Kunsthartkleppen

Moderne biologische kunstmatige hartkleppen die beschikbaar zijn voor klinisch gebruik, met uitzondering van pulmonale autografts, zijn niet-levensvatbare structuren die geen groei- en weefselherstelpotentieel hebben. Dit legt aanzienlijke beperkingen op aan het gebruik ervan, met name bij kinderen, voor de correctie van kleppathologie. Weefselengineering heeft zich de afgelopen 15 jaar ontwikkeld. Het doel van deze wetenschappelijke richting is om onder kunstmatige omstandigheden structuren zoals kunstmatige hartkleppen te creëren met een trombosebestendig oppervlak en een vitaal interstitium.

[ 1 ], [ 2 ]

Hoe worden kunstmatige hartkleppen ontwikkeld?

Het wetenschappelijke concept van weefselmanipulatie is gebaseerd op het idee om levende cellen (fibroblasten, stamcellen, enz.) te bevolken en te laten groeien in een synthetisch of natuurlijk absorbeerbaar raamwerk (matrix). Dit is een driedimensionale klepstructuur. Ook wordt gebruikgemaakt van signalen die de genexpressie, organisatie en productiviteit van getransplanteerde cellen reguleren tijdens de vorming van de extracellulaire matrix.

Dergelijke kunstmatige hartkleppen worden geïntegreerd met het weefsel van de patiënt voor de uiteindelijke restauratie en het verdere behoud van hun structuur en functie. In dit geval wordt een nieuw collageen-elastine-netwerk, of preciezer gezegd een extracellulaire matrix, gevormd op de oorspronkelijke matrix als gevolg van de werking van cellen (fibroblasten, myofibroblasten, enz.). Optimale kunstmatige hartkleppen, gecreëerd door middel van tissue engineering, zouden daarom qua anatomische structuur en functie dicht bij de oorspronkelijke kleppen moeten liggen, en tevens biomechanisch aanpasbaar, herstelbaar en groeibevorderend moeten zijn.

Bij tissue engineering worden kunstmatige hartkleppen ontwikkeld met behulp van verschillende bronnen van celverzameling. Zo kunnen xenogene of allogene cellen worden gebruikt, hoewel de eerste gepaard gaan met een risico op overdracht van zoönosen op mensen. Het is mogelijk om de antigeniciteit te verminderen en afstotingsreacties van het lichaam te voorkomen door genetische modificatie van allogene cellen. Weefselengineering vereist een betrouwbare bron van cellen. Een dergelijke bron zijn autogene cellen die rechtstreeks van de patiënt worden afgenomen en die geen immuunreacties veroorzaken tijdens reïmplantatie. Effectieve kunstmatige hartkleppen worden geproduceerd op basis van autologe cellen die uit bloedvaten (slagaders en aders) worden verkregen. Er is een methode ontwikkeld die gebaseerd is op het gebruik van fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) om zuivere celculturen te verkrijgen. Een gemengde celpopulatie, verkregen uit een bloedvat, wordt gelabeld met een geacetyleerde marker van lagedichtheidslipoproteïne (LDL), die selectief wordt geabsorbeerd op het oppervlak van endotheliocyten. De endotheelcellen kunnen vervolgens eenvoudig worden gescheiden van de massa van de cellen die uit de bloedvaten worden verkregen, een mengsel van gladde spiercellen, myofibroblasten en fibroblasten. De bron van de cellen, slagader of ader, beïnvloedt de eigenschappen van de uiteindelijke constructie. Kunstmatige hartkleppen met een matrix bezaaid met veneuze cellen zijn dus superieur in collageenvorming en mechanische stabiliteit ten opzichte van constructies bezaaid met arteriële cellen. De keuze voor perifere aderen lijkt een geschiktere bron voor celverzameling.

Myofibroblasten kunnen ook uit halsslagaders worden gewonnen. Deze cellen, afkomstig van bloedvaten, hebben echter aanzienlijk andere eigenschappen dan natuurlijke interstitiële cellen. Autologe navelstrengcellen kunnen als alternatieve bron van cellen worden gebruikt.

Kunstmatige hartkleppen op basis van stamcellen

De afgelopen jaren is de vooruitgang in weefseltechnologie mogelijk gemaakt door stamcelonderzoek. Het gebruik van rode beenmergstamcellen heeft zo zijn voordelen. Met name de eenvoudige verzameling van biomateriaal en in-vitrokweek met daaropvolgende differentiatie tot verschillende soorten mesenchymcellen maakt het mogelijk om het gebruik van intacte vaten te vermijden. Stamcellen zijn pluripotente bronnen van cellijnen en hebben unieke immunologische eigenschappen die bijdragen aan hun stabiliteit onder allogene omstandigheden.

Menselijke rode beenmergstamcellen worden verkregen door middel van sternale punctie of punctie van de crista iliaca. Ze worden geïsoleerd uit 10-15 ml sternumaspiraat, gescheiden van andere cellen en gekweekt. Zodra het vereiste aantal cellen is bereikt (meestal binnen 21-28 dagen), worden ze uitgezaaid (gekoloniseerd) op matrices en gekweekt in een voedingsmedium in een statische positie (gedurende 7 dagen in een bevochtigde incubator bij 37 °C in aanwezigheid van 5% CO2). Vervolgens wordt de celgroei gestimuleerd via het cupturale medium (biologische stimuli) of door fysiologische omstandigheden voor weefselgroei te creëren tijdens de isometrische vervorming ervan in een reproductieapparaat met een pulserende stroming - een bioreactor (mechanische stimuli). Fibroblasten zijn gevoelig voor mechanische stimuli die hun groei en functionele activiteit bevorderen. De pulserende stroming veroorzaakt een toename van zowel radiale als circumferentiële vervormingen, wat leidt tot de oriëntatie (verlenging) van de cellen in de richting van dergelijke spanningen. Dit leidt op zijn beurt tot de vorming van georiënteerde vezelachtige structuren van de kleppen. Een constante stroming veroorzaakt slechts tangentiële spanningen op de wanden. De pulserende stroming heeft een gunstig effect op de cellulaire morfologie, proliferatie en de samenstelling van de extracellulaire matrix. De aard van de stroming in het voedingsmedium en de fysisch-chemische omstandigheden (pH, pO₂ en pCO₂) in de bioreactor hebben ook een significante invloed op de collageenproductie. Zo verhogen laminaire stroming en cyclische wervelstromen de collageenproductie, wat leidt tot verbeterde mechanische eigenschappen.

Een andere benadering voor het kweken van weefselstructuren is het creëren van embryonale omstandigheden in een bioreactor in plaats van het simuleren van fysiologische omstandigheden in het menselijk lichaam. Weefselbiokleppen gekweekt op basis van stamcellen hebben mobiele en flexibele flappen, die functioneel in staat zijn onder invloed van hoge druk en een stroming die het fysiologische niveau overschrijdt. Histologisch en histochemisch onderzoek van de flappen van deze structuren toonde de aanwezigheid aan van actieve processen van matrixbiologische vernietiging en de vervanging ervan door levensvatbaar weefsel. Het weefsel is georganiseerd volgens het gelaagde type met kenmerken van extracellulaire matrixeiwitten die vergelijkbaar zijn met die van natuurlijk weefsel, de aanwezigheid van collageentypes I en III en glycosaminoglycanen. De typische drielaagse structuur van de flappen - ventriculaire, sponsachtige en vezelachtige lagen - werd echter niet verkregen. ASMA-positieve cellen die vimentine tot expressie brachten, die in alle fragmenten werden aangetroffen, hadden kenmerken die vergelijkbaar waren met die van myofibroblasten. Met behulp van elektronenmicroscopie werden cellulaire elementen met kenmerken die kenmerkend zijn voor levensvatbare, secretoire actieve myofibroblasten (actine-/myosinefilamenten, collageendraden, elastine) en endotheelcellen op het weefseloppervlak aangetroffen.

Collageentypes I, III, ASMA en vimentine werden gedetecteerd op de klepbladen. De mechanische eigenschappen van de klepbladen van weefsel en natuurlijke structuren waren vergelijkbaar. Kunstmatige hartkleppen van weefsel vertoonden uitstekende prestaties gedurende 20 weken en leken op natuurlijke anatomische structuren in hun microstructuur, biochemische profiel en eiwitmatrixvorming.

Alle kunstmatige hartkleppen die door middel van tissue engineering zijn verkregen, zijn in dieren in de pulmonale positie geïmplanteerd, aangezien hun mechanische eigenschappen niet overeenkomen met de belastingen in de aortapositie. De weefselkleppen die uit dieren zijn geëxplanteerd, lijken qua structuur op natuurlijke kleppen, wat wijst op hun verdere ontwikkeling en herstructurering in vivo. Of het proces van weefselherstructurering en -rijping zich onder fysiologische omstandigheden zal voortzetten nadat de kunstmatige hartkleppen zijn geïmplanteerd, zoals is waargenomen in dierexperimenten, zal uit verder onderzoek blijken.

Ideale kunstmatige hartkleppen zouden een porositeit van ten minste 90% moeten hebben, aangezien dit essentieel is voor celgroei, de toevoer van voedingsstoffen en de afvoer van cellulaire metabole producten. Naast biocompatibiliteit en biologische afbreekbaarheid zouden kunstmatige hartkleppen een chemisch gunstig oppervlak moeten hebben voor celzaaiing en de mechanische eigenschappen van natuurlijk weefsel moeten evenaren. De mate van biologische afbraak van de matrix moet controleerbaar zijn en proportioneel aan de mate van nieuwe weefselvorming om mechanische stabiliteit in de loop van de tijd te garanderen.

Momenteel worden synthetische en biologische matrices ontwikkeld. De meest gebruikte biologische materialen voor het creëren van matrices zijn donoranatomische structuren, collageen en fibrine. Kunstmatige polymeerhartkleppen worden ontworpen om biologisch af te breken na implantatie, zodra de geïmplanteerde cellen hun eigen extracellulaire matrixnetwerk beginnen te produceren en te organiseren. De vorming van nieuw matrixweefsel kan worden gereguleerd of gestimuleerd door groeifactoren, cytokines of hormonen.

[ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ]

Donor kunstmatige hartkleppen

Kunstmatige hartkleppen van donoren, verkregen van mensen of dieren en ontdaan van cellulaire antigenen door decellularisatie om hun immunogeniciteit te verminderen, kunnen als matrices worden gebruikt. De geconserveerde eiwitten van de extracellulaire matrix vormen de basis voor de daaropvolgende adhesie van gezaaide cellen. De volgende methoden voor het verwijderen van cellulaire elementen (acellularisatie) bestaan: invriezen, behandeling met trypsine/EDTA, detergenten - natriumdodecylsulfaat, natriumdeoxycolaat, Triton X-100, MEGA 10, TnBR CHAPS, Tween 20, evenals meertraps enzymatische behandelingsmethoden. In dit geval worden celmembranen, nucleïnezuren, lipiden, cytoplasmatische structuren en oplosbare matrixmoleculen verwijderd met behoud van collageen en elastine. Een ideale methode is echter nog niet gevonden. Alleen natriumdodecylsulfaat (0,03-1%) of natriumdeoxycolaat (0,5-2%) resulteerde in volledige celverwijdering na 24 uur behandeling.

Histologisch onderzoek van verwijderde gedecellulariseerde biokleppen (allograft en xenograft) in een dierexperiment (hond en varken) toonde gedeeltelijke endothelialisatie en ingroei van ontvangende myofibroblasten in de basis, zonder tekenen van verkalking. Er werd matige ontstekingsinfiltratie opgemerkt. Tijdens klinische studies met de gedecellulariseerde SynerGraftTM-klep ontwikkelde zich echter al vroeg falen. Een uitgesproken ontstekingsreactie werd gedetecteerd in de matrix van de bioprothese, die aanvankelijk niet-specifiek was en gepaard ging met een lymfocytaire reactie. Disfunctie en degeneratie van de bioprothese ontwikkelden zich gedurende een jaar. Er werd geen celkolonisatie van de matrix opgemerkt, maar wel verkalking van de kleppen en pre-implantatie celresten.

Celvrije matrices, bezaaid met endotheelcellen en in vitro en in vivo gekweekt, vormden een coherente laag op het oppervlak van de kleppen, en bezaaide interstitiële cellen met de oorspronkelijke structuur toonden hun vermogen tot differentiëren. Het was echter niet mogelijk om het vereiste fysiologische niveau van celkolonisatie op de matrix te bereiken onder dynamische omstandigheden van de bioreactor, en de geïmplanteerde kunstmatige hartkleppen gingen gepaard met een vrij snelle (drie maanden) verdikking als gevolg van versnelde celproliferatie en de vorming van een extracellulaire matrix. Het gebruik van donorcelvrije matrices voor hun kolonisatie met cellen kent in dit stadium dan ook een aantal onopgeloste problemen, waaronder immunologische en infectieuze; het werk aan gedecellulariseerde bioprothesen gaat door.

Collageen is ook een van de potentiële biologische materialen voor de productie van biologisch afbreekbare matrices. Het kan worden gebruikt in de vorm van schuim, gel of platen, sponzen en als een vezelachtige blanco. Het gebruik van collageen gaat echter gepaard met een aantal technologische problemen. Het is met name moeilijk te verkrijgen bij een patiënt. Daarom zijn de meeste collageenmatrices momenteel van dierlijke oorsprong. Langzame biologische afbraak van dierlijk collageen kan een verhoogd risico op infectie met zoönosen en immunologische en ontstekingsreacties met zich meebrengen.

Fibrine is een ander biologisch materiaal met gecontroleerde biologische afbreekbaarheid. Omdat fibrinegels uit het bloed van de patiënt kunnen worden gemaakt voor de productie van een autologe matrix, zal implantatie van een dergelijke structuur geen toxische afbraak en ontstekingsreactie veroorzaken. Fibrine heeft echter nadelen zoals diffusie en uitloging in de omgeving en slechte mechanische eigenschappen.

[ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ], [ 11 ]

Kunstmatige hartkleppen van synthetische materialen

Kunstmatige hartkleppen worden ook van synthetische materialen gemaakt. Verschillende pogingen om klepmatrices te vervaardigen waren gebaseerd op het gebruik van polyglactine, polyglycolzuur (PGA), polymelkzuur (PLA), PGA- en PLA-copolymeer (PLGA) en polyhydroxyalkanoaten (PHA). Zeer poreus synthetisch materiaal kan worden verkregen uit gevlochten of niet-gevlochten vezels en met behulp van zoutuitloogtechnologie. Een veelbelovend composietmateriaal (PGA/P4HB) voor de vervaardiging van matrices wordt verkregen uit niet-gevlochten lussen van polyglycolzuur (PGA) gecoat met poly-4-hydroxybutyraat (P4HB). Kunstmatige hartkleppen vervaardigd uit dit materiaal worden gesteriliseerd met ethyleenoxide. De aanzienlijke initiële stijfheid en dikte van de lussen van deze polymeren, hun snelle en ongecontroleerde afbraak, gepaard gaande met de afgifte van zure cytotoxische producten, vereisen echter verder onderzoek en een zoektocht naar andere materialen.

Het gebruik van autologe myofibroblastweefselkweekplaten, gekweekt op een scaffold, om ondersteunende matrices te vormen door de productie van deze cellen te stimuleren, heeft het mogelijk gemaakt om klepmonsters te verkrijgen met actieve, levensvatbare cellen omgeven door een extracellulaire matrix. De mechanische eigenschappen van de weefsels van deze kleppen zijn echter nog onvoldoende voor implantatie.

Het vereiste niveau van proliferatie en weefselregeneratie van de te creëren klep kan mogelijk niet worden bereikt door cellen en matrix alleen te combineren. Celgenexpressie en weefselvorming kunnen worden gereguleerd of gestimuleerd door groeifactoren, cytokines of hormonen, mitogene factoren of adhesiefactoren toe te voegen aan matrices en scaffolds. De mogelijkheid om deze regulatoren in matrixbiomaterialen te introduceren, wordt bestudeerd. Over het algemeen is er een aanzienlijk gebrek aan onderzoek naar de regulatie van de weefselklepvorming door biochemische stimuli.

De acellulaire xenogene longbioprothese Matrix P van varkens bestaat uit gedecellulariseerd weefsel, verwerkt volgens een speciale gepatenteerde procedure van AutoTissue GmbH, inclusief behandeling met antibiotica, natriumdeoxycholaat en alcohol. Deze verwerkingsmethode, goedgekeurd door de International Organization for Standardization, elimineert alle levende cellen en postcellulaire structuren (fibroblasten, endotheelcellen, bacteriën, virussen, schimmels, mycoplasma), behoudt de architectuur van de extracellulaire matrix en minimaliseert het DNA- en RNA-gehalte in de weefsels, waardoor de kans op overdracht van het porcien endogeen retrovirus (PERV) op de mens tot nul wordt gereduceerd. De Matrix P-bioprothese bestaat uitsluitend uit collageen en elastine met een intacte structurele integratie.

In experimenten met schapen werd 11 maanden na implantatie van de Matrix P-bioprothese een minimale reactie van het omliggende weefsel waargenomen, met goede overlevingspercentages, wat vooral duidelijk was aan de glanzende binnenkant van het endocardium. Ontstekingsreacties, verdikking en verkorting van de klepbladen waren vrijwel afwezig. Lage calciumwaarden in het weefsel van de Matrix P-bioprothese werden eveneens waargenomen; het verschil was statistisch significant ten opzichte van die behandeld met glutaraldehyde.

De Matrix P kunstmatige hartklep past zich binnen enkele maanden na implantatie aan de individuele toestand van de patiënt aan. Het onderzoek aan het einde van de controleperiode toonde een intacte extracellulaire matrix en confluent endotheel. Het Matrix R xenotransplantaat, geïmplanteerd bij 50 patiënten met aangeboren afwijkingen tijdens de Ross-procedure tussen 2002 en 2004, toonde superieure prestaties en lagere transvalvulaire drukgradiënten in vergelijking met cryoconserveerde en gedecellulariseerde SynerGraftMT allotransplantaten en met glutaraldehyde behandelde scaffoldloze bioprothesen. De Matrix P kunstmatige hartkleppen zijn bedoeld voor pulmonalisklepvervanging tijdens reconstructie van de rechter ventrikel uitstroombaan bij operaties voor aangeboren en verworven afwijkingen en tijdens pulmonalisklepvervanging tijdens de Ross-procedure. Ze zijn verkrijgbaar in 4 maten (naar interne diameter): voor pasgeborenen (15-17 mm), voor kinderen (18-21 mm), intermediair (22-24 mm) en volwassenen (25-28 mm).

Voortgang in de ontwikkeling van weefselgemanipuleerde kleppen zal afhangen van ontwikkelingen in de celbiologie van kleppen (inclusief genexpressie en -regulatie), onderzoek naar embryogene en leeftijdsgebonden klepontwikkeling (inclusief angiogene en neurogene factoren), nauwkeurige kennis van de biomechanica van elke klep, identificatie van geschikte cellen voor zaaien en de ontwikkeling van optimale matrices. Verdere ontwikkeling van meer geavanceerde weefselkleppen vereist een grondig begrip van de relatie tussen de mechanische en structurele kenmerken van natuurlijke kleppen en de stimuli (biologisch en mechanisch) om deze kenmerken in vitro te reproduceren.

[ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ]