selectief leveren alleen overleving van stamcellen en progenitorcellen, terwijl de overgrote meerderheid van de gespecialiseerde cellulaire elementen sterft. Met behulp van deze technieken in 1998 door James Thomson werd toegewezen vijf vereeuwigd lijnen van embryonale stamcellen uit de binnenste celmassa van een blastocyst persoon. In datzelfde jaar heeft John Gerhart een methode voor het isoleren van de onsterfelijke ESC lijnen van seksuele trekje van vier tot vijf weken menselijke embryo's ontwikkeld. Vanwege hun unieke eigenschappen, zijn in slechts twee jaar embryonale stamcellen en stamcellen van definitieve weefsels al begonnen te worden gebruikt in de praktijk van regeneratieve geneeskunde en gentherapie.