Laboratoriumdiagnose van tuberculose

Tuberculose is een ziekte die onder moderne omstandigheden en dankzij wetenschappelijke vooruitgang gemakkelijk te diagnosticeren is. Laboratoriumdiagnostiek van tuberculose neemt een centrale plaats in onder andere diagnostische methoden, na röntgenonderzoek.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ]

Klinische bloedtest

Bij patiënten met tuberculose zijn veranderingen in het algemene bloedonderzoek niet pathognomonisch. Bij beperkte en laagactieve vormen van tuberculose is hypochromie van erytrocyten met een normaal aantal kenmerkend. Bij massieve infiltraten of caseuze pneumonie, met wijdverspreide caseuze lymfadenitis, specifieke darmschade, evenals bij grote pulmonale of postoperatieve bloedingen, worden erytropenie en microcytose, oligochromasie en polychromasie opgemerkt. Macrocytose, en met name poikilocytose, komt veel minder vaak voor, meestal met ernstige bloedarmoede. Het aantal reticulocyten in het gecompenseerde stadium van tuberculose varieert van 0,1 tot 0,6%, in het subgecompenseerde stadium van 0,6 tot 1,0%, en voor het gedecompenseerde stadium is 1% reticulocyten kenmerkend.

In sommige gevallen van tuberculose kan matige leukocytose (tot 15 duizend leukocyten) worden waargenomen, minder vaak leukopenie, die voorkomt bij 2-7% van de gevallen bij patiënten met beperkte en milde vormen van het proces en bij 12,5% bij destructieve en progressieve longtuberculose.

Meestal treden er verschuivingen op in de leukocytenformule. Zowel relatieve als absolute neutrofilie wordt opgemerkt, een matige verschuiving in de leukocytenformule naar links ten opzichte van promyelocyten. Myelocyten worden zeer zelden aangetroffen bij ongecompliceerde tuberculose. Een toename van het aantal neutrofielen met pathologische granulariteit in het hemogram van een patiënt met tuberculose geeft altijd de duur van het proces aan: bij patiënten met ernstige tuberculose bevatten bijna alle neutrofielen pathologische granulariteit. Wanneer een tuberculose-uitbraak afneemt, normaliseert de nucleaire verschuiving relatief snel. De pathologische granulariteit van neutrofielen houdt meestal langer aan dan andere veranderingen in het hemogram.

Het gehalte aan eosinofielen in het perifere bloed fluctueert ook afhankelijk van de fase van het proces en de allergische toestand van het organisme. Hun aantal neemt af tot aneosinofilie bij ernstige en langdurige uitbraken van de ziekte en neemt juist toe tijdens de resorptie van infiltraten en pleurale effusie, evenals bij vroege vormen van primaire tuberculose.

De meeste vormen van primaire tuberculose gaan gepaard met lymfopenie, die soms jarenlang aanhoudt, zelfs na de littekenvorming van specifieke veranderingen. Secundaire tuberculose in de acute fase kan, afhankelijk van de ernst van het proces, gepaard gaan met een normaal aantal lymfocyten of lymfopenie.

Onder de tests ter beoordeling van het tuberculoseproces neemt het bepalen van de bezinkingssnelheid van rode bloedcellen (BSE) een bijzondere plaats in. Deze is belangrijk voor het beoordelen van het verloop van het tuberculoseproces en het identificeren van de actieve vormen ervan. Een verhoogde BSE wijst op de aanwezigheid van een pathologisch proces (infectieus en inflammatoir, purulent, septisch, hemoblastose, lymfogranulomatose, enz.) en dient als indicator voor de ernst ervan. Normale BSE-waarden duiden echter niet altijd op de afwezigheid van pathologie. Versnelling van de bezinking van rode bloedcellen wordt bevorderd door een toename van het gehalte aan globulinen, fibrinogeen en cholesterol in het bloed en een afname van de bloedviscositeit. Vertraging van de bezinking van rode bloedcellen is kenmerkend voor aandoeningen die gepaard gaan met hemoconcentratie, een toename van het gehalte aan albuminen en galzuren.

Het hemogram van tuberculosepatiënten verandert tijdens de behandeling. Hoe succesvoller de therapeutische interventie, hoe sneller de hematologische veranderingen verdwijnen. Tegelijkertijd moet rekening worden gehouden met het effect van verschillende antibacteriële geneesmiddelen op de hematopoëse. Ze veroorzaken vaak eosinofilie, in sommige gevallen leukocytose, en vaker leukopenie tot agranulocytose en lymfoïde-reticulaire reactie. Systematische hematologische monitoring en correcte analyse van de verkregen gegevens zijn essentieel voor het beoordelen van de klinische toestand van de patiënt, de dynamiek van het proces en de effectiviteit van de behandeling.

[ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ]

Klinische urineanalyse

Bij tuberculose van de urinewegen is urineonderzoek de belangrijkste laboratoriumdiagnostiek. Leukocyturie, erythrocyturie, proteïnurie, hypoisosthenurie, tuberculeuze mycobacteriurie en aspecifieke bacteriurie kunnen worden waargenomen.

Leukocyturie is het meest voorkomende symptoom van urinewegtuberculose vóór specifieke chemotherapie en is slechts in uitzonderlijke gevallen afwezig, zoals volledige obliteratie van het ureterlumen. De Nechiporenko-test (bepaling van het aantal leukocyten in 1 ml urine) helpt om de mate van leukocyturie bij nefrotuberculose objectiever te beoordelen en in sommige gevallen op te sporen met een normale algemene urineanalyse. Er moet echter rekening mee worden gehouden dat leukocyturie kan optreden bij acute en chronische pyelonefritis, cystitis, urethritis, nierstenen en urineleiders.

Erytrocyturie wordt, net als leukocyturie, beschouwd als een van de meest voorkomende laboratoriumsymptomen van urogenitale tuberculose. De frequentie van hematurie is afhankelijk van de prevalentie van het proces; de frequentie neemt toe naarmate het destructieve tuberculoseproces in de nier zich ontwikkelt. Erytrocyturie zonder leukocyturie is kenmerkender voor de vroege stadia van niertuberculose. Hematurie, die overheerst boven leukocyturie, is een belangrijk argument ten gunste van niertuberculose bij het onderscheid met aspecifieke pyelonefritis.

[ 10 ], [ 11 ], [ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ], [ 16 ]

Biochemische bloedtest

Bij tuberculose zijn veranderingen in sommige biochemische indices voornamelijk afhankelijk van de fase van het proces, complicaties en diverse bijkomende ziekten. Bij patiënten met inactieve tuberculose van de longen en andere organen zijn de totale eiwit- en eiwitfracties in het bloedserum niet veranderd en blijven hun normale waarden behouden.

Bij acute vormen van de ziekte en bij verergering en progressie van chronische vormen van tuberculose daalt de albumine-globulinecoëfficiënt.

Van groot belang bij het beoordelen van de functionele status en organische leverschade bij tuberculose en de complicaties ervan is de bepaling van direct en totaal bilirubine, aspartaataminotransferase (AST) en alanineaminotransferase (ALT) in het bloedserum. Dynamische bepaling van de aminotransferasespiegels. Bilirubine bij de behandeling van patiënten met tuberculose, met name in de ernstige vormen, is een verplicht onderdeel van het biochemische onderzoek bij patiënten met tuberculose en wordt maandelijks uitgevoerd.

De evaluatie van de functionele toestand van de nieren omvat de bepaling van serumcreatinine en de berekening van de glomerulaire filtratiesnelheid met behulp van de Cockcroft-Gault-formule. Berekening van de glomerulaire filtratiesnelheid met behulp van de Reberg-test geeft minder nauwkeurige resultaten.

Dynamische biochemische studies bij patiënten met tuberculose hebben als hoofddoel het bewaken van het verloop van het proces, het tijdig detecteren van bijwerkingen van medicijnen en het adequaat corrigeren van optredende homeostasestoornissen.

[ 17 ], [ 18 ], [ 19 ]

Toepassing van biochemische onderzoeksmethoden bij extrapulmonale tuberculose

De meest informatieve indicator is het gehalte aan tuberculosearinezuur in biologische vloeistoffen. De bepaling hiervan gaat echter gepaard met technische moeilijkheden (het gebruik van gaschromatografie en massaspectrometrie is noodzakelijk).

Het is veelbelovend om de activiteit van adenosinedeaminase te meten – een enzym dat wordt bepaald in vloeistoffen: synoviaal, pericardiaal, ascites of cerebrospinaal. De belangrijkste producenten van adenosinedeaminase zijn lymfocyten en monocyten. Bepaling van de activiteit van adenosinedeaminase in biologische vloeistoffen vergemakkelijkt de diagnose van tuberculeuze synovitis, lymfekliertuberculose, tuberculeuze meningitis en tuberculeuze serositis.

Sommige biochemische indicatoren worden, vanwege hun aspecificiteit, alleen bepaald in lichaamsvloeistoffen dicht bij de laesie. De indicatorwaarde wordt gemeten als reactie op subcutane of intradermale toediening van tuberculine (meestal vóór toediening en 48 en 72 uur erna). Hierna wordt de mate van stijging van de markerwaarde (in %) berekend ten opzichte van de initiële waarde.

In het optimale geval wordt de activiteit van het orgaanspecifieke enzym transamidinase in de urine bepaald; de aanwezigheid ervan wordt opgemerkt bij nierschade van verschillende oorsprong. Onderzoek naar transamidinase is alleen gerechtvaardigd bij subcutane toediening van tuberculine om het lokale ontstekingsproces te verergeren. De transamidinaseactiviteit wordt in de urine gemeten bij aanvang van en 24-72 uur na toediening van 50 TE tuberculine. Een toename van de fermenturie met een factor 2 of meer maakt het in 82% van de gevallen mogelijk om actieve niertuberculose te onderscheiden van exacerbatie van chronische pyelonefritis.

Bij tuberculose van de vrouwelijke geslachtsorganen worden de concentraties haptoglobine en malondialdehyde in het bloed bepaald onder de omstandigheden van de provocatieve tuberculinetest. Tuberculine wordt subcutaan toegediend in een dosis van 50 TE en na 72 uur wordt een herhaald biochemisch onderzoek uitgevoerd. Bij tuberculeuze etiologie is de mate van stijging van het haptoglobinegehalte ten minste 28% en het malondialdehydegehalte 39% of meer. Bepaling van de activiteit van adenosinedeaminase in de peritoneale vloeistof verkregen uit de pouch van Douglas wordt ook gebruikt. De punctie wordt 72 uur na de intradermale toediening van tuberculine in doses van 0,1 TE en 0,01 TE opnieuw onderzocht in het gebied waar de inwendige geslachtsorganen op de voorste buikwand projecteren. Een toename van de activiteit van adenosinedeaminase met 10% of meer ten opzichte van de beginwaarde duidt op een tuberculoseproces.

Bij oogletsel wordt de focale reactie in het oog als reactie op antigeenstimulatie onderzocht. In dit geval is het ontwikkelen van een sterk uitgesproken reactie gepaard gaande met een afname van de visuele functies ongewenst. Omdat de beoordeling van minimale focale reacties vaak moeilijk is, is het raadzaam om parallel te kijken naar de mate van toename van haptoglobine of adenosinedeaminase in het bloedserum om de conclusie te objectiveren.

Alle biochemische onderzoeken dienen in combinatie met andere methoden te worden uitgevoerd.

[ 20 ], [ 21 ], [ 22 ], [ 23 ]

Studie van het bloedstollingssysteem

Het belang van onderzoek naar de toestand van het bloedstollingssysteem in de phthisiologie is te danken aan de aanwezigheid van hemoptoë of longbloedingen bij een aantal patiënten met longtuberculose, evenals aan hemocoagulatiecomplicaties bij de chirurgische behandeling van tuberculose. Bovendien beïnvloedt de natuurlijk begeleidende latente intravasculaire hemocoagulatie het beloop van de ziekte en de effectiviteit van chemotherapie.

Bij patiënten met longtuberculose met een overheersende exsudatieve ontstekingscomponent wordt een afname van de anticoagulerende activiteit van het bloed waargenomen. Bij patiënten met een lage prevalentie van specifieke longschade met een overheersende productieve ontstekingscomponent, is intravasculaire hemocoagulatie insignificant. Bij patiënten met longtuberculose met hemoptoë en longbloedingen is de toestand van het bloedstollingssysteem anders: bij patiënten met gering bloedverlies ter hoogte van de hemoptoea of direct na het stoppen ervan, wordt een sterke toename van het stollingsvermogen van het bloed waargenomen als gevolg van een sterke intensivering van trombinevormingsprocessen, terwijl de verhoogde "structurele" stollingscapaciteit behouden blijft. Bij patiënten met massaal bloedverlies wordt een afname van het stollingspotentieel waargenomen als gevolg van een afname van de fibrinogeenconcentratie, factor XIII-activiteit en het aantal bloedplaatjes. Tijdens de chirurgische behandeling van patiënten met beperkte vormen van longtuberculose treden geen significante verstoringen in het homeostasesysteem op. Bij patiënten met wijdverspreide processen ontwikkelt zich bij een pneumonectomie of pleuropneumonectomie vaak het DIC-syndroom, dat de vorm kan aannemen van een "tweede ziekte".

Om de toestand van het bloedstollingssysteem bij patiënten met longtuberculose te bewaken, is het noodzakelijk om de geactiveerde partiële tromboplastinetijd (APTT), het fibrinogeen, de trombinetijd, de protrombine-index, evenals de bloedingstijd en de bloedstollingstijd te bepalen.

[ 24 ], [ 25 ], [ 26 ], [ 27 ], [ 28 ]

Hormonale studies

Moderne experimentele en klinische observaties wijzen op veranderingen in de hormonale status bij specifieke tuberculeuze longontstekingen. Het is bewezen dat correctie van disfunctie van de hypofyse-bijnier-, hypofyse-schildklier- en pancreasfunctie in combinatie met antituberculosetherapie bijdraagt aan de activering van fibrogenese en herstelprocessen in de focus van specifieke ontstekingen.

_{De functionele toestand van het hypofyse-schildklierstelsel wordt beoordeeld aan de hand van het gehalte aan trijodothyronine (T3), thyroxine (T4) en hypofysair schildklierstimulerend hormoon (TSH) in het bloedserum. Subklinische hypothyreoïdiewordt} vastgesteld bij 38-45% van de patiënten met longtuberculose en wordt het vaakst gediagnosticeerd bij gedissemineerde en fibreus-caverneuze vormen van het proces. Bij deze vormen zijn de niveaus van zowel T3 als T4 het sterkst verlaagd _, en treedt _een onevenwicht tussen deze hormonen op in de vorm van een stijging van de T4 _/ T3 _-ratio.

De functie van de bijnierschors wordt beoordeeld aan de hand van de serumcortisolspiegel en de endocriene functie van de pancreas aan de hand van de concentratie immunoreactieve insuline. In de acute fase van een infectieziekte neemt de behoefte aan endogeen cortisol en insuline toe. Hyperinsulinemie wijst ook op insulineresistentie van lichaamsweefsels, wat typisch is voor elk actief ontstekingsproces, in het bijzonder een specifiek proces. Bepaling van de glucocorticoïdefunctie van de bijnieren bij actieve longtuberculose stelt ons in staat om de aanwezigheid van hypercorticisme bij de meeste patiënten op te sporen. Normale bloedcortisolconcentraties bij een patiënt met infectieuze ontsteking in de acute periode moeten worden beschouwd als een relatieve insufficiëntie van de glucocorticoïdefunctie van de bijnierschors, wat kan dienen als basis voor substitutietherapie met adequate doses glucocorticoïden.

Bijna een derde van de patiënten met longtuberculose heeft een lage insulinespiegel die de ondergrens van de norm benadert, terwijl 13-20% significant hyperinsulinisme heeft. Zowel relatieve hypo- als hyperinsulinisme zijn risicofactoren voor het ontwikkelen van koolhydraatstofwisselingsstoornissen van verschillende ernst. Deze veranderingen in de functionele activiteit van pancreas-B-cellen vereisen regelmatige bloedglucosebewaking bij patiënten met tuberculose en tijdige preventie van diabetes mellitus. Dit vormt bovendien een extra onderbouwing voor de geschiktheid van het gebruik van fysiologische doses insuline bij de complexe behandeling van tuberculose.

Over het algemeen zijn de daling van de schildklierhormoonspiegels, de onbalans ervan, hypercortisolemie en hyperinsulinisme het meest uitgesproken bij patiënten met een ernstig beloop van het tuberculoseproces, met uitgebreide longletsels en uitgesproken symptomen van tuberculose-intoxicatie.

Microbiologische diagnostiek van tuberculose

Microbiologisch onderzoek is noodzakelijk voor de identificatie van patiënten met tuberculose, het verifiëren van de diagnose, het monitoren en bijsturen van chemotherapie en het beoordelen van behandelresultaten. Kortom, vanaf het moment dat een patiënt met tuberculose wordt geregistreerd totdat hij of zij uit het register wordt verwijderd.

Alle epidemiologische programma's en projecten zijn gebaseerd op de beoordeling van het aantal bacterie-uitscheiders, wat onmogelijk is zonder het gebruik van laboratoriummethoden voor het detecteren van tuberculosemycobacteriën. Wanneer we kijken naar de aantrekkingskracht van de zogenaamde ongeorganiseerde bevolking, loopt het percentage bacterie-uitscheiders op tot 70 of meer, wat laboratoriummethoden een redelijk effectief middel maakt om tuberculosepatiënten binnen deze bevolkingsgroep te identificeren.

Traditionele microbiologische methoden voor de diagnose van tuberculose zijn bacterioscopisch en cultureel onderzoek. Moderne methoden omvatten het kweken van tuberculosemycobacteriën in geautomatiseerde systemen en PCR. Al deze methoden worden echter noodzakelijkerwijs gecombineerd met klassieke bacteriologische methoden.

Verzameling van diagnostisch materiaal

De effectiviteit van laboratoriumtests hangt grotendeels af van de kwaliteit van het diagnostische materiaal. Naleving van de regels voor het verzamelen, bewaren en transporteren van diagnostisch materiaal en de nauwkeurige implementatie van het algoritme voor patiëntenonderzoek hebben direct invloed op het resultaat en waarborgen de biologische veiligheid.

Er worden diverse materialen gebruikt om op tuberculose te testen. Omdat longtuberculose de meest voorkomende vorm van tuberculose-infectie is, wordt het belangrijkste testmateriaal beschouwd als sputum en andere soorten tracheobronchiale afscheiding: afscheiding uit de bovenste luchtwegen verkregen na aerosolinhalatie: bronchiale lavagewater; bronchoalveolaire lavages; materiaal verkregen tijdens bronchoscopie, transtracheale en intrapulmonale biopsie: bronchiaal aspiraat, laryngeale uitstrijkjes, exsudaten, wonduitstrijkjes, enz.

De effectiviteit van onderzoek neemt toe als er gecontroleerd materiaal van de patiënt wordt verzameld. Hiervoor wordt een speciaal ingerichte ruimte toegewezen of worden speciale cabines aangeschaft. Het verzamelen van materiaal is een gevaarlijke procedure en daarom moet materiaal voor onderzoek worden verzameld met inachtneming van de infectieveiligheidsregels.

Het materiaal dat wordt gebruikt voor de test op Mycobacterium tuberculosis wordt verzameld in steriele flesjes met goed gesloten doppen om besmetting van de omgeving te voorkomen en het verzamelde materiaal tegen besmetting te beschermen.

Flesjes voor het verzamelen van diagnostisch materiaal moeten aan de volgende eisen voldoen:

• moet van slagvast materiaal zijn gemaakt;
• moet gemakkelijk smelten bij verhitting in een autoclaaf;
• voldoende volume hebben (40-50 ml):
• een brede opening hebben voor het verzamelen van sputum (diameter niet minder dan 30 mm);
• gemakkelijk hanteerbaar, transparant of doorschijnend zijn, zodat de hoeveelheid en kwaliteit van het verzamelde monster beoordeeld kunnen worden zonder het deksel te openen.

Om optimale onderzoeksresultaten te verkrijgen, moeten de volgende voorwaarden worden vervuld:

• het verzamelen van materiaal moet plaatsvinden vóór het begin van de chemotherapie;
• het materiaal voor het onderzoek moet vóór het eten of innemen van medicijnen in de ochtend worden verzameld;
• Voor het onderzoek is het raadzaam om minimaal 3 ochtendsputummonsters te verzamelen. Het sputum wordt gedurende 3 opeenvolgende dagen verzameld;
• Het verzamelde materiaal moet zo snel mogelijk naar het laboratorium worden gebracht:
• in gevallen waarin het niet mogelijk is het materiaal onmiddellijk naar het laboratorium te brengen, wordt het gedurende maximaal 48 uur in een koelkast bij een luchttemperatuur van 4 °C bewaard;
• Bij het transport van het materiaal moet speciale aandacht worden besteed aan de integriteit van de flessen.

Correct verzameld sputum heeft een slijmerig of mucopurulent karakter. Het optimale volume van het onderzochte sputum is 3-5 ml.

Het verzamelen van sputum gebeurt onder toezicht van een zorgverlener. Personen die verantwoordelijk zijn voor het verzamelen van sputum, moeten ervoor zorgen dat bepaalde regels worden nageleefd:

• Het is noodzakelijk om de patiënt het doel van het onderzoek uit te leggen en te benadrukken dat hij niet speeksel of neus-keelholteslijm moet ophoesten, maar de inhoud van de diepe luchtwegen. Dit kan worden bereikt door een productieve hoest die optreedt na een paar (2-3) diepe ademhalingen. Het is ook noodzakelijk om de patiënt te waarschuwen dat hij eerst zijn mond moet spoelen met gekookt water om het grootste deel van de microflora in de mondholte en voedselresten te verwijderen die het onderzoek van sputum bemoeilijken;
• De medische hulpverlener die betrokken is bij het verzamelen van sputum moet, naast een jas en muts, een masker, rubberen handschoenen en een rubberen schort dragen;
• staand achter de patiënt, wordt hem geadviseerd de fles zo dicht mogelijk bij zijn lippen te houden en het sputum dat hij ophoest onmiddellijk daarin op te vangen. Hierbij is het belangrijk ervoor te zorgen dat de luchtstroom van de gezondheidswerker af is gericht:
• Zodra het sputum is verzameld, sluit de zorgverlener de fles zorgvuldig af met de dop en beoordeelt de hoeveelheid en kwaliteit van het verzamelde sputum. De fles wordt vervolgens geëtiketteerd en in een speciale doos geplaatst voor transport naar het laboratorium.

Als de patiënt geen sputum produceert, moet hij de avond ervoor en vroeg in de ochtend van de dag van de sputumafname een slijmoplossend middel toegediend krijgen: extract van heemstwortel (mucaltine), broomhexine, ambroxol, enz. - of een irriterende inhalatie, met behulp van de apparatuur die in de sputumafnamekamer is geïnstalleerd. Het op deze manier verzamelde materiaal is niet onderhevig aan conservering en moet op de dag van afname worden onderzocht. Om te voorkomen dat het in het laboratorium wordt "afgekeurd", moet een speciale aantekening in de verwijzing worden gemaakt.

Indien microbiologische studies niet in een bepaalde instelling worden uitgevoerd, moet het verzamelde diagnostische materiaal centraal aan het laboratorium worden geleverd, mits het tussen leveringen in de koelkast of met conserveermiddelen wordt bewaard. Het materiaal wordt in gemakkelijk te desinfecteren transportdozen naar het laboratorium geleverd. Elk monster moet voorzien zijn van een passend etiket en de gehele partij moet een ingevuld bijsluiter hebben.

[ 29 ], [ 30 ], [ 31 ]

Wijzen en frequentie van onderzoek van patiënten

Bij het eerste, zogenoemde diagnostische, onderzoek van een patiënt op tuberculose is het noodzakelijk om onder toezicht van medisch personeel gedurende 2 of 3 dagen minstens 3 porties sputum te onderzoeken, wat de effectiviteit van de microscopie verhoogt.

Primaire screening op tuberculose zou door alle medische en diagnostische instellingen binnen de gezondheidszorg moeten worden uitgevoerd. Om de effectiviteit van primair onderzoek te vergroten, zijn onlangs zogenaamde microscopiecentra opgericht, gebaseerd op klinische diagnostische laboratoria, uitgerust met moderne microscopen en apparatuur om epidemische veiligheid te garanderen.

Tuberculosebestrijdingsinstellingen hanteren een onderzoeksschema dat voorziet in ten minste driemaal daags onderzoek van sputum of ander diagnostisch materiaal binnen drie dagen. Tijdens de behandeling worden microbiologische onderzoeken regelmatig uitgevoerd, ten minste eenmaal per maand, in de intensieve chemotherapiefase. Bij de overgang naar de follow-upfase worden de onderzoeken minder frequent uitgevoerd - met tussenpozen van 2-3 maanden - en wordt de frequentie teruggebracht tot twee.

Kenmerken van het verzamelen van diagnostisch materiaal voor extrapulmonale tuberculose

Pathologisch materiaal bij extrapulmonale vormen van tuberculose wordt gekenmerkt door de lage concentratie van mycobacteria tuberculosis. Hierdoor zijn gevoeligere methoden van microbiologisch onderzoek nodig, met name methoden van zaaien op een voedingsbodem.

Bij urogenitale tuberculose is urine het meest toegankelijke materiaal voor onderzoek. Urineafname dient te worden uitgevoerd door een speciaal opgeleide verpleegkundige.

De uitwendige genitaliën worden gewassen met water en zeep of een zwakke oplossing van kaliumpermanganaat. De uitwendige opening van de urethra wordt zorgvuldig behandeld. Het middelste deel van de ochtendurine wordt opgevangen in een steriel flesje: bij mannen – uiteraard bij vrouwen – via een katheter. Urine uit het nierbekken wordt opgevangen in steriele reageerbuisjes tijdens de katheterisatie van één of twee nieren, in het laatste geval noodzakelijkerwijs afzonderlijk van elke nier. Een kleine hoeveelheid van deze urine wordt gecentrifugeerd en het bezinksel wordt onderzocht.

Bij mannen worden sperma, teelbalpuncties en prostaatvocht gecentrifugeerd om sediment te verkrijgen. Bij elke lokalisatie van een specifiek proces in de genitale zone bij mannen kan prostaatmassage de afgifte van afscheidingen bevorderen die tuberculosemycobacteriën bevatten.

Menstruatiebloed wordt bij vrouwen afgenomen door middel van afzuiging of met behulp van een Kafka-kapje. Het resulterende materiaal wordt van de rode bloedcellen ontdaan door het te wassen met gedestilleerd water en vervolgens te centrifugeren. Het bezinksel wordt onderzocht.

De afscheiding uit het baarmoederhalskanaal wordt verzameld in een soort container of Kafka-kap, dat wil zeggen dat het wenselijk is om 1-2 ml pathologisch materiaal te verzamelen.

Materiaal verkregen tijdens chirurgische ingrepen aan de nieren, genitaliën, biopsieën en baarmoederslijmvliezen wordt gehomogeniseerd. Hiervoor wordt het in een steriele vijzel geplaatst en grondig vermalen met een steriele schaar. Aan de resulterende suspensie wordt steriel rivierzand toegevoegd in een hoeveelheid gelijk aan de massa, vervolgens wordt 0,5-1,0 ml isotone natriumchloride-oplossing toegevoegd en wordt het geheel vermalen tot een papperige massa met toevoeging van isotone natriumchloride-oplossing (4-5 ml). Vervolgens laat men de massa 1-1,5 minuut bezinken en wordt de bovenstaande vloeistof onderzocht.

Tuberculose van botten en gewrichten. De punctie (pus uit abcessen) verkregen met een steriele spuit wordt in een steriele container geplaatst en onmiddellijk naar het laboratorium gebracht. Met een steriele pipet, vooraf bevochtigd met steriele isotone natriumchloride-oplossing, wordt 2-5 ml pus afgenomen, overgebracht in een fles met kralen en nog eens 2-3 ml isotone natriumchloride-oplossing toegevoegd. De fles wordt afgesloten met een stop en 8-10 minuten geschud in een schudapparaat. De gehomogeniseerde suspensie wordt onderzocht.

Bij fistelachtige vormen van osteoarticulaire tuberculose wordt pus uit de fistel gehaald. Overvloedige afscheiding wordt direct in een reageerbuis opgevangen. Bij geringe pusafscheiding wordt het fistelkanaal gespoeld met een steriele isotone natriumchlorideoplossing en wordt het spoelwater, opgevangen in een reageerbuis of een met pus gedrenkt stukje tampon, opgestuurd voor onderzoek.

Chirurgisch materiaal verkregen tijdens chirurgische ingrepen aan botten en gewrichten kan bestaan uit purulent-necrotische massa's, granulaties, littekenweefsel, botweefsel, synoviaal membraanweefsel en andere substraten. De verwerking ervan verloopt zoals bij niertuberculose.

Direct na de punctie wordt microbiologisch onderzoek gedaan van de synoviale vloeistof in een 3% natriumcitraatoplossing (in een verhouding van 1:1) om stolling te voorkomen.

Lymfekliertuberculose. Pus die tijdens punctie van de lymfeklieren wordt verwijderd, wordt op dezelfde manier onderzocht als pus uit abcessen. Lymfeklierweefsel dat tijdens chirurgische ingrepen en biopsieën wordt verkregen, wordt net als bij andere vormen van tuberculose onderzocht.

Onderzoek naar Mycobacterium tuberculosis in ontlasting wordt zeer zelden uitgevoerd, omdat er vrijwel geen positieve resultaten zijn.

[ 32 ], [ 33 ], [ 34 ], [ 35 ], [ 36 ]

Microscopie van mycobacteriën

Sputummicroscopie is een relatief snelle, eenvoudige en goedkope methode die bij verdenking op tuberculose gebruikt zou moeten worden. Daarnaast wordt dit onderzoek uitgevoerd om de effectiviteit van chemotherapie te beoordelen en herstel of falen van de behandeling te bevestigen bij afwezigheid van kweekresultaten.

Er worden twee methoden van microscopisch onderzoek gebruikt:

• directe microscopiemethode, waarbij een uitstrijkje rechtstreeks van het diagnostische materiaal wordt bereid;
• een microscopische methode van sediment dat is bereid uit materiaal dat is behandeld met ontsmettingsmiddelen, voor cultureel onderzoek.

De eerste methode wordt gebruikt in die laboratoria waar uitsluitend microscopisch onderzoek wordt uitgevoerd (klinische diagnostische laboratoria van het algemene medische netwerk).

De beste resultaten van microscopisch onderzoek worden verkregen door concentratie van het diagnostische materiaal (bijvoorbeeld door centrifugatie).

Om Mycobacterium tuberculosis met een waarschijnlijkheid van 50% microscopisch te kunnen detecteren, moet 1 ml sputum meer dan 5000 microbiële cellen bevatten. Sputum van patiënten met pulmonale vormen van tuberculose bevat doorgaans een aanzienlijk aantal zuurvaste bacteriën, waardoor deze betrouwbaar met bacterioscopie kunnen worden gedetecteerd. De diagnostische gevoeligheid van deze methode kan worden verhoogd door meerdere sputummonsters van één patiënt te onderzoeken. Een negatieve uitslag van bacterioscopisch onderzoek sluit de diagnose tuberculose niet uit, omdat het sputum van sommige patiënten minder Mycobacterium bevat dan microscopisch kan worden gedetecteerd. Een slechte voorbereiding van sputumuitstrijkjes kan ook de oorzaak zijn van een negatieve uitslag van bacterioscopisch onderzoek.

De meest gebruikte methode voor het detecteren van zuurvaste mycobacteriën in een uitstrijkje is de Ziehl-Neelsen-kleuring. Deze methode is gebaseerd op de penetratie van carbolfuchsine in een microbiële cel door een membraan met een was-lipidelaag, onder gelijktijdige verhitting en de sterke etsende werking van fenol. Vervolgens wordt het uitstrijkje ontkleurd met een 25%-oplossing van zwavelzuur of 3% zoutzuuralcohol, wat leidt tot de ontkleuring van alle niet-zuurvaste structuren. De ontkleurde elementen van het uitstrijkje worden gekleurd met een 0,3%-oplossing van methyleenblauw. Mycobacteriën nemen geen conventionele anilinekleurstoffen waar, waardoor zuurvaste mycobacteriën frambozenrood kleuren en andere microben en celelementen blauw.

Om uitstrijkjes te onderzoeken die volgens Ziehl-Neelsen zijn gekleurd, gebruikt u een binoculaire lichtmicroscoop met immersieobjectief (90- of 100-voudige vergroting) en een oculair met 7- of 10-voudige vergroting. Er worden 100 gezichtsvelden onderzocht, wat voldoende is om enkele mycobacteriën in het uitstrijkje te detecteren. Indien de uitslag van dit onderzoek negatief is, is het raadzaam om ter bevestiging nog eens 200 gezichtsvelden te onderzoeken. De resultaten worden geregistreerd en geven het aantal gedetecteerde zuurvaste mycobacteriën (AFB) aan.

Naast deze methode wordt fluorochroomkleuring gebruikt voor luminescentiemicroscopie, wat de beste resultaten oplevert. Deze methode verhoogt de efficiëntie van de microscopie met 10-15%. Wanneer mycobacteriën worden behandeld met luminescerende kleurstoffen (auramine, rhodamine, enz.), binden deze stoffen zich ook aan de wasachtige structuren van de microbiële cel. Wanneer gekleurde cellen worden bestraald met een exciterende lichtbron (een bepaald spectrum ultraviolette straling), beginnen ze oranje of felrood op te lichten tegen een zwarte of donkergroene achtergrond. Door de hoge helderheid en het contrast van het zichtbare beeld kan de algehele vergroting van de microscoop met een factor 4-10 worden verminderd, wat het gezichtsveld vergroot en de kijktijd van het preparaat verkort. Daarnaast kan, dankzij de aanzienlijk grotere scherptediepte, het comfort van de studie worden verhoogd.

Bij fluorescentiemicroscopie kost het bekijken van hetzelfde gebied van een uitstrijkje aanzienlijk minder tijd dan lichtmicroscopie van uitstrijkjes die volgens Ziehl-Neelsen gekleurd zijn. Als een microscopist ongeveer 20-25 van dergelijke uitstrijkjes per werkdag bekijkt, kan hij met behulp van fluorescentiemicroscopie meer dan 60-80 monsters in dezelfde tijd onderzoeken. Ervaren microscopisten weten dat het kleuren van cellen met een mengsel van auramine en rhodamine op de een of andere manier specifiek is voor zuurvaste mycobacteriën, die in dit geval het uiterlijk hebben van gouden staafjes. Saprofyten kleuren groenachtig.

Een ander belangrijk voordeel van de fluorescentiemicroscopiemethode is de mogelijkheid om veranderde mycobacteriën te detecteren die onder invloed van een aantal ongunstige factoren, met name intensieve chemotherapie, hun zuurbestendige eigenschappen hebben verloren en daarom niet kunnen worden gedetecteerd door de Ziehl-Neelsen-kleuring.

Nadelen van de fluorescentiemicroscopiemethode zijn onder meer de relatief hoge kosten van de microscoop en de bediening ervan. In gecentraliseerde of andere grote laboratoria, waar de werklast de norm van drie laboranten die met drie conventionele microscopen werken, overschrijdt, is het echter goedkoper om één fluorescentiemicroscoop te gebruiken.

Bacterioscopische methoden hebben een vrij hoge specificiteit (89-100%). Ongeveer 97% van de positieve resultaten die met welke microscopiemethode dan ook worden verkregen, worden duidelijk bevestigd door de resultaten van het zaaien.

Opgemerkt moet worden dat microscopisch onderzoek van een uitstrijkje van pathologisch materiaal niet toelaat de soort van de gedetecteerde zuurresistente mycobacteriën te bepalen. De microscopische methode laat alleen een conclusie toe over de aanwezigheid of afwezigheid van zuurresistente micro-organismen in het preparaat, wat verklaard wordt door het bestaan in de natuur van een groot aantal niet-tuberculeuze zuurresistente micro-organismen die morfologisch vergelijkbaar zijn met mycobacteriën van het tuberculosecomplex.

De evaluatie van microscopieresultaten wordt uitgevoerd in semi-kwantitatieve eenheden.

Om de resultaten van verschillende microscopiemethoden te kunnen vergelijken, worden empirische coëfficiënten geïntroduceerd. Om bijvoorbeeld de resultaten van een met fluorescerende kleurstoffen gekleurd uitstrijkje te vergelijken met de gegevens van een lichtmicroscopieonderzoek (1000-voudige vergroting), moet het aantal zuurvaste mycobacteriën dat met een fluorescentiemicroscoop is gedetecteerd, worden gedeeld door de bijbehorende coëfficiënt: bij een 250-voudige vergroting van de microscoop door 10, bij een 450-voudige vergroting door 4 en bij een 630-voudige vergroting door 2.

Kenmerken van microscopie bij extrapulmonale tuberculose

Directe microscopie wordt toegepast, evenals microscopie van uitstrijkjes die zijn vervaardigd na verrijking met daaropvolgende kleuring volgens Ziehl-Neelsen of fluorescerende kleurstoffen. Directe microscopie van uitstrijkjes is ineffectief vanwege de lage concentratie mycobacteriën in het materiaal, en daarom is het rationeler om verrijkingsmethoden te gebruiken. Centrifugatie is het meest effectief. Als het biologische materiaal viskeus is, wordt centrifugatie met gelijktijdige homogenisatie en liquefactie van het materiaal gebruikt, wat wordt uitgevoerd met hogesnelheidscentrifuges met een centrifugatiekracht van 3000 g en hypochlorietoplossingen. Andere verrijkingsmethoden, zoals microflotatie, worden momenteel niet gebruikt vanwege de vorming van biologisch gevaarlijke aerosolen.

[ 37 ]

Kweekmethode voor het diagnosticeren van tuberculose

De seeding-methode, of kweekmethode, is gevoeliger dan uitstrijkmicroscopie en heeft een aantal voordelen ten opzichte van laatstgenoemde. Het maakt het mogelijk om enkele tientallen levensvatbare mycobacteriën in het te onderzoeken materiaal te detecteren en heeft een hoge diagnostische waarde. Dit is vooral belangrijk bij onderzoek van materiaal van recent gediagnosticeerde of behandelde patiënten die een klein aantal mycobacteriën uitscheiden.

Vergeleken met microscopie maakt kweekonderzoek het mogelijk om het aantal gedetecteerde tuberculosepatiënten met meer dan 15-25% te verhogen en tuberculose in een vroeger stadium te verifiëren, wanneer de ziekte nog gemakkelijk te behandelen is. Een zeer belangrijk voordeel van kweekonderzoek is de mogelijkheid om een pathogene kweek te verkrijgen, die kan worden geïdentificeerd en bestudeerd met betrekking tot geneesmiddelgevoeligheid, virulentie en andere biologische eigenschappen.

Nadelen van de kweekmethoden zijn onder meer de duur (de wachttijd voor materiaal bedraagt 10 weken), de hogere kosten en de complexiteit van de verwerking van diagnostisch materiaal.

Principes van de voorbehandeling van diagnostisch materiaal vóór het zaaien

Conventionele microbiologische methoden kunnen niet worden gebruikt voor tuberculosetests. Dit komt doordat tuberculosemycobacteriën zeer langzaam groeien en de meeste klinische monsters snelgroeiende pyogene en rottende micro-organismen en schimmels bevatten. Hun snelle groei op rijke voedingsbodems verstoort de ontwikkeling van mycobacteriën en maakt het onmogelijk om de tuberculosepathogeen te isoleren. Daarom moet het diagnostische materiaal vóór het zaaien worden voorbehandeld. Bovendien worden mycobacteriën die uit de luchtwegen van de patiënt vrijkomen meestal omgeven door een grote hoeveelheid slijm, waardoor ze moeilijk te concentreren zijn. Daarom moeten sputum en ander soortgelijk materiaal vóór het zaaien vloeibaar worden gemaakt en gedecontamineerd.

Alle detergenten en decontaminanten hebben een min of meer uitgesproken toxisch effect op mycobacteriën. Als gevolg van de behandeling kan tot 90% van de mycobacteriën afsterven. Om een voldoende groot deel van de mycobacteriële populatie te behouden, is het noodzakelijk om milde behandelingsmethoden te gebruiken die enerzijds snelgroeiende pyogene en rottende micro-organismen onderdrukken en anderzijds de levensvatbaarheid van de in het materiaal aanwezige mycobacteriën maximaal behouden.

Afhankelijk van het materiaal, de homogeniteit en de mate van besmetting worden verschillende decontaminanten gebruikt voor de pre-seedingbehandeling: voor sputum - 4% natriumhydroxide-oplossing, 10% trinatriumfosfaatoplossingen, benzalkoniumchloride-trinatriumfosfaat, NALC-NaOH (N-acetyl-L-cysteïne-natriumhydroxide) met een uiteindelijke NaOH-concentratie van 1%, voor urine en andere vloeibare materialen - 3% zwavelzuuroplossing, voor besmette monsters, vetbevattende materialen - oxaalzuuroplossing tot 5%. Daarnaast worden in sommige gevallen enzymen en oppervlakteactieve stoffen (detergenten) gebruikt. Het gebruik van Tween en sommige andere detergenten gaat gepaard met een lagere dood van mycobacteriële cellen (40-50% overleeft). Ze kunnen echter alleen worden gebruikt voor vloeibare materialen. NALC-NaOH, geproduceerd in kits, is de meest gebruikte ter wereld. Deze methode maakt het mogelijk om meer dan 85% van de mycobacteriële celpopulatie te isoleren. Decontaminatie van weefselbevattende vaste stoffen is moeilijker, omdat de mate van dispersie van het materiaal tijdens homogenisatie moeilijk te schatten is. Zo gaat de verwerking van lymfeklierbiopten vaak gepaard met een verhoogde frequentie van besmetting met vreemde flora. In dit geval kan 1% etonium worden gebruikt.

Niet-homogeen materiaal wordt gehomogeniseerd met behulp van glasparels in aanwezigheid van decontaminanten. Vloeibare materialen worden voorgecentrifugeerd en alleen het sediment wordt verwerkt.

Techniek van zaaien en broeden

Na de voorbewerking wordt het materiaal gecentrifugeerd, waardoor de mycobacteriën neerslaan en hun gehalte in het sediment toeneemt ("sedimentverrijking"). Het resulterende sediment wordt geneutraliseerd en geënt op het oppervlak van dichte voedingsmedia of in reageerbuisjes met vloeibare (halfvloeibare) media. Van het resterende sediment worden uitstrijkjes voor microscopisch onderzoek gemaakt. De enttechniek moet kruisbesmetting van het diagnostische materiaal voorkomen.

Voor een betrouwbare klinische interpretatie van de resultaten van microbiologisch onderzoek moet de volgende regel in acht worden genomen: microscopisch en cultureel onderzoek moeten parallel worden uitgevoerd op hetzelfde monster diagnostisch materiaal.

De geënte buisjes worden twee dagen horizontaal in een thermostaat geplaatst bij 37 ^° C. Dit zorgt voor een gelijkmatigere opname van het materiaal in het voedingsmedium. Na twee dagen worden de buisjes verticaal geplaatst en hermetisch afgesloten met rubberen of siliconen doppen om uitdroging van het geënte medium te voorkomen.

De gewassen worden 10-12 weken in een thermostaat bij 37 ^° C bewaard, met regelmatige wekelijkse inspectie. Bij elke controle worden de volgende parameters geregistreerd:

• periode van visueel waarneembare groei vanaf de dag van zaaien;
• groeisnelheid (aantal CFU);
• besmetting van de cultuur met vreemde microbiële flora of schimmels (dergelijke reageerbuisjes worden verwijderd);
• Geen zichtbare groei. De buizen blijven in de thermostaat zitten tot de volgende inspectie.

Voedingsmedia

Er worden verschillende voedingsmedia gebruikt voor het kweken van mycobacteriën: vast, halfvloeibaar en vloeibaar. Geen van de bekende voedingsmedia heeft echter eigenschappen die de groei van alle mycobacteriële cellen garanderen. Om de efficiëntie te verbeteren, is het daarom aan te raden om 2-3 voedingsmedia met verschillende samenstellingen tegelijk te gebruiken.

Als standaardmedium voor de primaire isolatie van de tuberculoseverwekker en het bepalen van de gevoeligheid voor het geneesmiddel, beveelt de WHO het Lowenstein-Jensen-medium aan. Dit is een dicht eimedium waarop mycobacteriën op de 20e tot 25e dag na het zaaien van bacterioscopisch positief materiaal groeien. Het zaaien van bacterioscopisch negatief materiaal vereist een langere incubatietijd (tot 10-12 weken).

In ons land is het Finn-II-eiermedium, voorgesteld door ER Finn, wijdverbreid. Het onderscheidt zich doordat het in plaats van L-asparagine natriumglutamaat gebruikt, dat andere routes activeert voor de synthese van aminozuren in mycobacteriën. De groei op dit medium begint iets eerder en de frequentie van mycobacteriële isolatie is 6-8% hoger dan op het Löwenstein-Jensen-medium.

Om de efficiëntie van de bacteriologische diagnostiek van extrapulmonale tuberculose te verhogen, is het raadzaam om gemodificeerd Finn-II-medium in het voedingsmediumcomplex op te nemen. Om de groei te versnellen, wordt 0,05% natriumthioglycolaat aan het Finn-II-voedingsmedium toegevoegd, wat de zuurstofconcentratie verlaagt. Om de enzymsystemen van mycobacteriën te beschermen tegen toxische lipideperoxidatieproducten, wordt de antioxidant α-tocoferolacetaat in het Finn-II-voedingsmedium toegevoegd in een concentratie van 0,001 μg/ml. Het diagnostische materiaal wordt geënt met behulp van de standaardmethode.

In laboratoria voor tuberculosebestrijding in Rusland worden ook andere modificaties van dichte voedingsmedia gebruikt: het voedingsmedium "Novaya" voorgesteld door GG Mordovsky, de voedingsmedia A-6 en A-9 ontwikkeld door VA Anikin, enz.

Doordat er tijdens de chemotherapie schade ontstaat aan diverse metabolische systemen van de microbiële cel, verliest een deel van de mycobacteriële populatie het vermogen om zich normaal te ontwikkelen op conventionele voedingsmedia en heeft behoefte aan osmotisch gebalanceerde (halfvloeibare of vloeibare) voedingsmedia.

Evaluatie en registratie van de resultaten van diagnostische materiaalkweek

Sommige stammen en soorten mycobacteriën groeien langzaam; groei kan zelfs al na 90 dagen zichtbaar zijn. Het aantal van dergelijke culturen is klein, maar dit dwingt de zaailingen om 2,5 tot 3 maanden in een thermostaat te worden bewaard.

Virulente culturen van Mycobacterium tuberculosis groeien gewoonlijk op vaste eiermedia als R-vormige kolonies van verschillende grootte en uiterlijk. De kolonies zijn droog, gerimpeld, ivoorkleurig en licht gepigmenteerd. Op andere media kunnen Mycobacterium tuberculosis-kolonies vochtiger zijn. Na een chemotherapiekuur of tijdens de behandeling kunnen gladde kolonies met vochtige groei (S-vormen) worden geïsoleerd.

Bij het isoleren van culturen wordt een reeks speciale onderzoeken gebruikt om tuberculosemycobacteriën te onderscheiden van niet-tuberculeuze mycobacteriën en zuurbestendige saprofyten.

Een positief antwoord wordt gegeven na een verplicht microscopisch onderzoek van een uitstrijkje van de gekweekte kolonies, gekleurd volgens Ziehl-Neelsen. Bij mycobacteriële groei worden felrode staafjes aangetroffen in uitstrijkjes, die afzonderlijk of in groepjes liggen en clusters vormen in de vorm van vilt of vlechten. In jonge culturen, met name die geïsoleerd van patiënten die langdurig chemotherapie hebben ondergaan, onderscheiden mycobacteriën zich door een uitgesproken polymorfisme, tot en met de aanwezigheid van korte, bijna coccoïde of langwerpige varianten die lijken op schimmelmycelium, samen met staafvormige vormen.

De intensiteit van mycobacteriële groei wordt aangegeven volgens het volgende schema: (+) - 1-20 CFU in een reageerbuis (lage bacteriële uitscheiding); (++) - 20-100 CFU in een reageerbuis (matige bacteriële uitscheiding); (+++) - >100 CFU in een reageerbuis (overvloedige bacteriële uitscheiding). Bij laboratoriumdiagnostiek van tuberculose is het niet voldoende om uit te maken of mycobacteriën al dan niet met een bepaalde methode zijn gedetecteerd. Het is ook noodzakelijk om een gedetailleerd beeld te hebben van de omvang en aard van de mycobacteriële populatie, de samenstelling en eigenschappen ervan. Het zijn deze gegevens die het mogelijk maken de status van het proces correct te interpreteren, tactieken te plannen en de behandeling tijdig aan te passen.

De laatste jaren zijn voedingsmedia op agarbasis met diverse groeiadditieven en het gebruik van een speciaal gasmengsel voorgesteld om de groei van mycobacteriën te versnellen. Om de groei van mycobacteriën op deze media te bevorderen, wordt tijdens de kweek een atmosfeer met een verhoogd koolstofdioxidegehalte (4-7%) gecreëerd. Hiervoor worden speciale CO2-incubatoren gebruikt _. Geautomatiseerde mycobacteriekweeksystemen hebben echter de grootste ontwikkeling doorgemaakt: MGIT-BACTEC-960 en MB/Bact.

Een van dergelijke systemen is het MGIT-systeem (Mycobacteria Growth Indicating Tube), een hightech-ontwikkeling die is ontworpen voor versnelde bacteriologische diagnostiek van tuberculose en het bepalen van de gevoeligheid van mycobacteriën voor eerstelijnsgeneesmiddelen en sommige tweedelijnsgeneesmiddelen. MGIT is ontworpen voor gebruik als onderdeel van het VASTEC-960-apparaat. Micro-organismen worden gekweekt in speciale reageerbuisjes met een vloeibaar voedingsmedium op basis van een gemodificeerd Middlebrook-7H9-medium. Om de groei van mycobacteriën te stimuleren en de groei van vreemde microflora te onderdrukken, worden MGIT Growth Supplement en een mengsel van PANTA-antibacteriële geneesmiddelen gebruikt.

De groei van micro-organismen wordt optisch geregistreerd. Deze registratie is gebaseerd op fluorescentie, die optreedt wanneer mycobacteriën tijdens hun groei zuurstof verbruiken. Een zuurstofafhankelijke fluorochroomkleurstof bevindt zich op de bodem van een speciale reageerbuis en is bedekt met een laag siliconen. De voortplanting van mycobacteriën leidt tot een afname van de hoeveelheid zuurstof in de reageerbuis en een afname van de concentratie ervan, wat een toename van de fluorescentie veroorzaakt. Deze fluorescentie wordt zichtbaar wanneer de reageerbuis wordt bestraald met ultraviolet licht en wordt automatisch geregistreerd door fotosensoren die in het VASTES-960-apparaat zijn ingebouwd. De luminescentie-intensiteit wordt geregistreerd in groei-eenheden (GU). Groeigegevens worden automatisch in een computer ingevoerd, waar ze kunnen worden opgeslagen. Computeranalyse van groeicurven kan informatie verschaffen over de aanwezigheid van verschillende groepen mycobacteriën, waaronder niet-tuberculeuze, en helpt ook bij het evalueren van de groeikenmerken van mycobacteriën.

Dankzij de introductie van dergelijke systemen is de groeitijd van mycobacteriën aanzienlijk verkort, met gemiddeld 11 dagen op VASTEC-960 en 19 dagen op MB/Bact, tegenover 33 dagen op een standaard, dicht voedingsmedium. Deze systemen vereisen echter hooggekwalificeerd personeel. Het zaaien van materiaal op vloeibare media gaat noodzakelijkerwijs gepaard met het zaaien op het Löwenstein-Jensen-medium, dat als back-up fungeert in gevallen waarin tuberculosemycobacteriën niet op andere media groeien.

[ 38 ], [ 39 ], [ 40 ], [ 41 ], [ 42 ], [ 43 ]

Bepaling van de geneesmiddelgevoeligheid van mycobacteriën

Het bepalen van het spectrum en de mate van gevoeligheid van mycobacteriën voor tuberculosebestrijdende middelen is van groot klinisch belang, evenals voor de epidemiologische beoordeling van de verspreiding van resistente tuberculose. Bovendien stelt het monitoren van resistentie ons in staat om de effectiviteit van het tuberculosebestrijdingsprogramma als geheel te beoordelen, aangezien het een integrale indicator is van de werking van alle onderdelen van de tuberculosebestrijdingsmaatregelen.

Frequentie en tijdstip van testen op geneesmiddelgevoeligheid:

• vóór de start van de behandeling, één keer om de behandelstrategie en -tactieken te bepalen:
• Bij het isoleren van culturen uit verschillende materialen van een patiënt (sputum, BAL, urine, exsudaten, hersenvocht, enz.) worden alle geïsoleerde stammen onderzocht:
• aan het einde van de intensieve behandelfase bij afwezigheid van klinische en radiologische dynamiek:
• indien het nodig is het behandelingsregime te wijzigen in geval van:
  • afwezigheid van sputumnegativiteit;
  • herkweek na sputumnegativiteit;
  • Een sterke toename van de hoeveelheid AFB in een uitstrijkje na een aanvankelijke afname. Het is bekend dat stammen van Mycobacterium tuberculosis met verschillende geneesmiddelgevoeligheid worden geïsoleerd uit materiaal van een patiënt met tuberculose. De gevoeligheid van stammen voor antituberculosemiddelen kan verschillen in het spectrum van geneesmiddelen, de mate, frequentie en snelheid van resistentieontwikkeling.

De mate van resistentie van Mycobacterium tuberculosis wordt bepaald volgens vastgestelde criteria. Deze criteria zijn gericht op de klinische betekenis van resistentie en hangen af van de antituberculose-activiteit van het geneesmiddel, de farmacokinetiek ervan, de concentratie in de laesie, de maximale therapeutische dosis, enz.

De bepaling van de geneesmiddelgevoeligheid van mycobacteriën wordt momenteel uitgevoerd met behulp van microbiologische methoden:

• absolute concentraties (verdunningsmethode op vaste of vloeibare voedingsmedia),
• verhoudingen,
• weerstandscoëfficiënt.

Meestal manifesteert resistentie zich in de vorm van visueel waargenomen groei van kolonies van mycobacteria tuberculosis. Er bestaan echter methoden die groei in de vroege stadia van de celdeling van mycobacteriën induceren in de vorm van kleurreacties. Deze methoden verkorten de testtijd van 3-4 naar 2 weken.

De absolute concentratiemethode, aanbevolen door de WHO Chemotherapiecommissie, is in Rusland wijdverbreid als uniforme methode. Vanuit methodologisch oogpunt is dit de eenvoudigste methode, maar vereist een hoge standaardisatie en precisie van laboratoriumprocedures. De geneesmiddelgevoeligheidstest bestaat uit een set reageerbuisjes met een voedingsmedium dat is gemodificeerd met tuberculosemedicijnen. De set bestaat uit 2-3 reageerbuisjes met verschillende concentraties van elk van de gebruikte geneesmiddelen, één controlebuisje met een medium zonder het geneesmiddel en één reageerbuisje met 1000 μg/ml natriumsalicylaat of 500 μg/ml paranitrobenzoëzuur om de groei van niet-tuberculeuze mycobacteriën te detecteren.

Om een set media met preparaten te bereiden, gebruikt u een gemodificeerd Lowenstein-Jensen-medium (zonder zetmeel), dat in kolven wordt gegoten. Aan elk van de kolven wordt een bepaald volume van de overeenkomstige verdunning van het antituberculosemiddel toegevoegd. De inhoud van de kolven wordt grondig gemengd, in reageerbuizen gegoten en gedurende 40 minuten schuin gecoaguleerd bij een temperatuur van 85 °C. Het wordt aanbevolen om het medium te coaguleren in een elektrische coagulator met automatische temperatuurregeling. Medium met antituberculosemiddelen

De eerste rij kan 1 maand in de koelkast bewaard worden bij 2-4 °C, met de tweede rij geneesmiddelen maximaal 2 weken. Bewaring van media met geneesmiddelen bij kamertemperatuur is onaanvaardbaar. Bij de bereiding van oplossingen van tuberculosebestrijdende geneesmiddelen wordt rekening gehouden met hun activiteit, waarbij de concentratie wordt berekend met correctie voor het molecuulgewicht van het niet-specifieke deel van het geneesmiddel, de zuiverheid, enz. Om de gevoeligheid voor het geneesmiddel te bepalen, worden alleen chemisch zuivere stoffen gebruikt.

Het principe van de methode is het bepalen van de concentratie van een antituberculosemiddel dat de groei van een aanzienlijk deel van de mycobacteriënpopulatie remt. Mits correct uitgevoerd, is deze methode zeer betrouwbaar.

Voordat de test wordt uitgevoerd, moet worden gecontroleerd of de geïsoleerde kweek van Mycobacterium tuberculosis geen vreemde microflora bevat. Een homogene suspensie met 500 miljoen microbiële lichamen in 1 ml (optische troebelheidsstandaard 5 eenheden) wordt bereid uit de kweek van mycobacteriën in een 0,9% natriumchloride-oplossing. De resulterende suspensie wordt verdund met 0,9% natriumchloride-oplossing (1:10) en 0,2 ml van de suspensie wordt toegevoegd aan elke reageerbuis van de voedingsbodemset. De geënte reageerbuizen worden in een thermostaat bij 37 °C geplaatst en gedurende 2-3 dagen horizontaal gehouden, zodat het schuine oppervlak van de voedingsbodem gelijkmatig wordt geënt met de suspensie van Mycobacterium tuberculosis. Vervolgens worden de reageerbuizen verticaal geplaatst en gedurende 3-4 weken geïncubeerd. De resultaten worden na 3-4 weken geregistreerd.

Omdat het minstens 1-1,5 maand duurt om de ziekteverwekker te isoleren uit klinisch materiaal op voedingsmedia, kunnen de resultaten van de bepaling van de gevoeligheid voor het geneesmiddel met deze methode pas 2-2,5 maanden na het enten van het materiaal worden verkregen. Dit is een van de belangrijkste nadelen van de methode.

De resultaten van tests op gevoeligheid van mycobacteriële geneesmiddelen worden geïnterpreteerd op basis van bepaalde criteria. Op vaste media wordt een kweek als gevoelig beschouwd voor de concentratie van het geneesmiddel in het medium als het aantal mycobacteriële kolonies dat in een reageerbuis met het geneesmiddel groeit, niet meer dan 20 bedraagt, met overvloedige groei in een controlereageerbuis zonder geneesmiddel. Alleen als er meer dan 20 kolonies zijn, wordt de kweek als resistent tegen een bepaalde concentratie beschouwd. In de praktijk is het, wanneer groeiresultaten in reageerbuizen van bijna 20 CFU worden verkregen, noodzakelijk om de klinische eenheid te informeren dat de gevoeligheid of resistentie in dit geval grensgevallen vertoont, aangezien dit soms de onduidelijke dynamiek van klinische indicatoren kan verklaren.

Voor diverse preparaten wordt een bepaalde concentratie vastgesteld waarbij de reproductie van een kritisch deel van de mycobacteriële populatie wordt waargenomen. Deze concentraties worden "kritisch" genoemd. De omvang van de groei van de mycobacteriële populatie op een voedingsmedium met het preparaat in een kritische concentratie wordt gebruikt als criterium voor stabiliteit.

In de praktijk van de binnenlandse fysiologie beperkt men zich bij het bepalen van geneesmiddelresistentie niet tot het bepalen van kritische concentraties. Dit komt doordat een ruimere definitie van de mate van geneesmiddelresistentie van de ziekteverwekker de clinicus in staat stelt om chemotherapietactieken correcter te formuleren, gebruikmakend van kennis over het potentiërende effect van geneesmiddelcombinaties, om kruisresistentie te voorspellen of om effectievere geneesmiddelen uit de gebruikte groep antituberculosemiddelen te gebruiken.

De absolute concentratiemethode is de eenvoudigste, maar ook het meest gevoelig voor fouten bij de implementatie. De proportionele methode is betrouwbaarder, vooral bij het bepalen van de gevoeligheid voor tweedelijnsmedicijnen, en wordt buiten Rusland veel gebruikt. Deze methode houdt rekening met de tekortkomingen van de absolute concentratiemethode, maar is arbeidsintensiever in de implementatie.

De methode lijkt sterk op de absolute concentratiemethode. De bereiding van reageerbuisjes met geneesmiddelen is hetzelfde als bij de absolute concentratiemethode. De entdosis van de tuberculosemycobacteriumsuspensie wordt echter 10 keer verlaagd, waardoor de frequentie van spontane resistentie van sommige tuberculosemycobacteriumstammen tegen geneesmiddelen zoals ethambutol, prothionamide en capreomycine wordt geëlimineerd. Als controles worden 2 of 3 buisjes gebruikt met een entdosis gelijk aan die in de reageerbuisjes, achtereenvolgens 10 en 100 keer verdund. Het criterium voor resistentie is de verhouding visueel waargenomen groei van tuberculosemycobacterium. Voor eerstelijnsmedicijnen is het criterium voor resistentie een overmatige groei van 1% van de initiële populatie, voor tweedelijnsmedicijnen een groei van 1 of meer dan 10% van de initiële populatie, afhankelijk van de gekozen kritische concentratie.

In 1997 heeft de werkgroep van de WHO en de Internationale Unie tegen Tuberculose voor de detectie van resistentie tegen tuberculosemedicijnen deze criteria aangepast en voorgesteld om mycobacteriën die op het dichte Lowenstein-Jensen-eimedium groeien bij de volgende concentraties als resistent te beschouwen:

• dihydrostreptomycine - 4 μg/ml;
• isoniazide - 0,2 µg/ml:
• rifampicine - 40 mcg/ml:
• Ethambutol - 2 mcg/ml.

In 2001 werden kritische concentraties voorgesteld voor de volgende tweedelijnsmedicijnen (voor een kritisch aandeel van 1%):

• capreomycine - 40 mcg/ml;
• protionamide - 40 mcg/ml;
• kanamycine - 30 μg/ml;
• viomycine - 30 μg/ml;
• cycloserine - 40 mcg/ml;
• aminosalicylzuur - 0,5 mcg/ml;
• ofloxacine - 2 mcg/ml.

De groeiresultaten worden na 4 weken als voorlopig beoordeeld en na 6 weken teelt als definitief.

Voor het bepalen van de gevoeligheid voor pyrazinamide, een veelgebruikte stof in moderne chemotherapie tegen tuberculose, is de aanbevolen kritische concentratie 200 μg/ml. Er is echter nog steeds geen algemeen aanvaarde methode om de resistentie tegen dit geneesmiddel op vaste voedingsbodems te bepalen, aangezien de antibacteriële werking ervan zich alleen manifesteert in een zure omgeving (pH < 6), die technisch moeilijk te handhaven is. Bovendien blijken veel klinische culturen van Mycobacterium tuberculosis niet te groeien op eiermedia met een zure omgeving.

Om de kwaliteit van de resultaten van de bepaling van de gevoeligheid van mycobacteriën voor geneesmiddelen te beoordelen, wordt aanbevolen om elke nieuwe batch van het Lowenstein-Jensen-medium te controleren door parallel de gevoeligheid van de standaard museumstam H37Rv te bepalen. Daarnaast zijn er bepaalde microbiologische criteria waaraan moet worden voldaan, zodat de methoden een goed reproduceerbaar en correct geïnterpreteerd resultaat opleveren. Deze omvatten de levensvatbaarheid van de kweek van tuberculosemycobacteriën, de regels voor het verkrijgen van een homogene suspensie en suspensie, de regels voor het selecteren van culturen van tuberculosemycobacteriën en de representativiteit van de geselecteerde bacteriemassa. De betrouwbaarheid van de bepaling van resistentie tegen geneesmiddelen neemt af bij extreem slechte bacteriële uitscheiding.

Recentelijk is de methode voor het bepalen van de gevoeligheid voor geneesmiddelen met behulp van geautomatiseerde systemen als veelbelovend erkend. De meest geavanceerde op dit gebied zijn ontwikkelingen gebaseerd op VASTEC MGIT-960. In dit geval wordt de gevoeligheid van tuberculosemycobacteriën voor geneesmiddelen bepaald op basis van een gemodificeerde proportiemethode. Tijdens de bepaling wordt de groeisnelheid van tuberculosemycobacteriën in de controlebuis en in buizen met geneesmiddelen vergeleken. Om de gevoeligheid voor streptomycine, isoniazide, rifampicine en ethambutol te bepalen, worden verrijkende additieven en antibiotica uit de SIRE-kit gebruikt. Om de gevoeligheid voor pyrazinamide te bepalen, wordt de PZA-kit gebruikt. Tijdens de test worden reageerbuizen met geneesmiddelen geënt met een suspensie van tuberculosemycobacteriën, evenals controlebuizen met een 100-voudige verdunning van de suspensie voor alle geneesmiddelen, met uitzondering van pyrazinamide, waarbij de suspensie 10 keer wordt verdund. Het criterium voor stabiliteit is de mycobacteriegroei-indicator van 100 GU wanneer de groei in de controlebuis 400 GU bereikt (zie "Kweekmethoden voor het isoleren van mycobacteriën"). De resultaten worden automatisch geregistreerd en geïnterpreteerd en ingesteld door het ingevoerde of geselecteerde programma.

De uiteindelijke concentraties in de reageerbuis met vloeibaar voedingsmedium worden gebruikt als kritische concentraties. Momenteel zijn kritische concentraties ontwikkeld voor zowel eerstelijnsgeneesmiddelen als sommige tweedelijnsgeneesmiddelen. Opgemerkt dient te worden dat de bepaling van de gevoeligheid van tuberculosemycobacteriën voor cycloserine en aminosalicylzuur alleen wordt uitgevoerd op voedingsmedia van eieren.

Een gedetailleerd protocol voor het werken met het beschreven systeem maakt het mogelijk om de gevoeligheid van geneesmiddelen te testen op zowel een geïsoleerde kweek (met een dicht voedingsmedium) als met de primaire groei van mycobacteriën in een MGIT-reageerbuis. Deze laatste optie verkort de tijd die nodig is voor het uitvoeren van cultuurstudies aanzienlijk, waardoor volledige resultaten van de kweek van tuberculosemycobacteriën (inclusief informatie over de gevoeligheid van het geneesmiddel) binnen 3 weken na het verzamelen van het materiaal beschikbaar zijn, terwijl de traditionele methode dit pas na 3 maanden kan opleveren. Tijdige resultaten, wanneer de patiënt zich in de intensieve behandelfase bevindt, kunnen de relatief hoge kosten van de studies compenseren.

[ 44 ], [ 45 ], [ 46 ], [ 47 ], [ 48 ], [ 49 ], [ 50 ]

Differentiatie van mycobacteriën

Aangezien de gebruikte voedingsmedia niet strikt selectief zijn, wordt verdere differentiatie van de geïsoleerde mycobacteriën als noodzakelijk beschouwd. De noodzaak tot differentiatie van mycobacteriën is te wijten aan een aantal kenmerken van pathologische processen die worden veroorzaakt door vertegenwoordigers van het geslacht: een verschillend beloop en verloop van tuberculose en mycobacteriose, en de aanwezigheid van natuurlijke resistentie tegen sommige tuberculosemedicijnen.

Erkend wordt dat de primaire identificatie van mycobacteriën van het M. tuberculosis-complex van niet-tuberculeuze mycobacteriën wordt uitgevoerd op basis van de volgende kenmerken: groeisnelheid op dichte voedingsmedia, pigmentvorming, koloniemorfologie, de aanwezigheid van zuurresistentie en de optimale temperatuur voor groei.

Helaas bestaat er geen enkele laboratoriummethode die op betrouwbare wijze mycobacteriën van het M. tuberculosis-complex kan onderscheiden van andere zuurbestendige mycobacteriën. Een combinatie van de hierboven beschreven tekenen met de uitslagen van een aantal hieronder vermelde biochemische testen maakt het echter mogelijk om mycobacteriën van het M. tuberculosis-complex te identificeren met een waarschijnlijkheid van maar liefst 95%.

Om mycobacteriën van het M. tuberculosis-complex (M. tuberculosis, M. bovis, M. bovisBCG, M. africanum, M. microti, M. canettii en andere) te onderscheiden van langzaam groeiende niet-tuberculeuze mycobacteriën, worden basale biochemische testen gebruikt om de aanwezigheid van de volgende tekenen op te sporen:

• vermogen om nicotinezuur te produceren (niacinetest):
• nitraatreductase-activiteit;
• thermostabiele catalase;
• groei op een medium met natriumsalicylaat (1 mg/ml).

Als aanvullende test kunnen ook groeitesten op een medium met 500 μg/ml para-nitrobenzoëzuur of 5% natriumchloride worden gebruikt.

Veel bacteriologische laboratoria identificeren deze micro-organismen alleen op complex niveau. Dit komt door de beperkte mogelijkheden van laboratoria en de methodologische vaardigheden van specialisten.

In de praktijk zijn in de meeste gevallen de volgende testen voldoende om M. tuberculosis en M. bovis te onderscheiden: niacine, nitraatreductase, pyrazinamidase en groeiregistratie op een medium met 2 μg/ml thiofeen-2-carbonzuurhydrazide. Er wordt rekening mee gehouden dat mycobacteriën van het M. tuberculosis-complex worden gekenmerkt door de volgende kenmerken:

• langzame groei (meer dan 3 weken);
• groeitemperatuur binnen 35-37 ^o C;
• afwezigheid van pigmentatie (ivoorkleur);
• uitgesproken zuurbestendige kleuring;
• positieve niacinetest;
• positieve nitraatreductasetest;
• afwezigheid van thermostabiele catalase (68 ^o C).
• gebrek aan groei op Lowenstein-Jensen medium dat het volgende bevat:
  • 1000 µg/ml natriumsalicylzuur,
  • 500 mcg/ml para-nitrobenzoëzuur,
  • 5% natriumchloride:
• groei in aanwezigheid van 1-5 μg/ml thiofeen-2-carbonzuur.

De relevantie van de differentiatie van geïsoleerde mycobacteriën zal aanzienlijk toenemen met de toename van de frequentie van registratie van hiv/aids-gevallen geassocieerd met tuberculose of mycobacteriose. Momenteel is er geen absolute zekerheid over de paraatheid van de regionale laboratoria om deze hoeveelheid werk correct uit te voeren.

[ 51 ], [ 52 ], [ 53 ], [ 54 ], [ 55 ], [ 56 ], [ 57 ], [ 58 ]

Immunologische diagnostiek van tuberculose

Er zijn een aantal universele verschijnselen, preparaten en immunologische tests die aanvankelijk specifiek werden ontdekt bij tuberculose of in het model van de immuunrespons op mycobacteriën. Deze omvatten BCG en tuberculine, een fenomeen zoals huid-DST (tuberculinetests - reacties van Pirquet en Mantoux), de reactie op subcutane toediening van tuberculine aan gesensibiliseerde dieren (Koch-fenomeen). Enkele van de eerste antilichamen bij infectieziekten werden ook ontdekt bij tuberculose. Natuurlijk, hoe beter het begrip van de mechanismen van anti-tuberculose-immuniteit en hun genetische controle, hoe breder de inzet van immunologische methoden en preparaten die de immuniteit beïnvloeden, kan zijn voor het oplossen van praktische problemen in de tuberculoseleer.

Het belangrijkste en meest complexe praktische probleem op dit moment is de detectie van tuberculose in het kader van massascreening van de bevolking. Ondanks talrijke meldingen van "successen" (op basis van beperkt materiaal) is er echter geen immunologische methode (die in "welke handen dan ook" reproduceerbaar is) of medicijn dat geschikt is voor deze doeleinden.

Immunologische methoden, in het bijzonder serologisch onderzoek (bepaling van antigenen, antilichamen) en tuberculineprovocatietesten, worden in de klinische praktijk veelvuldig toegepast.

Serologische methoden, waarmee antigenen en antilichamen in verschillende omgevingen van het lichaam worden bepaald, staan op de eerste plaats van immunologische onderzoeken die in de differentiële diagnostiek worden gebruikt.

De specificiteit van de bepaling van antilichamen tegen Mycobacteria tuberculosis hangt af van de antigenen die in de immuunanalyse worden gebruikt. Er zijn een aanzienlijk aantal antigenen voorgesteld, waarvan tuberculine PPD de eerste is:

• PPD en andere complexe preparaten uit kweekvloeistof;
• ultrasoon desintegratiemiddel;
• Triton-extract en andere complexe celwandpreparaten;
• 5-antigeen (Daniel);
• 60-antigeen (Coccito);
• lipoarabinomannaan;
• koordfactor (trehalose-6,6-di-mycolaat);
• fenolische en andere glycolipiden;
• lipopolysacchariden;
• fibronectine-bindend antigeen;
• eiwitten (meestal recombinant); 81,65,38,34,30,19,18,16,15,12 KDA, enz.

Dankzij jarenlang onderzoek door Russische en buitenlandse wetenschappers zijn de belangrijkste patronen van antilichaamvorming en de effectiviteit van serologische diagnostiek van tuberculose geïdentificeerd: hoe complexer het antigeen, hoe hoger de gevoeligheid en hoe lager de specificiteit van de tests. De specificiteit varieert per land, afhankelijk van de infectie van de populatie met M. tuberculosis en niet-tuberculeuze mycobacteriën, de BCG-vaccinatie, enz. Bij kinderen is de informatieve waarde van serodiagnostiek lager dan bij volwassenen. Bij primaire tuberculose (vaker bij kinderen) is de bepaling van IgM informatiever; bij secundaire tuberculose - IgG. Bij hiv-geïnfecteerden is de informatieve waarde van serodiagnostiek bij het bepalen van antilichamen verminderd. De effectiviteit van antilichaambepaling hangt af van een aantal "klinische momenten": de activiteit van het proces (de aan- of afwezigheid van "isolatie" van mycobacteriën, de aanwezigheid van cariësholtes, de mate van infiltratie), de prevalentie van het proces en de duur van het beloop.

De gevoeligheid van de enzymimmunoassay (EIA)-methode is ongeveer 70%. De onvoldoende effectiviteit van de studie is te wijten aan de lage specificiteit. Eerder werden de mogelijkheden van serologische screening bij risicogroepen overwogen, met name bij mensen met post-tuberculoseveranderingen in de longen.

Om de specificiteit van ELISA te verhogen, wordt gezocht naar specifiekere antigenen, waaronder antigenen verkregen door genetische manipulatie: ESAT-6, enz. (zie hierboven). Het gebruik van strikt specifieke antigenen (38 kDa, ESAT) verhoogt de specificiteit, maar vermindert de gevoeligheid van de analyse aanzienlijk. Naast ELISA (experimentele laboratoriumtestsystemen, zoals de Pathozyme ELISA-kit) worden ook immunochromatografische kits met laterale filtratie (Mycodot) aangeboden, evenals andere vergelijkbare tests (membraandotanalyse) met visuele beoordeling van het testresultaat. De analyse van deze tests duurt 10-30 minuten; er is geen speciale apparatuur voor nodig, maar een visuele beoordeling van de resultaten is vereist, wat gepaard gaat met een zekere subjectiviteit. Deze methoden hebben ongeveer dezelfde gevoeligheids- en specificiteitskenmerken (respectievelijk 70% en 90-93%) als traditionele ELISA.

Het gebruik van immuunanalysemethoden heeft een zekere waarde als aanvullende methode binnen het complex van methoden dat wordt gebruikt bij de differentiële diagnose van tuberculose, met name bij de diagnose van de extrapulmonale vormen ervan. De ELISA-methode is het meest effectief bij de diagnose van tuberculeuze meningitis door onderzoek van het hersenvocht. In dit geval is de sensitiviteit van de analyse 80-85% en de specificiteit 97-98%. Er is informatie over de effectiviteit van het bepalen van antilichamen tegen Mycobacterium tuberculosis in traanvocht bij de diagnose van tuberculeuze uveïtis.

Inductie van gamma-interferonsynthese in vitro

Gamma-interferon (IFN-γ) is een factor van specifieke immuunbescherming, gerealiseerd door activering van de enzymsystemen van macrofagen. Inductie van de IFN-γ-synthese door gesensibiliseerde T-lymfocyten wordt veroorzaakt door hun interactie met mycobacteriële antigenen.

Zowel tuberculine PPD als specifieke antigenen verkregen door genetische modificatie worden gebruikt als antigenen, met name ESAT-6 antigeen (vroeg uitgescheiden antigeen met een molecuulgewicht van 6 kDa) en CFP-10 (cultuurfiltraateiwit, 10 kDa). Genetisch gemanipuleerde of recombinante antigenen ontbreken in de cellen van het BCG-vaccin en andere mycobacteriën. Bij gebruik van tuberculine zijn de resultaten van de IFN-γ-inductietest vergelijkbaar met de resultaten van de tuberculinehuidtest (directe correlatie). Bij gebruik van genetisch gemanipuleerde antigenen zijn de testresultaten specifieker en zijn ze niet afhankelijk van eerdere BCG-vaccinatie. Bij het onderzoeken van gevaccineerde personen die geen contact hebben gehad met een tuberculose-infectie, is de specificiteit van de test 99%. De gevoeligheid van de test bij tuberculosepatiënten varieert van 81 tot 89%.

Tests en diagnostiek zijn ontwikkeld op basis van kortdurende kweek van volledige bloedcellen of mononucleaire cellen, geïsoleerd uit bloed met tuberculosemycobacteriënantigenen in vitro, gevolgd door bepaling van de IFN-γ-concentratie of telling van het aantal T-lymfocyten dat IFN-γ synthetiseert. De concentratie van het in een reageerbuis gesynthetiseerde interferon wordt bepaald door middel van ELISA met behulp van monoklonale antilichamen die IFN-γ binden. Vervolgens wordt, met behulp van kalibratie van standaard IFN-γ, de concentratie in de reageerbuis of de wells op de plaat bepaald.

Bij de Elispot-test wordt het aantal T-cellen dat IFN-γ synthetiseert, geteld op het oppervlak van een schaaltje dat bedekt is met antilichamen tegen IFN-γ.

De ontwikkelaars van de in-vitro IFN-γ-inductiediagnostiek, die is goedgekeurd door de Amerikaanse Food and Drug Administration, beweren dat de test geen latente tuberculose-infectie kan onderscheiden van actieve tuberculose. Daarom heeft de test in regio's met een hoge infectiegraad geen directe diagnostische waarde. In ons land kan de test echter wel worden gebruikt om een tuberculose-infectie bij kinderen te onderscheiden van allergieën na vaccinatie, en om de mate van specifieke immuniteit tijdens de behandeling te beoordelen.

Momenteel wordt er onderzoek gedaan naar een binnenlands testsysteem om de inductie van IFN-γ-synthese door specifieke tuberculose-antigenen in vitro te bepalen.

Immuunstatus en beloop van tuberculose, immunocorrectie

Tijdens de behandeling van tuberculose vinden er bij mensen veranderingen plaats in de antigenemie en de toestand van het immuunsysteem.

De gegevens over veranderingen in exsudaten en weefsels spreken elkaar grotendeels tegen. Het enige dat met recht kan worden opgemerkt, is dat tuberculeuze granulomen doorgaans een aanzienlijk aantal geactiveerde T-lymfocyten bevatten.

Het is zinvol om nog even stil te staan bij twee punten die nodig zijn om de rol van immunologische mechanismen bij de behandeling van tuberculose bij mensen te begrijpen:

• Bij aidspatiënten is de kans op het ontwikkelen van meervoudige resistentie tegen geneesmiddelen bijzonder groot;
• Bij meervoudige resistentie tegen geneesmiddelen (en bij afwezigheid van een HIV-infectie) spelen immuunstoornissen (vooral de T-celimmuniteit) een bijzonder belangrijke rol.

Bij tuberculose worden diverse methoden van immunocorrectie veelvuldig toegepast. Ten eerste zijn dit medicijnen die vooral inwerken op de T-celimmuniteit en het mononucleaire fagocytensysteem (thymushormonen, isofonen, licopiden, polyoxidonium, enz.), maar ook hele (verzwakte) mycobacteriën en hun componenten.

Moleculaire biologische diagnostiek van tuberculose

Moleculair biologische methoden in de diagnostiek van infectieziekten omvatten voornamelijk methoden gebaseerd op manipulatie van het genomisch materiaal van bacteriële en virale pathogenen om specifiek genetisch materiaal te identificeren - DNA-secties met een nucleotidesequentie die specifiek is voor een bepaalde soort of stam van de pathogeen, voor het analyseren van specifieke DNA-sequenties in genen die de gevoeligheid van de pathogeen voor bepaalde geneesmiddelen bepalen, en voor het analyseren van de functionele activiteit van bepaalde genen van de pathogeen. Moleculair biologische methoden hebben een brede toepassing gevonden in wetenschappelijk onderzoek en praktische toepassing in de diagnostiek en monitoring van diverse bacteriële en virale infecties na de ontdekking van de polymerasekettingreactie in 1985 door Carrie Mullis (Nobelprijswinnaar in 1989).

Principes en mogelijkheden van de polymerasekettingreactiemethode

PCR maakt het mogelijk om een nucleotidesequentie (een fragment van het DNA van een pathogeen) in een reageerbuis in enkele uren miljoenen keren te amplificeren (vermenigvuldigen). Het uitvoeren van de reactie in de aanwezigheid van enkele DNA-ketens bepaalt de uitzonderlijk hoge gevoeligheid van de analyse.

De nucleotidevolgorde van specifieke delen van de DNA-keten bepaalt de genetische uniciteit van het micro-organisme, wat de hoge specificiteit van PCR verklaart.

Het belang van deze methode voor het opsporen en bestuderen van de kenmerken van Mycobacterium tuberculosis is te danken aan de biologische kenmerken van het micro-organisme, dat een zeer langzame groei vertoont: de verdubbelingstijd van het DNA van Mycobacterium tuberculosis tijdens de kweek bedraagt 12-24 uur.

Het principe van de PCR-methode is amplificatie: het meervoudig, miljoenen malen vermenigvuldigen van delen van een specifieke DNA-sequentie in een microvolume in een reageerbuis, met cyclische herhaling van de volgende drie reactiestappen, die elk plaatsvinden bij een ander temperatuurregime:

• Fase I - denaturatie van dubbelstrengs DNA bij verhitting met divergentie van de ketens;
• Fase II - complementaire binding (hybridisatie) van primers (priming oligonucleotiden) met de eindsecties van de ketens van een strikt specifiek DNA-fragment dat is geselecteerd voor amplificatie;
• Fase III – voltooiing van de DNA-fragmentketen met behulp van thermostabiele DNA-polymerase.

^{Voor amplificatie moet de reageerbuis matrix-DNA-moleculen bevatten. Vier soorten deoxynucleosidetrifosfaten (nucleotiden) met de bijbehorende stikstofbasen: adenine (A), thymine (T), guanine (G), cytosine (C); kunstmatig gesynthetiseerde priming-oligonucleotiden (primers) bestaande uit 18-20 basenparen; een thermostabiel enzym, DNA-polymerase, met een temperatuuroptimum van 68-72 °} C, en magnesiumionen.

De specificiteit van PCR hangt af van de keuze van het DNA-fragment. Op basis hiervan worden flankerende primeroligonucleotiden gesynthetiseerd. De specificiteit van hybridisatie en completering van de DNA-keten wordt bepaald door het principe van complementariteit van de volgende paren stikstofbasen: adenine-thymine, guanine-cytosine.

Om het genoom van de tuberculose-mycobacteriën te bepalen, is het IS6110-DNA-fragment in de meeste testsystemen het meest effectieve amplificatiedoel. In de meeste tuberculose-mycobacteriënstammen is dit fragment een significant aantal (10-20) herhalingen in het genoom. Dit zorgt, naast de specificiteit, voor een hoge gevoeligheid van de analyse. Tegelijkertijd zijn er ook tuberculose-mycobacteriënstammen beschreven met een klein aantal herhalingen of de afwezigheid van het IS6110-fragment.

Extractie van DNA-moleculen uit een biologisch monster

Om PCR uit te voeren, moeten de DNA-moleculen van de ziekteverwekker uit het biologische materiaal worden geïsoleerd in een minimaal volume, met een minimale hoeveelheid niet-specifiek DNA en verschillende remmers van het enzym DNA-polymerase.

De monsterbereiding moet worden uitgevoerd onder omstandigheden die kruisbesmetting van de te onderzoeken monsters met geïsoleerde DNA-moleculen voorkomen. Dit vereist een voorbehandeling van de ruimte met ultraviolet licht, vloeren en werkbladen van tafels en apparaten met chloorhoudende oplossingen. Het is ook noodzakelijk om schone handschoenen, wegwerpreageerbuisjes en tips voor automatische pipetten te gebruiken.

Om DNA van Mycobacterium tuberculosis te isoleren uit klinische monsters (hersenvocht, bronchiale lavage) die geen grote aantallen leukocyten, celresten of zouten bevatten, volstaat het om het monster te centrifugeren met 3-4 duizend omwentelingen per minuut, 20-30 µl van een 2%-oplossing van Triton X-100 aan het sediment toe te voegen en gedurende 30 minuten te verwarmen op 90 ^° C.

De bereiding van sputummonsters vereist efficiënte liquefactie, doorgaans met 4% natriumhydroxide en N-acetyl-L-cysteïne (NALC) in een dosering van 50-80 mg per monster, afhankelijk van de viscositeit van het monster. De NALC-oplossing moet ex tempore worden bereid, of NALC-poeder kan droog direct aan het monster worden toegevoegd. Na liquefactie moeten de monsters 15 minuten worden gecentrifugeerd bij 3500-4000 tpm (3000 g) in 50 ml-buisjes met schroefdop, d.w.z. onder dezelfde omstandigheden als aanbevolen voor de bereiding van sputum vóór de kweek.

Om DNA uit sediment te extraheren, wordt meestal een methode gebruikt die gebaseerd is op het gebruik van een 5-6 molaire oplossing van guanidine-isothiocyanaat als lyserend reagens en microporeuze siliciumoxidedeeltjes ("diatomeeënaarde") die DNA-moleculen sorberen. Niet-specifieke stoffen, waaronder mogelijke remmers, worden vervolgens gewassen in een 2,5 molaire oplossing van guanidine-isothiocyanaat en een ethanoloplossing, waarna de DNA-moleculen in water worden gedesorbeerd en deze monsters worden gebruikt voor PCR. Om de technologie van DNA-extractie te vereenvoudigen, wordt "diatomeeënaarde" vaak vervangen door magnetische microdeeltjes gecoat met siliciumoxide. In dit geval wordt een speciale magnetische standaard voor microbuisjes gebruikt om de deeltjes neer te slaan in plaats van centrifugatie.

In Rusland is een originele methode ontwikkeld voor immunomagnetische scheiding van mycobacteriën, gevolgd door extractie van pathogeen-DNA. Voor immunomagnetische scheiding van tuberculosemycobacteriën worden ferrodeeltjes van 3-5 μm groot, gecoat met siliciumoxide, gebruikt, waaraan polyklonale (konijnen) antilichamen tegen tuberculosemycobacteriën door middel van een chemische binding zijn gebonden. Sputummonsters na alkalische lysis worden geneutraliseerd met een zure Tris-HCl-oplossing en geïncubeerd met een immunomagnetisch sorptiemiddel. Vervolgens worden de immunoferrodeeltjes verzameld met behulp van een magneetstaaf met een verwisselbare punt, overgebracht naar een microbuis en neergeslagen. 20-30 μl van een 2% Triton X-100-oplossing wordt toegevoegd en gedurende 30 minuten verwarmd tot 90 ^° C. De supernatant wordt gebruikt als DNA-matrix voor PCR-analyse.

Een lastig probleem is de extractie van DNA van tuberculosemycobacteriën uit biopten. Voor biopsielysis wordt het enzym proteinase K gebruikt in een eindconcentratie van 200-500 mg/l bij een temperatuur van 56 ^° C gedurende de nacht. Vervolgens wordt het geëxtraheerd met behulp van een van de bekende methoden. Overtollig niet-specifiek DNA bij PCR-analyse van biopten veroorzaakt vaak remming van de reactie, waardoor herhaalde DNA-extractie noodzakelijk is.

Methoden voor detectie van resultaten

Nadat de reactie is voltooid, worden de versterkte fragmenten van het pathogeen-DNA met behulp van verschillende methoden geïdentificeerd.

De gelelektroforesemethode is algemeen bekend. In dit geval wordt het verkregen DNA-fragment geïdentificeerd door een positieve controle die het gewenste specifieke DNA-fragment bevat, of door een vooraf bekende grootte (aantal nucleotideparen) van het fragment, die wordt bepaald met een standaard moleculaire marker.

In aanwezigheid van een specifieke kleurstof, ethidiumbromide, die is opgenomen in dubbelstrengs DNA, wordt het gesynthetiseerde DNA-fragment zichtbaar als een band die oplicht onder invloed van ultraviolet licht.

De grootte van het DNA-fragment, bepaald door elektroforese op basis van de afgelegde afstand vanaf het begin, moet overeenkomen met een bekende moleculaire gewichtsmarker of positieve controle.

Andere methoden voor het bepalen van PCR-resultaten zijn gebaseerd op de hybridisatie van enkelstrengs PCR-producten met een complementaire oligonucleotide: een DNA-sonde die is gelabeld met biotine, gevolgd door detectie met behulp van een enzymatische reactie door bijvoorbeeld een streptavidine-alkalische fosfatase-conjugaat te binden aan biotine.

Op basis van dit type detectie zijn PCR-analysatoren ontwikkeld, waarbij de detectie van PCR-resultaten automatisch plaatsvindt door het meten van de optische dichtheid in monsters nadat de enzymatische reactie heeft plaatsgevonden.

Nadelen van deze methoden zijn onder meer de kans op intralaboratoriumcontaminatie met vrij korte fragmenten DNA-moleculen. Wanneer deze moleculen in nieuw geteste monsters terechtkomen, vormen ze een matrix voor PCR en leiden ze tot vals-positieve resultaten.

Om vals-positieve resultaten te voorkomen, worden er strikte regels ingevoerd voor het scheiden en isoleren van ruimtes: voor DNA-extractie uit biologische monsters; ruimtes voor detectie van resultaten (elektroforese) vanuit de schone zone. Deze ruimtes vormen een zone met waarschijnlijke besmetting. Een andere geïsoleerde zone is een schone ruimte voor het inbrengen van de te onderzoeken DNA-monsters in reageerbuisjes met het reactiemengsel voor PCR. Tot slot wordt ervan uitgegaan dat het hoofdapparaat - de DNA-versterker - naar een aparte ruimte, mogelijk een kantoorruimte, moet worden gebracht.

Om besmetting met de producten van eerdere reacties (amplicons) te voorkomen, bevatten sommige PCR-testsystemen deoxynucleoside uridine in plaats van deoxynucleoside thymidine. Dit wordt tijdens de in-vitroketensynthese op de corresponderende positie ingebouwd, d.w.z. de stikstofbase thymine in het oorspronkelijke DNA wordt vervangen door uracil. Uracil-DNA-glycosylase, toegevoegd aan het reactiemengsel van het geanalyseerde materiaal, vernietigt alleen de verontreinigende fragmenten met deoxyuridine, maar niet het geanalyseerde oorspronkelijke DNA dat deoxythymidine bevat. Verhitting tot 94 ^° C inactiveert dit enzym en interfereert niet met de amplificatie in PCR.

Er bestaat een testsysteem gebaseerd op isotherme amplificatie van rRNA, waarbij eerst reverse transcriptie en synthese van DNA-moleculen worden uitgevoerd, die op hun beurt de matrix vormen voor de daaropvolgende synthese van RNA-moleculen. RNA-amplicons worden gedetecteerd met behulp van een acridine-gekleurde DNA-probe tijdens hybridisatie in een reageerbuisoplossing. Deze methode heeft, naast een hoge gevoeligheid, het voordeel dat de analyse in één reageerbuis wordt uitgevoerd, wat contaminatie voorkomt. Volgens de auteurs bereikt de gevoeligheid van deze methode in respiratoire monsters 90% met een specificiteit van 99-100%.

Nieuwe detectiemethoden worden geïmplementeerd in realtime PCR. Deze methoden verschillen voornamelijk doordat PCR en de detectie van de resultaten gelijktijdig in één gesloten reageerbuis worden uitgevoerd. Dit vereenvoudigt niet alleen de analysemethode technologisch, maar voorkomt ook besmetting van laboratoriumruimtes en monsters door producten van eerdere PCR.

Bij real-time PCR worden de resultaten gedetecteerd door middel van fluorescentie, die ontstaat door hybridisatie van een fluorogene DNA-probe met een specifiek DNA-fragment dat tijdens de PCR wordt geamplificeerd. De structuur van fluorogene DNA-probes is zo opgebouwd dat de fluorescerende marker pas vrijkomt als gevolg van een enzymatische reactie of zich pas verwijdert van het fluorescentie-quenchermolecuul na specifieke hybridisatie met het gewenste DNA-molecuul dat tijdens de PCR wordt geamplificeerd. Naarmate het aantal moleculen dat met de probe wordt gehybridiseerd toeneemt, is de toename van de fluorescentie tot een detecteerbaar niveau evenredig met het aantal moleculen van het geamplificeerde product. Omdat het aantal DNA-fragmentmoleculen tijdens elke PCR-cyclus verdubbelt, is het aantal cycli waarvan de fluorescentie wordt gedetecteerd en toeneemt omgekeerd evenredig met het aantal DNA-moleculen in het oorspronkelijke monster. Als verschillende bekende concentraties van moleculen van het overeenkomstige DNA-fragment van de tuberculosemycobacterie als kalibrator in de reactie worden geïntroduceerd, kan het aantal DNA-genomen in het te bestuderen materiaal worden berekend met behulp van een computerprogramma.

Elk standaardmonster wordt gedupliceerd. Het kwantitatieve criterium is het minimale aantal PCR-cycli dat nodig is voor het begin en de groei van detecteerbare fluorescentie. De abscis-as geeft het aantal cycli aan; de ordinaat-as geeft de fluorescentiewaarde aan. DNA-concentraties zijn omgekeerd evenredig met het aantal cycli dat nodig is om fluorescentie te laten verschijnen. De vensters in de rechterkolom (21-32) tonen de cyclusnummers voor de corresponderende concentraties. De verschillen tussen 10-voudige concentraties van DNA-fragmenten 10 ² - 10 ⁶ ml bedragen 3,2-3,4 cycli. Voor twee patiënten waren de concentraties van IS6110-fragmenten ongeveer 10 ³ /ml en 10 ⁴ /ml. Rekening houdend met het aantal herhalingen (6-20) van de geanalyseerde fragmenten in het genoom van Mycobacterium tuberculosis, bedraagt het aantal Mycobacterium tuberculosis in de klinische monsters respectievelijk ongeveer 100 en 1000 cellen.

Toepassing van PCR bij de diagnose van tuberculose

De PCR-methode wordt het meest gebruikt voor de snelle diagnose van tuberculose - detectie van Mycobacterium tuberculosis in klinische monsters: sputum, bronchiale spoelingen, pleuraal exsudaat, urine, cerebrospinaal vocht, osteolysepuncties, aspiraten van het vrouwelijk geslachtsorgaan en diverse biopsieën. In een onderzoek in Nederland met ongeveer 500 monsters van sputum en bronchiale spoelingen van 340 patiënten met een bevestigde diagnose van longtuberculose, werd de vergelijkende gevoeligheid van de PCR-, kweek- en uitstrijkmicroscopiemethoden bestudeerd. De gevoeligheid van de analyse was respectievelijk 92,6%, 88,9% en 52,4%. De specificiteit van alle methoden was ongeveer 99%.

De detectie-efficiëntie van Mycobacterium tuberculosis werd vergeleken met behulp van uitstrijkmicroscopie, zaaien op Löwenstein-Jensen-medium, het VASTES-testsysteem en PCR-analyse. PCR toonde een gevoeligheid van 74,4%, microscopie - 33,8%, zaaien op vast medium - 48,9% en VASTES - 55,8%. De gemiddelde detectietijd voor zaaien op Löwenstein-Jensen-medium is 24 dagen: VASTES - 13 dagen, PCR - 1 dag.

Ook wordt de mogelijkheid besproken om PCR te gebruiken als gevoelige en snelle methode voor het monitoren van de effectiviteit van tuberculosebehandeling.

De detectie van DNA van Mycobacterium tuberculosis via de PCR-methode met effectieve chemotherapie verloopt over een langere periode - gemiddeld 1,7 maanden vergeleken met de bacteriële uitscheiding bepaald via fluorescentiemicroscopie, en 2,5 maanden vergeleken met bacteriologisch onderzoek.

Diagnose van extrapulmonale vormen van tuberculose

Het belang van PCR als gevoelige methode is vooral groot bij extrapulmonale vormen, omdat juist bij deze vormen de klinische en radiologische methoden en de traditionele bacteriologische methoden voor het aantonen van Mycobacterium tuberculosis in diagnostisch materiaal ineffectief zijn.

Bij het onderzoeken van urinemonsters waren de PCR-analyseresultaten positief bij 16 van de 17 patiënten met actieve tuberculose van het urinestelsel en negatief bij 4 patiënten met inactieve niertuberculose en 39 patiënten met niet-tuberculeuze ziekten van het urinestelsel.

De efficiëntie van PCR-analyse bij de studie van beenmergaspiraten bij patiënten met koorts van onbekende oorsprong met een vermoedelijke tuberculeuze aard van de ziekte werd aangetoond. Voor de diagnose van tuberculeuze lymfadenitis bij kinderen werden 102 punctie-aspiraten en biopsiemonsters van 67 kinderen met een vermoedelijke tuberculeuze lymfadenitis bestudeerd. Positieve resultaten werden verkregen: met real-time PCR - 71,6%, fluorescentiemicroscopie - 46,3%, kweekstudie - 41,8%. In de studie van 50 lymfeklierbiopsieën bij patiënten met kattenkrabziekte waren alle resultaten negatief. Aldus werd 100% specificiteit van PCR-analyse aangetoond. In hetzelfde werk werd de mogelijkheid aangetoond om M. avium te detecteren in een punctiebiopsie van lymfeklieren.

Het diagnosticeren van vrouwelijke genitale tuberculose bij onvruchtbaarheid staat bekend als een van de moeilijkste diagnostische problemen. Positieve resultaten werden verkregen in PCR-onderzoeken van endometriumbiopten, endometriumaspiraten en Douglas pouch-vloeistofmonsters bij 14 (56%) van de 25 laparoscopisch onderzochte patiënten met verdenking op tuberculose. Uitstrijkjesmicroscopie en kweekonderzoek leverden respectievelijk 1 en 2 positieve resultaten op. Deze gevallen waren ook PCR-positief. De meeste PCR-positieve resultaten waren bij patiënten met karakteristieke kenmerken van tuberculose volgens histologisch onderzoek; een kleiner aantal betrof gevallen met verdenking op tuberculose volgens laparoscopie. Slechts één positieve PCR-uitslag werd verkregen bij afwezigheid van laparoscopische gegevens voor tuberculose.

Bij de diagnose van extrapulmonale vormen van tuberculose stellen clinici zich vaak de vraag of de ziekteverwekker kan worden geïdentificeerd bij onderzoek van bloedmonsters met behulp van de PCR-methode. Literatuurgegevens wijzen erop dat de detectie van Mycobacterium tuberculosis-DNA in bloedmonsters mogelijk is bij gevorderde vormen van hiv-infectie. Mycobacterium tuberculosis-DNA werd alleen gedetecteerd bij gegeneraliseerde tuberculose van verschillende organen bij patiënten met een getransplanteerde nier en immunosuppressie.

[ 59 ], [ 60 ], [ 61 ], [ 62 ], [ 63 ]

Soortidentificatie van mycobacteriën

De PCR-methode kan zeer effectief zijn voor de snelle identificatie van mycobacteriën van het tuberculosecomplex en sommige soorten niet-tuberculeuze mycobacteriën na het verkrijgen van hun primaire groei. In dit geval kan het gebruik van PCR 7-10 dagen besparen die nodig zijn voor de daaropvolgende culturele identificatie van een positief resultaat. De PCR-studie is technisch zeer eenvoudig, omdat er geen complexe monstervoorbereiding van klinisch materiaal nodig is om een hoge gevoeligheid te bereiken. Bij het onderzoeken van 80 positieve culturen in een dergelijk testsysteem (MB BacT. van Organon) waren alle positieve PCR-analyseresultaten strikt specifiek en werden ze binnen 1 dag uitgevoerd. Om andere soorten mycobacteriën te identificeren wanneer ze in kweek worden verkregen, wordt het pathogeen-DNA gehybridiseerd met specifieke DNA-probes gelabeld met acridine, en worden de stammen gedetecteerd door het verschijnen van chemiluminescentie met behulp van een chemiluminometer of op nitrocellulosestrips met visuele beoordeling na hybridisatie. Deze kit identificeert een beperkt aantal soorten: Mycobacterium tuberculosis-complex, M. avium, M. avium-complex, M. kansasii en M. gordonae.

A. Telenti et al. ontwikkelden ook een relatief eenvoudige en goedkope methode voor soortidentificatie van klinisch belangrijke mycobacteriën op basis van PCR en daaropvolgende behandeling met twee restrictie-enzymen (enzymen die een DNA-molecuul op specifieke punten kunnen knippen). In dit geval wordt een DNA-fragment dat codeert voor een heat shock-eiwit (65 kDa) geamplificeerd, waarna het met PCR verkregen DNA-fragment, ter grootte van 439 nucleotideparen, afzonderlijk wordt behandeld met twee enzymen: Bste II en Nae III. Vervolgens worden de twee verkregen producten geanalyseerd met behulp van agarosegelelektroforese, waarbij hun grootte (aantal nucleotideparen) wordt bepaald aan de hand van een set standaard DNA-fragmenten (moleculaire DNA-markers) van 100 tot 1000 nucleotideparen lang. In elk van de gedefinieerde soorten (M. tuberculosis, M. avium, M. intracellulare, M. kansasii, M. fortuitum) worden voor elk restrictie-enzym 2 of 3 DNA-fragmenten van verschillende groottes gevonden. Door de combinatie van de resulterende DNA-fragmenten van verschillende groottes kunnen deze soorten van elkaar worden onderscheiden.

Er wordt een technologie voor biologische DNA-microarrays ontwikkeld waarmee in één onderzoek meer dan 100 soorten mycobacteriën kunnen worden geïdentificeerd.

Soortidentificatie kan ook worden uitgevoerd met behulp van PCR-amplificatie van de variabele regio van 16S rRNA, gevolgd door sequencing van de amplicons in vergelijking met de overeenkomstige primaire structuur, wat de identificatie van meer dan 40 soorten mycobacteriën mogelijk maakt.

PCR kan ook worden gebruikt om soorten binnen het tuberculose-mycobacteriecomplex te identificeren, inclusief differentiatie tussen M. bovis en M. bovis BCG. Dit gebeurt door de aan- of afwezigheid van bepaalde genen in de genomische regio's RD1, RD9 en RD10 te analyseren. RD1 is afwezig in M. bovis BCG, maar wel aanwezig in virulente soorten, waaronder M. bovis.

Bepaling van de geneesmiddelgevoeligheid van Mycobacterium tuberculosis met behulp van PCR

De taken van moleculair genetische methoden voor het bepalen van de gevoeligheid of resistentie van Mycobacterium tuberculosis voor geneesmiddelen, worden gereduceerd tot het identificeren van mutaties in bepaalde nucleotidesequenties van bekende genen. De belangrijkste methoden zijn gebaseerd op het direct lezen (sequencen) van deze sequenties na amplificatie, of op hybridisatie van biotine-gelabelde DNA-fragmenten die tijdens PCR met DNA-probes worden geamplificeerd. Beide opties omvatten het identificeren van substituties in nucleotidesequenties die, bij gebruik van DNA-probes, leiden tot de afwezigheid of onvolledige hybridisatie op een nitrocellulosemembraan met behulp van een enzymconjugaat (streptavidine-alkalische fosfatase) - de LIPA-Rif-TB-methode.

De methode voor het meten van fluorescentie in lokaal gefixeerde DNA-probes op microregio's die complementair zijn aan bekende mutaties in PCR-versterkte genregio's die verantwoordelijk zijn voor geneesmiddelgevoeligheid of -resistentie, wordt de microbiochipsmethode genoemd. Het basisalgoritme voor het uitvoeren van deze studie is als volgt. Nadat DNA is geïsoleerd uit een klinisch monster of mycobacteriële kweek, moet PCR worden uitgevoerd om de corresponderende fragmenten van het groB-gen te amplificeren, verantwoordelijk voor de geneesmiddelgevoeligheid voor rifampicine, of de katG- en inhA-genen die coderen voor mycobacteriële eiwitten die verantwoordelijk zijn voor de gevoeligheid voor isoniazide. De PCR-resultaten worden beoordeeld met behulp van agarosegelelektroforese, wat de ontvangst van de corresponderende DNA-fragmenten van de gewenste lengte bevestigt. Vervolgens wordt een tweede PCR-ronde uitgevoerd om een fluorescerend label in het DNA te introduceren. De PCR-resultaten worden opnieuw bevestigd met behulp van gelelektroforese. Hierna vindt hybridisatie plaats (incubatie gedurende een nacht) met aansluitend wassen van het verkregen materiaal op een biochip. Dit is een groot aantal korte DNA-ketens (probes) bevestigd op een klein glasplaatje, complementair aan de nucleotidesequenties van het medicijngevoelige type tuberculosemycobacterie op de plaatsen van mogelijke mutaties, evenals aan mutantsequenties die verantwoordelijk zijn voor medicijnresistentie. De locatie van de DNA-probes op het plaatje is strikt gedefinieerd en het fluorescentieniveau dat tijdens de hybridisatie wordt waargenomen, wordt vastgesteld met behulp van een speciaal uitleesapparaat. De analyseresultaten worden hierbij bepaald met behulp van een speciaal computerprogramma.

De afgelopen jaren zijn er alternatieve methoden ontwikkeld om de gevoeligheid van Mycobacterium tuberculosis voor geneesmiddelen te bepalen. Deze methoden zijn gebaseerd op real-time PCR-technologie. Hierdoor kunnen dergelijke onderzoeken in een gesloten reageerbuismodus worden uitgevoerd.

Figuur 13-13 toont de resultaten van de analyse van klinische culturen van Mycobacterium tuberculosis voor het bepalen van de resistentie tegen rifampicine met behulp van realtime PCR: 218 - controlemonster (gevoelig voor rifampicine); 93 - positieve controle voor de Ser-Trp TCG-TGG-mutatie; 4482 - positieve controle voor de Ser-Leu TCG-TTG-mutatie; 162-322 - experimentele monsters. De resultaten van de berekening van de amplificatiekinetische curven voor 4 kanalen: kanaal 1: 393 - positieve controle voor de Ser-Trp TCG-TGG-mutatie; kanaal 2: 4482 - positieve controle voor de Ser-Leu TCG-TTG-mutatie; 162, 163, 172, 295 - experimentele monsters; kanaal 4: amplificatiekinetische curven van alle aan het experiment deelnemende monsters. Positieve controle van de amplificatiereactie. Conclusies: De analyse toonde de volgende mutaties aan die resistentie tegen rifampicine bepalen: in monsters 162, 163, 172, 295 - Ser-Leu TCG-TTG. Hetzelfde principe werd gebruikt om de resistentie tegen isoniazide te bepalen via de genen katG en inhA, die de meest voorkomende mutaties bepalen.

[ 64 ], [ 65 ], [ 66 ], [ 67 ], [ 68 ], [ 69 ]

Stamidentificatie van Mycobacterium tuberculosis

De meest bestudeerde methode voor stamidentificatie van Mycobacterium tuberculosis is een technologie genaamd restrictiefragmentlengtepolymorfisme (RFLP). Deze technologie is gebaseerd op fragmentatie (restrictie) van Mycobacterium tuberculosis-DNA door het enzym Pvu II en daaropvolgende hybridisatie van de verkregen fragmenten met bepaalde specifieke sequenties op het DNA van het bijbehorende repeat-element IS6110. Intraspecifieke variabiliteit wordt gerealiseerd door het verschillende aantal IS6110-herhalingen en hun locatie op het DNA, evenals de diversiteit in afstanden tussen bepaalde aangrijpingspunten van het restrictie-enzym (restrictiesites) en het IS6110-element. Deze technologie is zeer complex en arbeidsintensief. Na behandeling van het DNA, geïsoleerd uit de tuberculosemycobacteriecultuur, met restrictie-enzym, wordt gelelektroforese uitgevoerd. Vervolgens worden DNA-fragmenten van verschillende lengtes overgebracht naar een nitrocellulosemembraan, gehybridiseerd met fragmenten van het IS6110-element en worden de resultaten gedetecteerd met behulp van een enzymatische reactie. Het resulterende specifieke bandpatroon karakteriseert het DNA van een specifieke stam van de tuberculosemycobacterie. Computeranalyse onthult de identiteit of verwantschap van de stammen. Hoewel de RFLP-methode het meest onderscheidend is, d.w.z. het grootste aantal verschillen in de geanalyseerde stammen aantoont, is deze ineffectief bij een klein aantal (minder dan 5) IS6110-herhalingen, dat in sommige stammen wordt waargenomen. Figuren 13-14 tonen de resultaten van de RFLP-typering van de stammen.

Een alternatief zou de spoligotyperingsmethode kunnen zijn: analyse van het polymorfisme van spacer-DNA-sequenties – intermediair tussen directe herhalingen van de DR-regio. Bij spoligotypering van stammen wordt PCR uitgevoerd met primers die de DR-regio begrenzen, waarna fragmenten van verschillende lengtes worden gevormd die hybridiseren met variabele intermediaire DNA-regio's. Analyse van spacersequenties van de DR-regio lijkt volgens onderzoekers eenvoudiger, productiever en geschikter voor primaire screening van stammen en voorlopige epidemiologische analyse, evenals voor directe bestudering van klinisch materiaal.

Een effectievere en technologisch toegankelijkere methode is uiteraard VNTR (afkorting van Engelse woorden), oftewel de methode om het variabele aantal exacte tandemherhalingen in het DNA van Mycobacterium tuberculosis te bepalen. Deze methode is uitsluitend gebaseerd op PCR en vereist geen aanvullende manipulaties. Omdat het aantal tandemherhalingen in verschillende stammen en op verschillende loci verschilt, worden fragmenten van verschillende groottes bepaald en geanalyseerd op het resulterende elektroforegram van PCR-producten. Volgens onderzoekers wordt met behulp van VNTR een grotere mate van onderscheid tussen stammen bereikt dan met de RFLP-methode.

De laatste jaren is er veel aandacht besteed aan de verspreiding van stammen van Mycobacterium tuberculosis van de W-Beijing-familie (soms ook wel de Beijing-stam genoemd), die grotendeels resistent zijn tegen medicijnen.

Basisvereisten voor de kwaliteit van moleculair biologisch onderzoek

[ 70 ], [ 71 ], [ 72 ], [ 73 ]

Belangrijkste regelgevende documenten voor het uitvoeren van PCR

Besluiten van het Ministerie van Volksgezondheid van de Russische Federatie: nr. 45 van 7-2-2000; nr. 109 van 21-3-2003; nr. 64 van 21-2-2000. Richtlijnen: 1.3.1888-04 "Organisatie van de werkzaamheden tijdens PCR-onderzoek van materiaal dat geïnfecteerd is met pathogene biologische agentia van pathogeniteitsgroepen III-IV"; 1.3.1794-03 "Organisatie van de werkzaamheden tijdens PCR-onderzoek van materiaal dat geïnfecteerd is met micro-organismen van pathogeniteitsgroepen I-II". 2003; 3.5.5.1034-01 "Desinfectie van testmateriaal dat geïnfecteerd is met bacteriën van pathogeniteitsgroepen I-IV bij het werken met de PCR-methode", 2001. Bijlage 11 bij de Instructies voor uniforme methoden van microbiologisch onderzoek bij de detectie, diagnose en behandeling van tuberculose.

[ 74 ], [ 75 ], [ 76 ]

Personeel

Moleculair biologische onderzoeken kunnen worden uitgevoerd door klinisch laboratoriumdiagnostisch artsen, bacteriologen, virologen, klinisch diagnostisch laboratoriumbiologen, alsmede door specialisten met een medische middelbare opleiding die een specialisatie en bijscholing op de vastgestelde wijze hebben gevolgd.

Inrichting van laboratoriumruimtes

De volgende laboratoriumfaciliteiten zijn vereist:

• Monsterverwerkingsruimte: een laboratorium dat is aangepast voor het werken met infectieuze agentia uit de pathogeniciteitsgroepen III-IV, overeenkomstig de Methodologische Richtlijnen 13.1888-04.
• De ruimte waarin PCR-reactiemengsels worden bereid, is een laboratoriumruimte die bescherming biedt tegen interne laboratoriumbesmetting - een "schoon" gebied.
• • Indien elektroforese of hybridisatie wordt gebruikt voor de analyse van PCR-producten, moet de laboratoriumruimte waarin de geamplificeerde DNA-fragmenten uit de amplificatiebuis worden geëxtraheerd en dus in de omgeving terecht kunnen komen, volledig geïsoleerd zijn van de in de voorgaande paragrafen vermelde ruimtes, conform de eisen voor PCR-laboratoria (Methodologische Richtlijnen 1.3.1794-03, Methodologische Richtlijnen 1.3.1888-04). Verplaatsing van personeel, apparatuur, materialen en voorwerpen van de elektroforeseruimte naar de monsterverwerkingsruimte en de "schone" ruimte, evenals luchtoverdracht via het ventilatiesysteem of als gevolg van tocht, moet worden uitgesloten. Deze ruimte is niet vereist voor fluorimetrische detectie van PCR-producten.
• De ruimte voor documentatie en verwerking van de resultaten is uitgerust met computers en de benodigde kantoorapparatuur. Deze ruimte kan apparatuur bevatten die PCR-producten detecteert zonder de buis te openen, zoals fluorescerende PCR-detectoren en thermocyclers voor realtime PCR.

De hygiënische en epidemiologische eisen voor de primaire verwerking van sputum zijn vergelijkbaar met de standaard microbiologische eisen voor het werken met Mycobacterium tuberculosis.

[ 77 ], [ 78 ], [ 79 ], [ 80 ]

Complete set laboratoriumapparatuur voor PCR-diagnostiek

De laboratoriumset bevat apparatuur voor de volgende ruimtes.

• monstervoorbereidingsruimte, bevat de volgende apparatuur: laminaire stromingskap van beschermingsklasse II "SP-1.2": solid-state thermostaat met een verwarmd deksel voor Eppendorf-reageerbuizen; microcentrifuge bij 13.000 rpm; centrifuge ("Vortex"); koelkast met een temperatuurbereik van -20 ^° C tot +10 ^° C; pipetten met variabel volume van de serie "Proline"; pomp met een opvangkolf OM-1; pipettenrek; werkstationrek 200x0,5 ml; werkstationrek 50x1,5 ml; rekken voor het bewaren van reageerbuizen 80x1,5 ml;
• Ruimte voor het voorbereiden van het reactiemengsel: beschermende kamer PCR-box ("Laminar-C. 110 cm); centrifuge "Vortex"; pipetten met variabel volume van de serie "Proline"; pipettenrek; werkstationrek 200x0,2 ml; rekken voor het bewaren van reageerbuisjes 80x1,5 ml; koelkast met een temperatuurbereik van -20 ^° C tot +10 ^° C;
• Elektroforeseruimte: horizontale elektroforesekamer; stroombron; transilluminator;
• DNA-versterker of nucleïnezuuranalysator (real-time PCR) met computer en software; kan in elke beschikbare ruimte worden geplaatst. Bij gebruik van real-time PCR-technologie is een elektroforeseruimte niet nodig.

[ 81 ], [ 82 ], [ 83 ], [ 84 ]

Externe kwaliteitscontrole

Om objectief betrouwbare resultaten te kunnen garanderen, moeten laboratoria deelnemen aan een systeem van externe beoordeling van de kwaliteit van laboratoriumonderzoek.

Deelnemers aan het kwaliteitscontrolesysteem ontvangen: 12 ampullen met gelyofiliseerde suspensies van bacteriële cellen, waarvan er twee E. coli bevatten, 3 ampullen met tuberculosemycobacteriën (avirulente stam) in een concentratie van 10 ² /ml; 3 ampullen met cellen van een vergelijkbare stam in een concentratie van 10 ⁴ /ml; 2 ampullen met elk niet-tuberculeuze mycobacteriën M. avium-intracellulare en M. kansasii in een concentratie van 10 ⁵ /ml.

De testen die voor externe kwaliteitsbeoordeling worden opgestuurd, worden vooraf getest in twee onafhankelijke laboratoria met ruime ervaring op dit gebied.

[ 85 ], [ 86 ]