Laboratoriumdiagnose van tuberculose

Tuberculose is een ziekte die gemakkelijk te diagnosticeren is in moderne omstandigheden en wetenschappelijke prestaties. Laboratoriumdiagnostiek van tuberculose staat centraal in andere diagnostische methoden, de tweede alleen voor röntgenonderzoeksmethoden.

[1], [2], [3], [4],

Klinische bloedtest

Bij patiënten met tuberculose zijn veranderingen in de algemene analyse van bloed niet pathognomonisch. Bij beperkte en inactieve vormen van tuberculose is de erytrocyt hypochroom in normale hoeveelheid. Wanneer massieve infiltraten of kaasachtige longontsteking, terwijl de prevalentie van kaasachtige lymfadenitis, specifieke intestinale letsels, evenals voor grote long- of postoperatieve bloeden en nota erythropenia microcytosis, oligohromaziyu, polihromaziyu. Macrocytose en met name poikilotsitoz komen veel minder vaak voor, meestal met ernstige bloedarmoede. Aantal reticulocyten in stap tuberculosis gecompenseerd varieert van 0,1 tot 0,6%, met subcompensated - 0,6-1,0% en 1% wordt gekenmerkt door gedecompenseerde reticulocyten.

Door destructieve en progressieve longtuberculose - bij tuberculose in sommige gevallen kan er een matige leukocytose (. Tot 15.000 van leukocyten), minder straling, die optreden bij 2-7% van de patiënten met een beperkte en gemakkelijk proces voorkomende vormen en 12,5% bedragen .

De meest voorkomende verschuivingen komen voor in de leukocytenformule. Markeer zowel relatieve als absolute neutrofilie, een gematigde verschuiving van de leukocytenformule naar links vóór promyelocyten. Myelocyten zijn zeer zeldzaam in het geval van ongecompliceerde tuberculose. Een toename van het aantal neutrofielen met pathologische granulariteit in het hemogram van een patiënt met tuberculose geeft altijd de duur van het proces aan: bij patiënten met ernstige tuberculose bevatten vrijwel alle neutrofielen pathologische granulariteit. Wanneer de uitbraak van tuberculose stopt, benadert de nucleaire verschuiving relatief snel normaal. De pathologische granulariteit van neutrofielen blijft meestal langer bestaan dan andere veranderingen in het hemogram.

Het gehalte aan eosinofielen in het perifere bloed varieert ook afhankelijk van de fase van het proces en de allergische toestand van het organisme. Dit aantal af totdat aneozinofiliya ernstige en langdurige ziekte-uitbraak en, omgekeerd, toeneemt wanneer de resorptie infiltreert en pleurale effusie, evenals vroege vormen van primaire tuberculose.

De meeste vormen van primaire tuberculose gaan gepaard met lymfopenie, die soms een aantal jaren wordt waargenomen, zelfs na het litteken van specifieke veranderingen. Secundaire tuberculose in de fase van exacerbatie, afhankelijk van de ernst van het proces, kan gepaard gaan met een normaal aantal lymfocyten of lymfopenie.

Het neemt een bijzondere plaats bepalen bezinking Aanvullende proeven met tuberculeuze proces (ESR) met een waarde beoordeling van de stroom tuberculose proces identificeren zijn actieve vorm te kunnen bepalen. ESR verhoging van de aanwezigheid van het ziekteproces (infectueuze inflammatoire, etterige septische, hemoblastose, Hodgkin et al.) En is indicatief voor de ernst, maar normale niveaus ESR niet altijd op het ontbreken van pathologie. Versnelling van erytrocietsedimentatie bijdragen aan een verhoging van de bloedspiegels van globulinen, fibrinogeen, cholesterol, en de viscositeit van het bloed te verlagen. Vertraging van sedimentatie van erytrocyten is kenmerkend voor toestanden die gepaard gaan met hemoconcentratie, een toename van het gehalte aan albuminen en galzuren.

Het hemogram bij patiënten met tuberculose verandert tijdens de behandeling. Hematologische verschuivingen verdwijnen sneller, hoe succesvoller de therapeutische interventie. Men moet echter rekening houden met het effect op de hemopoëse van verschillende antibacteriële geneesmiddelen. Ze veroorzaken vaak eosinofilie, in sommige gevallen - leukocytose, en vaker leukopenie tot aan agranulocytose en lymfoïde-reticulaire reactie. Systematische hematologische controle en correcte analyse van de verkregen gegevens zijn essentieel voor het beoordelen van de klinische toestand van de patiënt, de dynamiek van het proces en de effectiviteit van de gebruikte behandeling.

[5], [6], [7], [8], [9],

Klinische analyse van urine

Met tuberculose van het urinestelsel is urinalyse de belangrijkste diagnostische methode voor het laboratorium. U kunt leukocyturie, erythrocyturie, proteïnurie, hypoisostenurie, tuberculose, mycobacterium, niet-specifieke bacteriurie waarnemen.

Leukocyturie is het meest voorkomende symptoom van tuberculose van het urinewegstelsel voordat specifieke chemotherapie wordt uitgevoerd en is alleen afwezig in uitzonderlijke gevallen, bijvoorbeeld met volledige vernietiging van het ureterlumen. Nechyporenko testen (bepaling van het aantal leukocyten in 1 ml urine) helpt om meer objectieve beoordeling van de mate leukocyturia nefrotuberkuloze met, en in sommige gevallen te identificeren normale urine. Er moet echter rekening mee worden gehouden dat leukocyturie kan voorkomen bij acute en chronische pyelonefritis, cystitis, urethritis, nier- en ureterstenen.

Eritrotsiturii. Evenals leukocyturie. Worden beschouwd als een van de meest voorkomende symptomen van tuberculose in het urogenitale systeem. De frequentie van hematurie hangt af van de prevalentie van het proces, het neemt toe naarmate het destructieve tuberculoseproces zich ontwikkelt in de nier. Erythrocyturie zonder leukocyturie is meer typerend voor vroege stadia van niertuberculose. Hematurie, die de boventoon voert over leukocyturie, is een belangrijk argument ten gunste van niertuberculose in zijn differentiatie met niet-specifieke pyelonefritis.

[10], [11], [12], [13], [14], [15], [16],

Biochemische bloedtest

Met tuberculose zijn veranderingen in sommige biochemische parameters in de eerste plaats afhankelijk van de fase van het proces, complicaties en verschillende bijkomende ziekten. Bij patiënten met inactieve tuberculose van de longen en andere organen zijn de totale eiwit- en eiwitfracties van bloedserum onveranderd en bepalen ze hun normale gehalte.

In acute vormen van de ziekte, evenals met exacerbatie en progressie van chronische vormen van tuberculose, daalt de albumine-globuline-coëfficiënt.

Essentieel in de beoordeling de bedrijfstoestand van biologische schade en lever tuberculose en zijn complicaties is de bepaling van serum totaal en direct bilirubine, AST (ACT), alanine aminotransferase (ALT). Dynamische bepaling van het niveau van aminotransferasen. Bilirubine bij de behandeling van tuberculosepatiënten, vooral in ernstige vormen, is een verplicht onderdeel van een biochemisch onderzoek van tuberculosepatiënten en wordt maandelijks uitgevoerd.

Beoordeling van de functionele toestand van de nieren omvat de bepaling van serumcreatinine en de berekening van de glomerulaire filtratiesnelheid volgens de Cockcroft-Gault-formule. Berekening van de glomerulaire filtratiesnelheid met Reberg's monster geeft minder nauwkeurige resultaten.

Het hoofddoel van dynamische biochemische studies van tuberculosepatiënten is het volgen van het verloop van het proces, het tijdig detecteren van de bijwerking van geneesmiddelen en het adequaat corrigeren van de ontstane homeostatische aandoeningen.

[17], [18], [19]

Toepassing van biochemische onderzoeksmethoden bij extrapulmonale tuberculose

De meest informatieve indicator is het gehalte aan tuberculo-stearinezuur in biologische vloeistoffen, maar de definitie ervan gaat gepaard met technische problemen (de behoefte aan gaschromatografie en massaspectrometrie).

Prospectieve meting van de activiteit van adenosine-deaminase - een enzym, bepaald in vloeistoffen: synoviaal, pericardiaal, ascitisch of spinaal. De belangrijkste producenten van adenosine-deaminase zijn lymfocyten en monocyten. Bepaling van de activiteit van adenosine-deaminase in biologische vloeistoffen vergemakkelijkt de diagnose van tuberculose synovitis, tuberculose van lymfeknopen, tuberculose meningitis, tuberculosis serositis.

Sommige biochemische indicatoren vanwege hun niet-specificiteit worden alleen bepaald in biologische vloeistoffen, dichtbij de laesie focus. Meet het niveau van indicatoren als reactie op subcutane of intradermale injectie van tuberculine (meestal vóór en 48 en 72 uur erna). Hierna wordt de mate van toename van het markerniveau (in%) berekend met betrekking tot het beginniveau.

Optimale bepaling in de urine van de activiteit van een orgaanspecifiek enzym van transamnidase, waarvan het uiterlijk wordt waargenomen bij het verslaan van nieren van verschillende aard. De studie van transamidinase is alleen gerechtvaardigd onder omstandigheden van subcutane injectie van tuberculine om het lokale ontstekingsproces te verergeren. Bepaal eerst de activiteit van transamidine in de urine en 24-72 uur na de introductie van 50 TE-tuberculine. Uitbreiding van de fermentatie in 2 maal en meer maakt het in 82% van de gevallen mogelijk om actieve tuberculose van de nieren te onderscheiden van exacerbatie van chronische pyelonefritis.

Met tuberculose van vrouwelijke geslachtsorganen worden concentraties van haptoglobine en malon-dialdehyde in het bloed bepaald in omstandigheden van een provocerende tuberculinatie-test. Subcutaan geïnjecteerd tuberculine in een dosis van 50 TE en 72 uur later voerde een tweede biochemisch onderzoek uit. In het geval van tuberculose-etiologie is de mate van verhoging van het niveau van haptoglobine niet minder dan 28%, en het niveau van malondialdehyde is 39% of meer. De bepaling van de activiteit van adenosinedeaminase in een peritoneale vloeistof verkregen uit de Douglas-ruimte wordt ook gebruikt. De punctaat wordt opnieuw onderzocht 72 uur na de intradermale injectie van tuberculine in doses van 0,1 TE en 0,01 TE in de projectie van de interne geslachtsorganen op de voorste buikwand. In het voordeel van het tuberculoseproces is een toename van de activiteit van adenosine-deaminase 10% of meer in vergelijking met de eerste.

Wanneer het oog wordt beïnvloed, wordt de focale reactie die optreedt in het oog als reactie op antigene stimulatie onderzocht. Het is onwenselijk om een uitgesproken reactie te ontwikkelen, vergezeld van een afname van de visuele functies. Aangezien de beoordeling van minimale focale reacties vaak moeilijk is, wordt voor de objectivering van de conclusie aanbevolen om zich parallel te oriënteren en op de graad van groei in het bloedserum van haptoglobine of adenosine-deaminase.

Alle biochemische studies moeten in combinatie met andere methoden worden uitgevoerd.

[20], [21], [22], [23],

Bloedstolling systeem onderzoek

Relevantie van het onderzoek status van het bloedstolling systeem van TB wordt veroorzaakt door de aanwezigheid van een aantal patiënten met longtuberculose hemoptysis of pulmonaire hemorragie, alsmede hemocoagulation complicaties bij de chirurgische behandeling van tuberculose. Bovendien beïnvloedt de latente stroom van intravasculaire hemocoagulatie die natuurlijk samengaat met tuberculose het verloop van de ziekte en de effectiviteit van chemotherapie.

Bij patiënten met pulmonale TB prevalentie van exsudatieve ontsteking component van de geconstateerde daling van het bloed antistolling activiteit. Bij patiënten met een lage prevalentie van een specifieke laesie in de long met een overwicht van productieve hemocoagulation intravasculaire ontstekingscomponent licht uitgedrukt. Bij patiënten met longtuberculose met bloedspuwing en pulmonaire hemorragie staat bloedstolling is anders: bij patiënten met lage bloedverlies ter hoogte gemoptoe of onmiddellijk na beëindiging daarvan is er een sterke toename van bloedstolling vermogen als gevolg van ernstige intensivering van trombinoobrazovaniya behoud toegenomen "structurele" stolling. Bij patiënten met massaal bloedverlies waargenomen daling stollingseigenschappen ten koste van het verlagen van de concentratie van fibrinogeen. Factor XIII-activiteit, aantal bloedplaatjes. In het stadium van chirurgische behandeling bij patiënten met een beperkt assortiment longtuberculose met relevante overtreding systeem homeostase optreedt. Patiënten met een wijdverspreide proces in de uitvoering van pnevmon- of plevropnevmonektomii ontwikkelen vaak DIC, die de vorm van de te nemen "second ziekte."

De stand van bloedstolling bij patiënten monitor met longtuberculose bepaling van de geactiveerde partiële tromboplastinetijd (aPTT), fibrinogeen, trombine tijd protrombine index en bloedingstijd en stolling tijd worden uitgevoerd.

[24], [25], [26], [27], [28]

Hormonaal onderzoek

Moderne experimentele en klinische observaties wijzen op de aanwezigheid van veranderingen in de hormonale status in een specifieke tuberculeuze longontsteking. Het is bewezen dat de correctie van dysfunctie van de hypofyse-bijnier, hypofyse-schildklier systemen en alvleesklierfunctie in combinatie met de anti-TB-therapie bij tot activering van fibrogenese en reparatie bij een specifieke locus ontsteking.

De bedrijfstoestand van de hypofyse-schildklier wordt beoordeeld door de inhoud in het bloedserum van trijoodthyronine (T ₃ ), thyroxine (T ₄ ), hypofyse schildklier stimulerend hormoon (TSH). Er is vastgesteld dat subklinische hypothyreoïdie wordt gedetecteerd bij 38-45% van de patiënten met pulmonale tuberculose en meestal wordt gediagnosticeerd met verspreide en fibreus-caverneuze vormen van het proces. Onder deze zelfde vormen meest dramatisch verlaagde niveaus van zowel T ₃ en T ₄, en komt er een onbalans van deze hormonen in de vorm van verhoging van de verhouding T ₄ / T _s.

Bijnierschorsfunctie geëvalueerd door het niveau van cortisol in het bloedserum en endocriene functie van de pancreas - concentratie van de immuno-reactieve insuline. In de acute fase van de infectieziekte neemt de behoefte aan endogene cortisol en insuline toe. Hyperinsulinemie getuigt ook van de insulineresistentie van lichaamsweefsels, wat kenmerkend is voor elk actief ontstekingsproces, in het bijzonder specifiek. Bepaling van de glucocorticoïdfunctie van de bijnieren met actieve longtuberculose maakt het mogelijk de aanwezigheid van hypercorticisme bij de meerderheid van de patiënten te onthullen. Normale niveaus van cortisol bloedconcentratie in de patiënt met infectieuze ontsteking in de acute periode moet worden beschouwd als relatieve mislukking van glucocorticoïde functie van de bijnierschors dat als basis voor het houden van doses adequate vervangende therapie van glucocorticoïden kan dienen.

Bijna een derde van de patiënten met pulmonale tuberculose kan vaststellen dat het niveau van insulinemie in hen vrij laag is en de onderste limiet van de norm benadert, terwijl 13-20% significant hyperinsulinisme waarneemt. Zowel relatieve hypo- als hyperinsulinisme zijn risicovolle factoren voor de ontwikkeling van schendingen van het koolhydraatmetabolisme in verschillende mate. Deze veranderingen in de functionele activiteit van B-cellen van de pancreas vereisen regelmatige monitoring van glycemie bij patiënten met tuberculose en tijdige preventie van diabetes mellitus. Bovendien. Dit dient als een aanvullende rechtvaardiging voor het nut van het gebruik van fysiologische doses insuline in de complexe therapie van tuberculose.

Doorgaans lagere niveaus van schildklierhormonen en de onbalans hypercortisolemie en hyperinsulinisme grootste bereik bij patiënten met ernstige tijdens tuberculeuze proces met grote schade longen en ernstige symptomen van tuberculose intoxicatie.

Microbiologische diagnose van tuberculose

Microbiologische studies zijn nodig bij het identificeren van patiënten met tuberculose, het verifiëren van de diagnose, het monitoren en corrigeren van chemotherapie, het evalueren van behandelresultaten, met andere woorden, vanaf het moment dat de patiënt is geregistreerd met tuberculose voordat het wordt uitgevoerd.

Alle epidemiologische programma's en projecten zijn gebaseerd op een beoordeling van het aantal bacteriële excretoren, wat niet mogelijk is zonder laboratoriummethoden te gebruiken om mycobacteria tuberculosis te detecteren. In een onderzoek onder de zogenaamde niet-georganiseerde populatie bereikt het percentage bacteriële indringers 70 of meer, waardoor laboratoriummethoden een voldoende effectief middel zijn om tuberculosepatiënten onder deze bevolkingsgroep te identificeren.

Traditionele microbiologische methoden voor het diagnosticeren van tuberculose zijn bacterioscopische en culturele studies. Moderne methoden houden rekening met de teelt van mycobacterium tuberculosis in geautomatiseerde systemen, het instellen van PCR. Al deze methoden combineren echter noodzakelijkerwijs met klassieke bacteriologische methoden.

Verzameling van diagnostisch materiaal

De effectiviteit van laboratoriumonderzoeken is in grote mate afhankelijk van de kwaliteit van het diagnostische materiaal. Naleving van de regels voor het verzamelen, opslaan en transporteren van diagnostisch materiaal en de exacte implementatie van het patiëntbeoordelingsalgoritme beïnvloedt rechtstreeks de uitkomst en zorgt voor biologische veiligheid.

Voor het testen op tuberculose worden verschillende materialen gebruikt. Vanwege het feit dat TB logkih- meest voorkomende vorm tuberculeuze laesies, het basismateriaal voor onderzoek interessant sputum en andere losmaakbare tracheobronchiale: bovenste luchtwegen secreties verkregen na aërosolinhalatie: bronchiale spoelingen; bronchoalveolaire spoelingen; materiaal verkregen door bronchoscopie en intrapulmonaire transtracheale biopten van bronchiale aspiraten, laryngeale uitstrijkjes, uitscheidingen wonden en uitstrijkjes al.

De effectiviteit van onderzoek neemt toe als een gecontroleerde verzameling materiaal van een patiënt wordt uitgevoerd. Voor dit doel wordt een speciaal uitgeruste kamer toegewezen of speciale cabines gekocht. Het verzamelen van materiaal is een gevaarlijke procedure, daarom is het noodzakelijk om materiaal te verzamelen voor onderzoek, waarbij de regels van infectieuze veiligheid in acht worden genomen.

Het testmateriaal op mycobacterium tuberculosis wordt verzameld in steriele flessen met strak geschroefde doppen om besmetting van de omgeving te voorkomen en het verzamelde materiaal te beschermen tegen verontreiniging.

Flesjes voor het verzamelen van diagnostisch materiaal moeten aan de volgende vereisten voldoen:

• moet gemaakt zijn van slagvast materiaal;
• zou gemakkelijk moeten smelten tijdens het autoclaveren;
• voldoende volume hebben (40-50 ml):
• hebben een brede opening voor sputumcollectie (diameter niet minder dan 30 mm);
• gemakkelijk te hanteren, transparant of doorschijnend zijn, zodat u de hoeveelheid en kwaliteit van het verzamelde monster kunt beoordelen zonder het deksel te openen.

Voor optimale onderzoeksresultaten moeten de volgende voorwaarden in acht worden genomen:

• Verzamel het materiaal vóór het begin van de chemotherapie;
• materiaal voor het onderzoek moet worden verzameld vóór de ochtendopname van voedsel en medicijnen;
• voor onderzoek is het wenselijk om ten minste 3 monsters van slijm in de ochtend te verzamelen. Verzamel sputum gedurende 3 opeenvolgende dagen;
• het verzamelde materiaal moet zo snel mogelijk in het laboratorium worden afgeleverd:
• in het geval dat het materiaal onmiddellijk aan het laboratorium kan worden afgeleverd, wordt het in de koelkast bewaard bij een luchttemperatuur van 4 ° C gedurende niet meer dan 48 uur;
• Bij het transport van het materiaal is het noodzakelijk om de integriteit van de injectieflacons nauwlettend te volgen.

Correct verzameld sputum is slijm of mucopurulent. Het optimale volume van het geteste sputum is 3-5 ml.

Sputum wordt verzameld onder toezicht van een medische professional. Personen die verantwoordelijk zijn voor het verzamelen van sputum, moeten de implementatie van bepaalde regels volgen:

• het is noodzakelijk de patiënt uit te leggen wat het doel van de studie is en de noodzaak om geen speeksel of nasofaryngeale mucus op te hoesten, maar de inhoud van de diepe luchtwegen. Dit kan worden bereikt als gevolg van een productieve hoest die optreedt na verschillende keren (2-3) diep ademhalen. Het is ook noodzakelijk om de patiënt te waarschuwen dat hij zijn mond moet spoelen met gekookt water, om het grootste deel van de microflora-groei in de mondholte en voedselresten die het onderzoek van sputum verhinderen, te verwijderen;
• een medische werker die deelneemt aan de sputumcollectie, moet naast een badjas en een hoed een masker, rubberen handschoenen en een rubberen schort dragen;
• achter de patiënt staat, wordt hem aangeraden de fles zo dicht mogelijk bij zijn lippen te houden en onmiddellijk slijm te scheiden wanneer hij hoest, en er moet voor worden gezorgd dat de luchtstroom wordt weggestuurd van de gezondheidswerker:
• Na afronding van de sputumcollectie moet de gezondheidswerker de injectieflacon zorgvuldig afsluiten met een deksel en de hoeveelheid en kwaliteit van het verzamelde sputum beoordelen. Vervolgens wordt de fles geëtiketteerd en in een speciale bix geplaatst voor transport naar het laboratorium.

Als de patiënt niet slijm, de nacht produceert voor en vroeg in de ochtend op de dag van de winning van het materiaal dat nodig hem een slijmoplossend :. Een extract van de wortels van marshmallow (mukaltin), bromhexine, ambroxol, enz. Te geven - of toe te passen een irritante inhalatie met behulp van apparatuur geïnstalleerd in de kamer te verzamelen sputum. Het op deze manier verzamelde materiaal is niet onderhevig aan conservering en moet op de dag van verzameling worden onderzocht. Om te voorkomen dat het "ruimen" in het laboratorium in de richting een speciaal merkteken moet maken.

Als in deze faciliteit geen microbiologische onderzoeken worden uitgevoerd, moet het verzamelde diagnostische materiaal centraal in het laboratorium worden afgeleverd, op voorwaarde dat het materiaal in de intervallen tussen leveringen in de koelkast of met conserveringsmiddelen wordt bewaard. Lever materiaal aan het laboratorium in transportdozen, die gemakkelijk kunnen worden gedesinfecteerd. Elk monster moet worden voorzien van het juiste etiket en de hele partij moet worden gevuld met een begeleidend formulier.

[29], [30], [31],

Wijze en frequentie van onderzoek van patiënten

Bij het initiële, zogenoemde diagnostische, onderzoek van de patiënt naar tuberculose, is het noodzakelijk om ten minste 3 sputumgedeelten gedurende 2 of 3 dagen te onderzoeken. Verzameld onder toezicht van medisch personeel, wat de effectiviteit van microscopie verhoogt.

De primaire screening op tuberculose moet worden uitgevoerd door alle medisch-diagnostische instellingen van het gezondheidszorgsysteem. Onlangs zijn zogenaamde centra van microscopie, uitgerust met moderne microscopen en apparatuur voor epidemische veiligheid, georganiseerd op basis van klinische diagnostische laboratoria om de efficiëntie van het eerste onderzoek te verbeteren.

Bij voorzieningen tegen tuberculose wordt een screeningtest gebruikt die sputumonderzoek of ander diagnostisch materiaal omvat gedurende ten minste 3-voudige gedurende 3 dagen. Tijdens de behandeling worden microbiologische onderzoeken regelmatig minstens één keer per maand uitgevoerd tijdens de intensieve chemotherapiefase. Bij de overgang naar de fase van de behandeling worden minder vaak onderzoeken uitgevoerd - met een interval van 2-3 maanden, terwijl de frequentie van het onderzoek wordt teruggebracht tot twee.

Kenmerken van de verzameling diagnostisch materiaal voor extrapulmonale tuberculose

Feature pathologisch materiaal extrapulmonale vormen van TB - Mycobacterium tuberculosis lage concentratie daarin, waarbij een gevoeliger methoden voor microbiologische studies vereist, vooral enten technieken medium.

Met tuberculose van het urogenitale systeem is urine het meest toegankelijke studiemateriaal. De urine moet worden verzameld door een speciaal opgeleide verpleegster.

De uitwendige genitaliën worden gewassen met water met zeep of een zwakke oplossing van kaliumpermanganaat. De uitwendige opening van de urethra wordt zorgvuldig behandeld. In een steriele flacon wordt een gemiddeld deel van de ochtendurine verzameld: bij mannen, van nature bij vrouwen, met behulp van een katheter. Urine uit het nierbekken wordt verzameld in steriele buizen met catheterisatie van één of twee nieren, in het laatste geval - noodzakelijkerwijs gescheiden van elke nier. Een kleine hoeveelheid van deze urine wordt gecentrifugeerd, het sediment wordt onderzocht.

Bij mannen, sperma, punctaattestes, wordt het geheim van de prostaat gecentrifugeerd om een neerslag te verkrijgen. Met elke lokalisatie van een specifiek proces in het genitale gebied bij mannen, kan prostaatmassage de secretie bevorderen van secreties die mycobacterium tuberculosis bevatten.

Menstruatiebloed bij vrouwen wordt verzameld door te zuigen of een Kafka-dop te gebruiken. Het verkregen materiaal wordt bevrijd van rode bloedcellen, gewassen met gedestilleerd water gevolgd door centrifugatie. Het precipitaat wordt onderzocht.

Toewijzingen uit het baarmoederhalskanaal van de baarmoeder worden verzameld in een of andere Kafka-capaciteit of dop, dat wil zeggen dat het wenselijk is om 1-2 ml pathologisch materiaal te accumuleren.

Materiaal verkregen door operatieve ingrepen aan de nieren, geslachtsorganen. Met biopsieën, schaafwonden uit het endometrium, homogeniseren. Om dit te doen, wordt het in een steriele mortel geplaatst en grondig geplet met een steriele schaar. Aan deze suspensie werd steriel rivierzand toegevoegd in een hoeveelheid gelijk aan het gewicht, en daarna gevuld met 0,5-1.0 ml isotone natriumchlorideoplossing, en alles werd getritureerd tot een pasteuze massa onder toevoeging van isotone natriumchlorideoplossing (4-5 ml). Vervolgens laat men de massa gedurende 1-1,5 minuten neerslaan, het supernatant wordt onderzocht.

Tuberculose van botten en gewrichten. Het punctaat (pus van abcessen) verkregen met een steriele spuit wordt in steriele schalen geplaatst en onmiddellijk in het laboratorium afgeleverd. Steriele pipet, vooraf bevochtigd met een steriele isotone natriumchlorideoplossing, neem 2-5 ml pus, breng het over in een flesje parels en voeg nog eens 2-3 ml isotone natriumchlorideoplossing toe. De fles wordt gesloten met een kurk en geschud in een jokertoestel gedurende 8-10 minuten. De gehomogeniseerde suspensie wordt onderzocht.

Bij vuistige vormen van osteo-articulaire tuberculose wordt pus uit de fistel genomen. De overvloedige ontlading wordt direct in een reageerbuis verzameld. In gevallen van schrale uitscheiding van pus, wordt de fistel gewassen met een steriele isotone natriumchloride-oplossing, en het waswater verzameld in een reageerbuisje of een stuk van een tampon geïmpregneerd met pus wordt naar het onderzoek gestuurd.

Chirurgisch materiaal verkregen tijdens operaties aan botten en gewrichten kunnen bestaan uit purulente-necrotische massa's, granulaten, litteken, botweefsel synoviale membranen en andere substraten. De behandeling wordt uitgevoerd, zoals bij tuberculose van de nieren.

Microbiologisch onderzoek van synoviale vloeistof in 3% natriumcitraatoplossing (verhouding 1: 1) om stolling te voorkomen, wordt onmiddellijk na de punctie uitgevoerd.

Tuberculose van de lymfeklieren. De pus, geëxtraheerd tijdens de punctie van de lymfeklieren, wordt ook onderzocht. Als pus van de abcessen. De weefsels van de lymfeklieren verkregen tijdens chirurgische ingrepen, biopsieën, worden onderzocht, net als bij andere vormen van tuberculose.

De studie van ontlastingmassa's op mycobacterium tuberculosis is uiterst zeldzaam, vanwege het bijna totale gebrek aan positieve resultaten.

[32], [33], [34], [35], [36],

Mycobacterium microscopie

Sputum-microscopie is een relatief snelle, eenvoudige en goedkope methode die moet worden gebruikt in alle gevallen met vermoedelijke tuberculose. Bovendien wordt deze studie uitgevoerd om de effectiviteit van chemotherapie te evalueren en om het herstel of falen van de behandeling vast te stellen als er geen kweektest is.

Er worden twee methoden voor microscopisch onderzoek gebruikt:

• methode van directe microscopie, wanneer een uitstrijk rechtstreeks wordt bereid uit het diagnostische materiaal;
• microscopiemethode van een sediment dat is bereid uit met ontsmettingsmiddel behandeld materiaal voor kweek.

De eerste methode wordt gebruikt in die laboratoria waar alleen microscopisch onderzoek wordt uitgevoerd (klinische en diagnostische laboratoria van het algemeen medisch netwerk).

De beste resultaten van microscopisch onderzoek worden verkregen door het diagnostische materiaal te concentreren (bijvoorbeeld door centrifugatie).

Om mycobacterium tuberculosis te detecteren met een waarschijnlijkheid van 50% bij het uitvoeren van de microscopie, moet 1 ml sputum meer dan 5000 microbiële cellen bevatten. Het sputum van patiënten met pulmonaire vormen van tuberculose bevat meestal een aanzienlijke hoeveelheid zuurvaste bacteriën, waardoor ze op betrouwbare wijze kunnen worden gedetecteerd door bacterioscopie. De diagnostische gevoeligheid van deze methode kan worden verbeterd door verschillende sputummonsters van één patiënt te onderzoeken. Een negatief resultaat van een bacterioscopisch onderzoek sluit de diagnose van tuberculose niet uit, omdat het sputum van sommige patiënten minder mycobacteriën bevat dan met microscopie kan worden gedetecteerd. Slechte voorbereiding van sputumuitstrijkje kan ook een negatief resultaat van een bacterioscopisch onderzoek veroorzaken.

De meest gebruikelijke methode voor de detectie van zuurvaste mycobacteriën in het uitstrijkje is kleur volgens Tsiol-Nelsen. De methode is gebaseerd op de penetratie van carbol fuchsine in een microbiële cel door een membraan dat een wasachtige lipidelaag omvat, terwijl tegelijkertijd verhitting en sterke etswerking van fenol plaatsvindt. Daaropvolgende verkleuring van het uitstrijkje met een 25% oplossing van zwavelzuur of 3% zoutzuur leidt tot een verkleuring van alle niet-zuurvaste structuren. De verkleurde elementen van het uitstrijkje worden gekleurd met een 0,3% oplossing van methyleenblauw. Mycobacteriën nemen de gebruikelijke anilinekleurstoffen niet waar, waardoor zuurvaste mycobacteriën karmozijnrood en andere microben en cellulaire elementen worden gekleurd - in blauw.

Om de uitstrijkjes bestudeerd door Tsilyu-Nelsen te bestuderen, gebruikt u een lichte binoculaire microscoop met een immersieobjectief (90- of 100-voudige vergroting) en een oculair met een 7- of 10-voudige vergroting. Verken 100 gezichtsveldgebieden, wat voldoende is om afzonderlijke mycobacteriën in het uitstrijkje te identificeren. In het geval dat het resultaat van een dergelijk onderzoek negatief is, wordt ter bevestiging aanbevolen om nog eens 200 gezichtsvelden te bekijken. Noteer de resultaten, met vermelding van het aantal gedetecteerde zuurvaste bacillen (KUM).

Naast deze techniek worden kleuren fluorochromen gebruikt voor luminescentiemicroscopie, waardoor de beste resultaten worden bereikt. Het gebruik van deze methode verhoogt de efficiëntie van microscopie met 10-15%. Bij de behandeling van mycobacteriën met luminescente kleurstoffen (auramine, rhodamine, enz.) Binden deze stoffen zich ook aan de wasachtige structuren van de microbiële cel. Bij het bestralen van gekleurde cellen met een opwindende lichtbron (een bepaald spectrum van ultraviolette straling) beginnen ze te gloeien met oranje of fel rood licht op een zwarte of donkergroene achtergrond. Door de hoge helderheid en het contrast van het zichtbare beeld kan de algehele vergroting van de microscoop 4-10 keer worden verkleind, het gezichtsveld wordt breder en de kijktijd van het preparaat neemt af. Samen met dit, als gevolg van de veel grotere scherptediepte, kunt u het comfort van het onderzoek vergroten.

Wanneer fluorescentiemicroscopie wordt gebruikt om hetzelfde gebied te scannen, verbruikt het uitstrijkje aanzienlijk minder tijd dan lichtmicroscopie van de Tsiol-Nelsen-kleuring. Als een microscoop gedurende een werkdag ongeveer 20-25 dergelijke uitstrijkjes onderzoekt, dan kan hij met behulp van fluorescentiemicroscopie meer dan 60-80 monsters tegelijkertijd onderzoeken. Ervaren microscopisten weten dat de verkleuring van cellen met een mengsel van auramine en rhodamine op de een of andere manier specifiek is voor zuurvaste bacillen, die in dit geval eruitzien als gouden staafjes. Saprofyten zijn geschilderd in een groenachtige kleur.

Een ander belangrijk voordeel van de methode van fluorescentie microscopie - het vermogen om veranderde mycobacterium detecteren, verloor onder invloed van ongunstige factoren, waaronder de intensieve chemotherapie, kislotousotoychivosti eigendom en wordt niet gedetecteerd in verband met deze kleuring Ziehl-Nelsenu.

De nadelen van de methode van fluorescentiemicroscopie omvatten de relatief hoge kosten van de microscoop en de werking ervan. In gecentraliseerde of andere grote laboratoria, waar de belasting hoger is dan de norm van 3 laboratoriumtechnici die werken met drie conventionele microscopen, is het echter goedkoper om in plaats daarvan één fluorescentiemicroscoop te gebruiken.

Bacterioscopische methoden hebben een vrij hoge specificiteit (89-100%). Ongeveer 97% van de positieve resultaten verkregen met elke microscopiemethode worden ondubbelzinnig bevestigd door de resultaten van het zaaien.

Opgemerkt moet worden dat bij microscopisch onderzoek van het uitstrijkje van pathologisch materiaal het onmogelijk is om de soort te bepalen die behoort tot de geïdentificeerde zuurvaste mycobacteriën. Microscopie methode maakt het mogelijk een uitspraak te doen alleen de aanwezigheid of afwezigheid van zuur bij de bereiding van micro-organismen, wat kan worden verklaard door het bestaan van de aard van een groot aantal morfologisch vergelijkbaar met tuberculeuze mycobacteriën complexe nontubercular zuurbestendige organismen.

De resultaten van microscopie worden geëvalueerd in semikwantitatieve eenheden.

Om de resultaten van verschillende microscopiemethoden te kunnen vergelijken, worden empirische coëfficiënten geïntroduceerd. Bijvoorbeeld, de resultaten van uitstrijkjes gekleurd met fluorescente kleurstoffen vergelijken de dataresearch lichtmicroscoop (1000 maal vergroting), is het noodzakelijk om het aantal zuurvaste bacillen gedetecteerd door de fluorescentiemicroscoop verdelen, de corresponderende coëfficiënt bij 250-voudige vergroting - 10, 450-voudig - tot 4, met 630-voudig - tot 2.

Kenmerken van microscopie voor extrapulmonale tuberculose

Directe microscopie wordt uitgevoerd, evenals microscopie van uitstrijken bereid na verrijking, gevolgd door Tsiol-Nelsen kleuring of luminescerende kleurstoffen. Directe microscopie van uitstrijkjes is niet effectief vanwege een lage concentratie van mycobacteriën in het materiaal en daarom is het meer rationeel om verrijkingsmethoden te gebruiken. Het meest effectief is centrifugeren. Als het biologische materiaal viskeus is, wordt centrifugeren gebruikt bij gelijktijdige homogenisatie en vloeibaarmaking van het materiaal, dat wordt uitgevoerd met behulp van hogesnelheidcentrifuges met een centrifugatiekracht van 3000 g en hypochlorietoplossingen. Andere verrijkingsmethoden, zoals micro-flotatie, worden momenteel niet gebruikt vanwege de vorming van biologisch gevaarlijke aerosolen.

[37], [38],

De culturele methode voor de diagnose van tuberculose

De methode van zaaien of de kweekmethode is gevoeliger dan microscopie met uitstrijkjes en heeft een aantal voordelen ten opzichte van laatstgenoemde. Het maakt het mogelijk om tientallen levensvatbare mycobacteriën in het testmateriaal te detecteren en heeft een grote diagnostische waarde. Dit is vooral belangrijk bij het onderzoeken van een materiaal van pas gediagnosticeerde of behandelde patiënten die een kleine hoeveelheid mycobacteriën afgeven.

Vergeleken met microscopie maakt cultuuronderzoek het mogelijk het aantal tuberculosepatiënten met meer dan 15-25% te verhogen en tuberculose te verifiëren in eerdere stadia, wanneer de ziekte nog steeds vatbaar is voor behandeling. Een zeer belangrijk voordeel van de kweektest is de mogelijkheid om een excitercultuur te verkrijgen die kan worden geïdentificeerd en bestudeerd met betrekking tot geneesmiddelgevoeligheid, virulentie en andere biologische eigenschappen.

De nadelen van kweekmethoden zijn de duur (de wachttijd van materialen bereikt 10 weken). Hogere kosten, complexiteit van de verwerking van diagnostisch materiaal.

Beginselen van voorbehandeling van diagnostisch materiaal

Conventionele microbiologische methoden kunnen niet worden gebruikt bij studies naar tuberculose. Dit komt door het feit. Dat mycobacterium tuberculosis erg langzaam groeit, en de meeste klinische monsters bevatten snelgroeiende pyogene en verrotte micro-organismen, schimmels. Hun snelle groei op rijke voedingsmedia verstoort de ontwikkeling van mycobacteriën en maakt isolatie van de veroorzaker van tuberculose niet mogelijk, dus het diagnostische materiaal moet vóór het zaaien worden voorbehandeld. Bovendien zijn mycobacteriën die vrijkomen uit de luchtwegen van de patiënt meestal omgeven door een grote hoeveelheid slijm, waardoor het moeilijk is om zich te concentreren. In dit opzicht is, voordat het sputum en andere soortgelijke materialen worden geplant, vloeibaarmaking, decontaminatie noodzakelijk.

Alle detergenten en decontaminen hebben een meer of minder uitgesproken toxisch effect op mycobacteriën. Als gevolg van de verwerking kan tot 90% van de mycobacteriën afsterven. Om voldoende van de mycobacteriële bevolking houden, spaarde de noodzaak verwerkingstechnieken waarmee Gebruik enerzijds, aan de snel groeiende pyogene bacteriën en verrot onderdrukken, en anderzijds - om de levensvatbaarheid van mycobacteriën in het materiaal te bewaren.

Afhankelijk van het materiaal, de mate van homogeniteit en vervuiling voorbewerking toepassing van verschillende ontsmettingsmiddel: Sputum - 4% natronloog oplossing trohzameschonnogo natriumfosfaat 10%, benzalkoniumchloride, trinatriumfosfaat, NALC-NaOH (N-acetyl-L-cysteïne natriumhydroxide) bij een uiteindelijke concentratie van 1% NaOH in urine en andere vloeibare materialen - zwavelzuuroplossing 3%, van de verontreinigde monsters, vethoudende materialen - oplossing van oxaalzuur tot 5%. Bovendien worden in sommige gevallen enzymen, oppervlakteactieve stoffen (detergentia) gebruikt. Application Tween detergenten en een aantal andere mycobacteriële dood gaat gepaard met minder cellen (40-50% overleven). Ze kunnen echter alleen worden gebruikt voor vloeibare materialen. De grootste distributie ter wereld was NALC-NaOH. Geproduceerd in sets. Met deze methode kan meer dan 85% van de populatie mycobacteriële cellen worden verdeeld. Decontaminatie tkanesoderzhaschih vaste moeilijker te raden omdat de mate van dispersie van het materiaal tijdens homogenisering moeilijker. Zo wordt de behandeling biopten van lymfeknopen vaak gepaard met verhoogde frequentie van verontreiniging met vreemde flora. In dit geval kan 1% van etonium worden gebruikt.

Niet-homogeen materiaal wordt gehomogeniseerd met glasparels in de aanwezigheid van ontsmettingsmiddelen. De vloeibare materialen worden vooraf gecentrifugeerd en alleen een neerslag wordt behandeld.

Zaai- en incubatietechnieken

Na voorbehandeling wordt het materiaal gecentrifugeerd, waardoor de mycobacteriën neerslaan en het gehalte ervan in het sediment wordt verhoogd ("slibverrijking"). Het resulterende precipitaat wordt geneutraliseerd en geënt (geënt) met dichte voedingsmedia of buizen met vloeibare (halfvloeibare) media. Uit de rest van het sediment worden uitstrijkjes voorbereid voor microscopisch onderzoek. De zaaitechniek moet kruiscontaminatie van het diagnostische materiaal voorkomen.

Voor een betrouwbare klinische interpretatie van de resultaten van een microbiologisch onderzoek, moet de volgende regel in acht worden genomen: microscopisch onderzoek en cultuuronderzoek moeten parallel worden uitgevoerd vanuit hetzelfde monster van het diagnostische materiaal.

De geënte buizen worden 2 dagen bij 37 ^° C in een horizontale positie in een thermostaat geplaatst. Dit zorgt voor een meer gelijkmatige opname van het materiaal in het kweekmedium. Na 2 dagen worden de buizen overgebracht naar een verticale positie en hermetisch afgesloten met rubber of siliconen pluggen om uitdroging van de ingezaaide media te voorkomen.

Gewassen worden bij 37 ^ongeveer C gedurende 10-12 weken met een vaste wekelijkse bezichtiging. Voor elke preview worden de volgende parameters vastgelegd:

• de periode visueel waargenomen vanaf de dag van het zaaien groei;
• groeisnelheid (aantal CFU's);
• besmetting van het gewas door een externe microbiële flora of schimmels (dergelijke buizen worden verwijderd);
• gebrek aan zichtbare groei. De buizen blijven in de thermostaat totdat de volgende weergave.

Voedingsmedia

Verschillende voedingsmedia worden gebruikt voor het kweken van mycobacteriën; dicht, halfvloeibaar, vloeibaar. Geen van de bekende voedingsmedia heeft echter eigenschappen die zorgen voor de groei van alle mycobacteriële cellen. In verband hiermee worden 2-3 voedingsmedia met verschillende samenstelling aanbevolen om tegelijkertijd te worden gebruikt om de effectiviteit te vergroten.

De WHO beveelt de omgeving van Levenstein-Jensen aan als standaardmedium voor de primaire isolatie van de veroorzaker van tuberculose en voor het bepalen van de gevoeligheid van het geneesmiddel. Dit is een dichte ei-omgeving waarop de groei van mycobacteriën wordt verkregen op de 20e-25e dag na het bezaaien van een bacterioscopisch positief materiaal. Gewassen van bacterioscopisch negatief materiaal vereisen een langere incubatieperiode (tot 10-12 weken).

In ons land is de voorgestelde E.R. Finn-eierenomgeving Finn-II. Het verschilt daarin dat in plaats van L-asparagine, het natriumglutamaat gebruikt, dat andere manieren voor het synthetiseren van de aminozuren van mycobacteriën triggert. Groei verschijnt iets eerder op dit medium en de frequentie van toewijzing van mycobacteriën is 6-8% hoger dan in het Lowenstein-Jensen-medium.

Om de effectiviteit van bacteriologische diagnostiek van extrapulmonale tuberculose te verbeteren, is het raadzaam gemodificeerde Finn-II-media in het complex van voedingsmedia op te nemen. Om de groei te versnellen, wordt een natriumthioglycolaat van 0,05%, dat de zuurstofconcentratie verlaagt, toegevoegd aan het Finn-II-voedingsmedium. Om de enzymsystemen van mycobacteriën te beschermen tegen toxische producten van lipideperoxidatie in het Finn-II voedingsmedium, wordt antioxidant a-tocoferolacetaat toegevoegd in een concentratie van 0,001 μg / ml. Het zaaien van het diagnostische materiaal wordt uitgevoerd volgens een standaardprocedure.

In de Russische anti-tuberculoselaboratoria worden ook andere modificaties van dichte voedingsmedia toegepast; voorgesteld G.G. Mordovisch voedingsmedium "Nieuw", ontwikkeld door V.A. Anicisch voedingsmedium A-6 en A-9, etc.

Vanwege het feit dat in het proces van chemotherapie schade aan diverse metabolische systemen van microbiële cellen, aantal mycobacteriële populatie verliest het vermogen om normaal te ontwikkelen in gebruikelijke voedingsmedia en vereist osmotisch evenwicht (of halfvloeibare) kweekmedia.

Beoordeling en registratie van zaairesultaten van diagnostisch materiaal

Sommige stammen en soorten mycobacteriën groeien langzaam, de groei kan zelfs op de 90e dag verschijnen. Het aantal van dergelijke gewassen is klein, maar dit maakt het mogelijk om gewassen te weerstaan in een thermostaat gedurende 2,5-3 maanden.

Virulente culturen van mycobacterium tuberculosis groeien meestal op dichte eierenomgevingen in de vorm van R-vorm kolonies van verschillende grootten en soorten. Koloniën droog, gerimpeld, ivoor, licht gepigmenteerd. In andere media kan de kolonie mycobacterium tuberculosis vochtiger zijn. Na een kuur met chemotherapie of tijdens de behandeling kunnen gladde kolonies met vochtige groei (S-vormen) worden toegewezen.

Bij het isoleren van gewassen wordt een reeks speciale onderzoeken gebruikt om mycobacterium tuberculosis te onderscheiden van niet-tuberculose-mycobacteriën en zuurbestendige saprofyten.

Een positief antwoord wordt gegeven na een verplicht microscopisch onderzoek van het gekleurde Tsiol-Nelsen-uitstrijkje van de gegroeide kolonies. In het geval van groei van mycobacteriën in uitstrijkjes, worden felrode stokken gevonden die afzonderlijk of in groepen in de vorm van trossen in de vorm van vilt of vlechten liggen. In jonge culturen, in het bijzonder geïsoleerd uit langdurige behandeling van patiënten met chemotherapie, mycobacteriën verschillend tot expressie gebrachte polymorfisme, totdat de aanwezigheid van staafvormige, met korte, bijna coccoide of verlengde versies die mycelium lijken.

De groeisnelheid van mycobacteriën wordt aangegeven door het volgende schema: (+) - 1-20 cfu in vitro (weinig bacteriële excretie); (++) - 20-100 CFU in vitro (matige bacteriële excretie); (+++) -> 100 CFU in vitro (overvloedige bacteriële uitscheiding). Bij de laboratoriumdiagnose van tuberculose is het niet genoeg om te antwoorden of de mycobacterium door een of andere methode wordt gedetecteerd. Een gedetailleerd inzicht hebben in de omvang en aard van de mycobacteriële populatie, de samenstelling en eigenschappen. Met deze gegevens kunnen we de status van het proces correct interpreteren, tactieken plannen en de behandeling tijdig corrigeren.

In de afgelopen jaren zijn, om de groei van mycobacteriën te versnellen, nutriëntmedia op een agarbasis met verschillende groei-additieven en het gebruik van een speciaal gasmengsel voorgesteld. Om de groei van mycobacteriën op deze media te verkrijgen, wordt tijdens de teelt een atmosfeer met een hoog kooldioxidegehalte (4-7%) gecreëerd. Speciale CO ₂ -incubators worden voor dit doel gebruikt . De meest ontwikkelde geautomatiseerde systemen voor het kweken van mycobacteriën: MGIT-BACTEC-960 en MB / Bact.

Een dergelijk systeem - MGIT systeem (mycobacteriën groei aangeeft buis), die verwijst naar de ontwikkeling van hoogwaardige technologie en is bedoeld voor een snelle bacteriologische diagnose van tuberculose en Mycobacterium gevoeligheid voor eerstelijnsgeneesmiddelen Sommige tweedelijnsgeneesmiddelen. MGIT is erop gericht het te gebruiken als onderdeel van het VASTES-960-apparaat. Micro-organismen worden gekweekt in speciale buizen met een vloeibaar voedingsmedium op basis van het gemodificeerde Middlebrook-7H9-medium. Om de groei van mycobacteriën te stimuleren en de groei van externe microflora te onderdrukken, worden MGIT Growth Supplement en een mengsel van PANTA-antibacteriële geneesmiddelen gebruikt.

De groei van micro-organismen wordt optisch geregistreerd. Het is gebaseerd op fluorescentie, die optreedt wanneer zuurstof wordt verbruikt door mycobacteriën tijdens de groei. Van zuurstof afhankelijke fluorochrome kleurstof wordt gevonden op de bodem van een speciale reageerbuis en bedekt met een laag siliconen. Reproductie mycobacteriën leidt tot een afname in hoeveelheid zuurstof in de buis en het verminderen van de concentratie die een toename in fluorescentie veroorzaakt, dat zichtbaar wordt onder bestraling met ultraviolet licht buizen automatisch geregistreerd fotosensor inbouwapparaat VASTES-960. De intensiteit van luminescentie wordt geregistreerd in eenheden van groei (GU-groei-eenheden). De groeigegevens worden opgeslagen op de computer, waar ze automatisch kunnen worden opgeslagen. Computer analyse van groeicurves kan informatie verschaffen over de aanwezigheid van een verscheidenheid van Mycobacterium zwembaden, waaronder nontubercular te bieden, en helpt ook om de groei-eigenschappen van mycobacteriën te evalueren.

Als gevolg van de introductie van dergelijke systemen nam de tijd voor de groei van mycobacteriën aanzienlijk af, gemiddeld 11 dagen op VASTES-960 en 19 dagen op MB / Bact versus 33 dagen op een standaard dicht voedingsmedium. Opgemerkt moet worden dat deze systemen hooggekwalificeerd personeel vereisen. Het zaaien van het materiaal op vloeibare media gaat noodzakelijkerwijs gepaard met zaaien op het Levenstein-Jensen-medium, dat de rol speelt van een duplicator in die gevallen waarin de mycobacterium tuberculosis geen aanleiding geeft tot groei in andere media.

[39], [40], [41], [42], [43], [44],

Bepaling van de geneesmiddelgevoeligheid van mycobacteriën

De bepaling van het spectrum en de mate van gevoeligheid van mycobacteriën voor antituberculosegeneesmiddelen is van groot klinisch belang, evenals voor de epidemiologische evaluatie van de verspreiding van tuberculose met resistentie tegen geneesmiddelen. Daarnaast maakt monitoring van resistentie tegen farmaca het mogelijk om de effectiviteit van het tuberculoseprogramma als geheel te beoordelen, als een integrale indicator voor de prestaties van alle componenten van antituberculeuze activiteiten.

Multipliciteit en timing van medicatiegevoeligheid:

• voor aanvang van de behandeling één keer voor het bepalen van de strategie en tactiek van de behandeling:
• wanneer geïsoleerd uit zieke culturen van verschillende materialen (sputum, BAL-vloeistof, urine, exsudaten, sterke drank, enz.), worden alle geïsoleerde stammen onderzocht:
• aan het einde van de intensieve behandelingsfase bij afwezigheid van klinische en radiologische dynamica:
• als het nodig is om het behandelingsregime te wijzigen in de volgende gevallen:
  • afwezigheid van sputumuitstrijkje;
  • opnieuw isoleren van cultuur na sputumuitstrijkje-negatief;
  • een drastische toename van het aantal CMU in het staafje na de eerste afname. Het is bekend dat stammen van mycobacterium tuberculosis, die qua geneesmiddelgevoeligheid heterogeen zijn, uit het materiaal van een patiënt met tuberculose worden geïsoleerd. De gevoeligheid van stammen voor geneesmiddelen tegen tuberculose kan verschillen in het bereik van geneesmiddelen, mate, frequentie en mate van optreden van resistentie.

De mate van geneesmiddelen resistentie van Mycobacterium tuberculosis werd bepaald in overeenstemming met de vastgestelde criteria, die gericht zijn op de klinische betekenis en stabiliteit afhangen van de activiteit van anti-TB drug, de farmacokinetiek, de concentratie in de laesie. De maximale therapeutische dosis enzovoort.

De bepaling van de geneesmiddelgevoeligheid van mycobacteriën wordt momenteel uitgevoerd met microbiologische methoden:

• Absolute concentraties (verdunningsmethode op dichte of vloeibare voedingsmedia),
• verhoudingen,
• weerstandscoëfficiënt.

Meestal stabiliteit manifesteert als visueel waarneembare kolonie groei van Mycobacterium tuberculosis, maar er zijn technieken die de vroege stadia van groei in delende cellen van Mycobacterium in de vorm van kleurreactie te induceren. Deze methoden verkorten de testtijd van 3-4 tot 2 weken.

Zoals verenigd in Rusland is uitgebreid, aanbevolen door de commissie die chemotherapie methode van absolute concentraties, die afkomstig is van een methodologisch oogpunt, is de meest eenvoudige, maar het vereist hoge precisie en standaardisatie van laboratoriumprocedures. De geneesmiddelgevoeligheidstest bestaat uit een reeks reageerbuizen met een voedingsmedium dat is gemodificeerd met anti-tbc-geneesmiddelen. De set bestaat uit 2-3 buizen met verschillende concentraties van elk van de geneesmiddelen gebruikt, één controlebuizen zonder geneesmiddel voor het milieu en een buis die 1000 mcg / ml natrium Sali tsilovokislogo of 500 ug / ml paranitrobenzoynoy zuur nontubercular groei van mycobacteriën detecteren.

Om een reeks media met preparaten te bereiden, wordt een gemodificeerd Levenstein-Jensen-medium (zonder zetmeel) gebruikt, dat in kolven wordt gegoten. In elk van de kolven wordt een specifiek volume van geschikte verdunning van het antituberculeuze preparaat toegevoegd. De inhoud van de kolven wordt grondig gemengd, in buizen gegoten en 40 minuten bij een temperatuur van 85 ° C in een hellende positie gevouwen. Het wordt aanbevolen om het medium op te warmen in een elektrische opwikkelaar met automatische temperatuurregeling. Woensdag met anti-tbc-medicijnen

De eerste reeks kan in de koelkast worden bewaard bij 2-4 ° C gedurende 1 maand, met voorbereidingen van de tweede rij - niet langer dan 2 weken. Opslag van media met preparaten op kamertemperatuur is onaanvaardbaar. Bij het bereiden van oplossingen van geneesmiddelen tegen tuberculose wordt rekening gehouden met hun activiteit, waarbij de concentratie wordt berekend op basis van het molecuulgewicht van het niet-specifieke deel van het preparaat, zuiverheid, enz. Om de geneesmiddelgevoeligheid te bepalen, worden alleen chemisch zuivere stoffen gebruikt.

Het principe van de methode is om de concentratie van een antituberculeus medicijn te bepalen dat de groei van een aanzienlijk deel van de mycobacteriële populatie remt. Als deze correct wordt uitgevoerd, heeft deze methode een goede betrouwbaarheid.

Vóór de test is het noodzakelijk om ervoor te zorgen dat de geïsoleerde kweek van mycobacterium tuberculosis geen externe microflora heeft. Uit de kweek van mycobacteriën in 0,9% natriumchloride-oplossing wordt een homogene suspensie bereid die 500 miljoen microbiële lichamen per ml bevat (optische troebelheidstandaard van 5 eenheden). De resulterende suspensie wordt verdund met 0,9% natriumchlorideoplossing (1:10) en 0,2 ml suspensie wordt toegevoegd aan elke buis van de set kweekmedia. De geënte buizen worden in een thermostaat bij 37 ° C geplaatst en gedurende 2-3 dagen in een horizontale positie gehouden, zodat het hellende oppervlak van het kweekmedium uniform wordt geïnoculeerd met de suspensie van mycobacterium tuberculosis. De buizen worden vervolgens overgebracht naar een verticale positie en gedurende 3-4 weken geïncubeerd. De resultaten worden na 3-4 weken genoteerd.

Aangezien de timing van uitscheiding uit de excretie van het klinische materiaal op voedingsmedia minstens 1-1,5 maanden bedraagt, kunnen de resultaten van het bepalen van de medicijngevoeligheid volgens deze methode niet eerder dan 2-2,5 maanden na het zaaien van het materiaal worden verkregen. Dit is een van de belangrijkste nadelen van de methode.

Interpreteer de resultaten van het bepalen van de medicatiegevoeligheid van mycobacteriën op basis van bepaalde criteria. Op vaste voedingsbodems is gevoelig voor de concentratie van het geneesmiddel dat aanwezig is in het medium beschouwd als het aantal kolonies van mycobacteriën in vitro gekweekt met dit geneesmiddel is niet meer dan 20 met overvloedige groei van de controlebuis zonder drugs. Alleen in de aanwezigheid van meer dan 20 kolonies wordt cultuur als resistent tegen deze concentratie beschouwd. In de praktijk, bij het verkrijgen van groeiresultaten in reageerbuizen dichtbij 20 cfu. Het is noodzakelijk om de klinische afdeling ervan op de hoogte te stellen dat gevoeligheid of resistentie in dit geval borderline is, omdat het soms de fuzzy dynamiek van klinische indicatoren kan verklaren.

Voor verschillende geneesmiddelen wordt een bepaalde concentratie vastgesteld, waarbij de reproductie van de kritische proportie van de mycobacteriële populatie wordt waargenomen. Deze concentraties worden "kritisch" genoemd. Als een criterium voor stabiliteit wordt de groei van de populatie mycobacteriën op een voedingsmedium met een preparaat in een kritische concentratie gebruikt.

In de binnenlandse tuberculosepraktijk zijn ze bij het bepalen van de geneesmiddelresistentie niet beperkt tot het bepalen van alleen kritische concentraties. Dit komt door het feit. Dat de ruime zin niveau van resistentie kan de arts om meer nauwkeurig te positioneren de tactieken die chemotherapie met behulp van de kennis van versterken van de werking van het geneesmiddel combinaties, kriskras verwacht weerstand of toe te passen een meer effectieve groep geneesmiddelen die worden gebruikt anti-tbc-medicijnen.

De absolute concentratiemethode is de eenvoudigste, maar deze is ook het meest gevoelig voor de fouten die worden gemaakt wanneer deze wordt uitgevoerd. Betrouwbaarder, met name bij het bepalen van de gevoeligheid voor tweedelijnsgeneesmiddelen, en buiten Rusland gangbaar is de methode van verhoudingen. Het houdt rekening met de tekortkomingen van de methode van absolute concentraties, maar in uitvoering is het arbeidsintensiever.

De methode lijkt sterk op de absolute concentratiemethode. Het bereiden van reageerbuisjes met medicijnen wordt op dezelfde manier uitgevoerd. Zoals in de absolute concentratiemethode. De zaaddosis van de suspensie van mycobacterium tuberculosis is echter met een factor 10 verminderd. Die de frequentie van spontane resistentie van sommige stammen van mycobacterium tuberculosis voor geneesmiddelen zoals Etambutol, protionamide, capreomycine elimineert. Als controle worden 2 of 3 buizen met een zaaddosis die gelijk is in de reageerbuizen, achtereenvolgens 10 en 100 keer verdund, gebruikt. Het criterium van stabiliteit is de verhouding van visueel waargenomen groei van mycobacterium tuberculosis. Voor geneesmiddelen uit de 1e reeks is het stabiliteitscriterium het groeipercentage van 1% van de initiële populatie, voor de geneesmiddelen van de tweede rij - een toename van 1 of meer dan 10% van de initiaal, afhankelijk van de gekozen kritieke concentratie.

In 1997 heeft een werkgroep van de WHO en de Internationale Unie voor de identificatie van goede tuberculose resistentie tegen TB drug aanpassingen aan deze criteria, het aanbieden beschouwd mycobacteriën, die groeien op vaste ei media Lowenstein-Jensen bij de volgende concentraties:

• dihydrostreptomycine - 4 μg / ml;
• isoniazide 0,2 μg / ml:
• rifampicine 40 μg / ml:
• Ethambutol - 2 μg / ml.

In 2001 werden kritische concentraties voorgesteld voor de volgende tweedelijnsgeneesmiddelen (voor een kritiek percentage van 1%):

• capreomycine - 40 mcg / ml;
• protionamide - 40 mcg / ml;
• kanamycine - 30 μg / ml;
• viomycine - 30 mcg / ml;
• cycloserine 40 μg / ml;
• aminosalicylzuur - 0,5 μg / ml;
• ofloxacine - 2 μg / ml.

De groeiresultaten worden na 4 weken als een voorlopige en na 6 weken van kweken beoordeeld - als de laatste.

Om de gevoeligheid van het geneesmiddel voor pyrazinamide te bepalen, dat veel wordt gebruikt in moderne chemotherapie voor tuberculose, is de aanbevolen kritische concentratie 200 μg / ml. Tot nu toe is er echter geen algemeen aanvaarde methode voor het bepalen van geneesmiddelresistentie tegen dit medicijn op vaste voedingsmedia, omdat de antibacteriële activiteit ervan zich alleen manifesteert in een zuur medium (pH <6), dat technisch moeilijk te handhaven is. Bovendien groeien veel klinische culturen van mycobacteria tuberculosis met tegenzin in eiermilieus met een zure omgeving.

Om de kwaliteit van de resultaten van het bepalen van de medicijngevoeligheid van mycobacteriën te beoordelen, wordt aanbevolen elke nieuwe batch van het Levenstein-Jensen-medium te monitoren door een parallelle bepaling van de gevoeligheid van de standaard museumstam H37Rv. Bovendien zijn er bepaalde microbiologische criteria die moeten worden gehandhaafd, zodat de technieken een goed reproduceerbaar en correct geïnterpreteerd resultaat opleveren. Deze omvatten de levensvatbaarheid van de kweek van Mycobacterium tuberculosis, de regels voor het verkrijgen van een homogene suspensie en suspensiekweken van selectieregels van Mycobacterium tuberculosis, de representativiteit van de geselecteerde bacteriële massa. De betrouwbaarheid van de bepaling van geneesmiddelresistentie neemt af met een uiterst schaarse bacteriële afgifte.

Onlangs is een methode voor het bepalen van geneesmiddelgevoeligheid met behulp van geautomatiseerde systemen als veelbelovend beschouwd. De meest perfecte in dit gebied zijn ontwikkelingen op basis van VASTES MGIT-960. In dit geval wordt de medicatiegevoeligheid van mycobacterium tuberculosis bepaald op basis van een gemodificeerde methode van verhoudingen. Bij het determinatieproces wordt de groeisnelheid van mycobacterium tuberculosis in een controlebuis en in reageerbuizen met geneesmiddelen vergeleken. Om de gevoeligheid voor streptomycine, isoniazide, rifamp-picine en ethambutol te bepalen, worden verrijkingssupplementen en antibiotica die deel uitmaken van de SIRE-kit gebruikt. Gebruik de PZA-kit om de gevoeligheid voor pyrazinamide te bepalen. Tijdens suspensietest Mycobacterium tuberculosis testbuizen geïnoculeerd met geneesmiddelen, evenals de regelbuizen met gereconstitueerde suspensie werd 100 maal voor alle geneesmiddelen behalve pyrazinamide, waarbij de suspensie verdunning van 10 maal. Het criterium van stabiliteit is de groei-indicator van mycobacteriën van 100 GU wanneer groei wordt bereikt in de controle buis 400 GU (zie "Kweekmethoden voor het isoleren van mycobacteriën"). De boekhouding en interpretatie van de resultaten worden automatisch uitgevoerd en worden ingesteld door de invoer of het geselecteerde programma.

Als kritische concentraties worden eindconcentraties gebruikt in een reageerbuis met een vloeibaar voedingsmedium. Op dit moment zijn er kritische concentraties ontwikkeld voor zowel de eerste- als de tweedelijnsgeneesmiddelen. Opgemerkt moet worden dat de gevoeligheid van mycobacteria tuberculosis voor cycloserine en aminosalicylzuur alleen wordt bepaald op media voor eipoeder.

Een gedetailleerd protocol van werken aan het beschreven systeem maakt het mogelijk om de vatbaarheid van geneesmiddelen te bestuderen, zowel op een geïsoleerde cultuur (met een dicht voedingsmedium) als met behulp van de primaire groei van mycobacterium in een MGIT-buis. De laatste optie vermindert de tijd voor cultuur, zodat u de volledige resultaten van de cultuur van Mycobacterium tuberculosis (inclusief informatie over drugs gevoeligheid) te krijgen na 3 weken na de datum van winning van het materiaal, terwijl de traditionele methode is het mogelijk om alleen de 3de maand te verkrijgen. Na verloop van tijd kunnen de verkregen resultaten, wanneer de patiënt zich in een intensieve behandelingsfase bevindt, de relatief hoge onderzoekskosten compenseren.

[45], [46], [47], [48], [49], [50], [51],

Differentiatie van mycobacteriën

Rekening houdend met het feit dat de gebruikte voedingsmedia niet strikt selectief zijn. De daaropvolgende differentiatie van de geïsoleerde mycobacteriën wordt als verplicht erkend. De behoefte aan differentiatie van mycobacteriën is te wijten aan een aantal kenmerken van pathologische processen veroorzaakt door het geslacht: ander verloop en de uitkomst van tuberculose en mycobacteriosis, de aanwezigheid van resistentie tegen natuurlijke drug om een aantal anti-tbc-medicijnen.

Erkend wordt dat de primaire identificatie van Mycobacterium tuberculosis complex M. Nontubercular van mycobacteriën wordt uitgevoerd door de volgende kenmerken: de groei op vaste voedingsbodems, pigmentatie, koloniemorfologie, bij aanwezigheid van zure weerstand en temperatuuroptimum groei.

Helaas is er geen enkel laboratorium methode om betrouwbaar onderscheid M. Tuberculosis complex mycobacteriën alle zuurvaste bacillen evenwel de combinatie van kenmerken hierboven met de volgende van een aantal biochemische tests bepaald resultaat maakt de identificatie van Mycobacterium tuberculosis complex met M. Waarschijnlijk 95%.

Voor de differentiatie van Mycobacterium complex M. Tuberculosis (M. Tuberculosis, M. Bovis, M. BovisBCG, M. Africanum, M. Microti, M. Canettii en anderen) uit de langzaam groeiende mycobacteriën gebruikt nontubercular fundamentele biochemische tests die de aanwezigheid van de volgende symptomen op te sporen:

• het vermogen om nicotinezuur te produceren (niacine-test):
• nitraat reductase activiteit;
• thermostabiele catalase;
• groei op medium met natriumsalicylaat (1 mg / ml).

Als aanvullende tests kan ook groei op een medium dat 500 μg / ml paranitrobenzoëzuur of 5% natriumchloride bevat worden gebruikt.

Veel bacteriologische laboratoria identificeren deze micro-organismen alleen op het niveau van het complex, wat te wijten is aan de beperkte mogelijkheden van laboratoria en de methodologische mogelijkheden van specialisten.

In de meeste gevallen echter in de praktijk voor het differentiëren van M. Tuberculosis en M. Bovis volstaat de volgende tests: niacine, de aanwezigheid van nitraat, de aanwezigheidsregistratiemiddelen en pirazinamidazy groei op medium met 2 ug / ml hydrazide thiofeen-2-carbonzuur. Er wordt rekening mee gehouden dat de mycobacteriën van het M. Tuberculosis-complex worden gekenmerkt door de volgende reeks kenmerken:

• langzame groei (meer dan 3 weken);
• groeitemperatuur in het bereik van 35-37 ^° C;
• afwezigheid van pigmentatie (ivoor);
• gemarkeerde zuurvaste kleur;
• een positieve niacine-test;
• een positieve nitraatreductasetest;
• afwezigheid van thermostabiele catalase (68 ^° C).
• De afwezigheid van groei op een Levenstein-Jensen-medium met:
  • 1000 μg / ml natriumsalicylaat,
  • 500 μg / ml paranitrobenzoëzuur,
  • 5% natriumchloride:
• groei in de aanwezigheid van 1-5 ug / ml thiofeen-2-carbonzuur.

De relevantie van differentiatie van geïsoleerde mycobacteriën zal aanzienlijk toenemen met de toename van de frequentie van het registreren van HIV / AIDS-gevallen geassocieerd met tuberculose of mycobacteriose. Op dit moment is er geen absolute zekerheid van de bereidheid van praktische regionale laboratoria om dit werkvolume correct uit te voeren.

[52], [53], [54], [55], [56], [57], [58], [59]

Immunologische diagnose van tuberculose

Er zijn een aantal universele verschijnselen, medicijnen en immunologische tests die oorspronkelijk precies met tuberculose of op het model van de immuunrespons op mycobacteriën werden gevonden. Deze omvatten BCG en tuberculine, een fenomeen zoals cutane GZT (tuberculinetesten - reacties van Pirke en Mantoux), een reactie op subcutane injectie van tuberculine bij een gevoelig dier (Koch-fenomeen). Een van de eerste antilichamen bij infectieziekten werd ook gedetecteerd bij tuberculose. Natuurlijk, hoe dieper het begrip van de mechanismen van antituberculeuze immuniteit en hun genetische controle, des te breder kan het gebruik zijn van immunologische methoden en geneesmiddelen die de immuniteit beïnvloeden om de praktische problemen van de phthisiologie op te lossen.

Het belangrijkste en moeilijkste praktische probleem wordt momenteel beschouwd als de detectie van tuberculose in het proces van massascreening van de bevolking. Ondanks de vele rapporten van "successen" (op beperkt materiaal), is er echter geen geschikte immunologische methode (reproduceerbaar in "elke arm") en een medicijn dat geschikt is voor dit doel.

Immunologische methoden, in het bijzonder serologische onderzoeken (bepaling van antigenen, antilichamen) en tuberculinatieproeven worden in de klinische praktijk veel gebruikt.

In de eerste plaats zijn er onder de immunologische onderzoeken die worden gebruikt bij differentiële diagnose, serologische methoden - de bepaling van antigenen en antilichamen in verschillende omgevingen van het lichaam.

De specificiteit van antilichamen tegen mycobacteria tuberculosis hangt af van de antigenen die in de immunoassay worden gebruikt. Een significante hoeveelheid antigenen wordt voorgesteld, waarvan de eerste tuberculine-PPD is:

• PAP en andere complexe preparaten uit de kweekvloeistof;
• ultrasone desintegratie;
• Triton-extract en andere complexe preparaten van celwanden;
• 5-antigeen (Daniel);
• 60-antigeen (Coccito);
• lipo-arabinomannaan;
• cord-factor (trehalose-6,6-di-mycollate);
• fenol en andere glycolipiden;
• lipopolysaccharide;
• fibronectine-bindend antigeen;
• eiwitten (meestal recombinant); 81.65,38,34,30,19,18,16,15.12 CDA, etc.

Als resultaat van vele jaren van onderzoek door Russische en buitenlandse wetenschappers, werden de belangrijkste patronen van antilichaamvorming en de effectiviteit van serologische diagnose van tuberculose onthuld: hoe complexer het antigeen, hoe hoger de gevoeligheid en hoe lager de specificiteit van de tests. De specificiteit varieert van land tot land, afhankelijk van de infectie van de populatie met M. Tuberculosis en niet-tuberculose mycobacteriën, van BCG-vaccinatie, enz. Bij kinderen is de informatieve waarde van serodiagnose lager dan bij volwassenen. Bij primaire tuberculose (vaker kinderen) is de definitie van IgM informatiever. Met secundair IgG. Bij HIV-geïnfecteerde patiënten is de informatieve waarde van serodiagnose bij het bepalen van antilichamen verminderd. Efficiëntie bepalen van antilichamen hangt af van het aantal "klinische aspecten": procesactiviteit (de aanwezigheid of afwezigheid van "isolatie" mycobacteriën aanwezigheid verval holtes, de mate van infiltratie), de prevalentie van het proces, de duur van de stroom.

De gevoeligheid van de methode van enzymimmunoassay (ELISA) is ongeveer 70%. Onvoldoende effectiviteit van de studie is te wijten aan zijn lage specificiteit. Eerder werd de mogelijkheid overwogen om serologische screening in hoog-risicogroepen te gebruiken, in het bijzonder bij personen met post-tuberculose veranderingen in de longen.

Om de specificiteit van ELISA te verhogen, gaat men door met het zoeken naar specifiekere antigenen, inclusief die welke zijn verkregen door genetische manipulatie: ESAT-6, enz. (Zie hierboven). Het gebruik van strikt specifieke antigenen (38 kDa, ESAT) verhoogt de specificiteit. Maar vermindert de gevoeligheid van de analyse aanzienlijk. Samen met IFA (experimenteel laboratorium testsystemen. Bijvoorbeeld Pathozyme ELISA kit) verschaft ook kits zijdelingse immunochromatographic filtratie (Mycodot), evenals andere vergelijkbare proeven (dot-analyse van het membraan) met een visuele evaluatie van het testresultaat. Tijdens deze tests wordt de analyse gedurende 10-30 minuten uitgevoerd; ze vereisen geen speciale apparatuur, ze vereisen een visuele evaluatie van de resultaten, wat geassocieerd is met een bepaalde subjectiviteit. Deze methoden hebben ongeveer dezelfde gevoeligheids- en specificiteitskenmerken (respectievelijk 70% en 90-93%) als de traditionele ELISA.

Het gebruik van methoden voor immuunanalyse heeft een duidelijke waarde als een extra, rekening houdend met het complex van gebruikte methoden, bij de differentiële diagnose van tuberculose, vooral bij de diagnose van extrapulmonale vormen. De meest effectieve ELISA-methode is de diagnose van tuberculose-meningitis bij de studie van hersenvocht. In dit geval is de gevoeligheid van de analyse 80-85% en de specificiteit 97-98%. Er zijn gegevens over de effectiviteit van de detectie van antilichamen tegen mycobacteriën tuberculosis in traanvloeistof bij de diagnose van tuberculeuze uveïtis.

Inductie van gamma-interferonsynthese in vitro

Gamma-interferon (IFN-γ) is een specifieke immuunafweer-factor die wordt gerealiseerd door het activeren van macrofaag-enzymsystemen. Inductie van IFN-y-synthese door gesensitiseerde T-lymfocyten veroorzaakt hun interactie met antigenen van mycobacteriën.

Als antigenen gebruikt als PPD voor tuberculine. En de specifieke antigenen, verkregen door genetische manipulatie, in het bijzonder antigenen ESAT-6 (vroeg afgescheiden antigeen met een molecuulgewicht van 6 kDa) en CFP-10 (kweekfiltraat proteïne 10 kDa). Genetische manipulatie of recombinante antigenen zijn afwezig in de cellen van het BCG-vaccin en andere mycobacteriën. Bij gebruik van tuberculine zijn de resultaten van inductietest IFN-γ vergelijkbaar met de resultaten van de tuberculinehuidtest (directe correlatie). Bij gebruik van genetisch gemanipuleerde antigenen zijn de testresultaten specifieker en niet afhankelijk van eerdere BCG-vaccinatie. Bij het testen van gevaccineerde personen die geen contact hadden met een tuberculose-infectie, is de specificiteit van de test 99%. De gevoeligheid van de test bij patiënten met tuberculose varieert van 81 tot 89%.

Tests en diagnostische instrumenten ontwikkeld op basis van de korte-termijn kweken van cellen of volledig bloed mononucleaire cellen geïsoleerd uit het bloed met antigenen van Mycobacterium tuberculosis in vitro met daaropvolgende bepaling van IFN-γ concentratie of door het tellen van het aantal T-lymfocyten die IFN-γ synthetiseren. De concentratie van interferon gesynthetiseerd in een reageerbuis wordt bepaald door ELISA met behulp van monoklonale antilichamen die IFN-y binden. Vervolgens wordt, door het standaard IFN-y te kalibreren, de concentratie ervan bepaald in de reageerbuis of de putjes van de plaat.

Bij het uitvoeren van de Elispot-test, het aantal T-limocyten dat IFN-y synthetiseert. Worden geteld op het oppervlak van een plaat bekleed met antilichamen tegen IFN-y.

Ontwikkelaars diagnosticum op de IFN-γ in vitro door middel van inductie, die is goedgekeurd door het Bureau voor Geneesmiddelen en Amerikaanse producten, beweren dat een test mogelijk te maken tussen latente tuberculose-infectie van actieve tuberculose. Daarom is de test in regio's met een hoog infectieniveau niet direct diagnostisch. In ons land kan het echter worden gebruikt om tuberculose-infecties bij kinderen te onderscheiden van post-vaccinatieallergie en om het niveau van specifieke immuniteit in het behandelingsproces te beoordelen.

Momenteel wordt het binnenlandse testsysteem voor het bepalen van de inductie van IFN-y-synthese door specifieke tuberculose-antigenen in vitro bestudeerd.

Immunestatus en verloop van tuberculose, immunocorrectie

In het proces van behandeling van tuberculose bij mensen zijn er veranderingen in antigenemie en de toestand van het immuunsysteem.

Gegevens over veranderingen in exudaten en weefsels zijn grotendeels tegenstrijdig. Het enige dat met reden kan worden opgemerkt, is dat in tuberculaire granulomen in de regel een aanzienlijk aantal geactiveerde T-lymfocyten wordt gedetecteerd.

Het is zinvol om stil te staan bij nog twee bepalingen die nodig zijn om de rol van immunologische mechanismen bij de behandeling van tuberculose bij mensen te begrijpen:

• AIDS-patiënten hebben een bijzonder hoge incidentie van resistentie tegen meerdere geneesmiddelen;
• met meerdere resistentie tegen geneesmiddelen (en bij afwezigheid van een HIV-infectie), zijn immuniteitsstoornissen (met name de T-celverbinding) bijzonder significant.

Als tuberculose wijd verschillende vormen van immunomodulatie toepassing: het primair geneesmiddelen die voornamelijk op de T-cel immuniteit en een systeem van mononucleaire fagocyten (thymus hormonen, isoforon, likopid, polioksidony et al.). Evenals hele (verzwakte) mycobacteriën en hun componenten.

Moleculair-biologische diagnose van tuberculose

Voor moleculaire biologische werkwijzen in de diagnose van infectieziekten omvatten voornamelijk, werkwijzen gebaseerd op het manipuleren van het genomische materiaal van bacteriële en virale pathogenen specifieke genetisch materiaal identificatie - DNA segmenten met een nucleotide sequentie specifiek voor een bepaald type of pathogeen stammen specifiek te analyseren DNA-sequenties in genen die de gevoeligheid van het pathogeen voor bepaalde medicinale stoffen bepalen, en ook voor functionele analyse activiteit van bepaalde genen van het pathogeen. Moleculair biologische technieken waren sterk in wetenschappelijk onderzoek en praktische toepassing bij de diagnose en bewaking van verschillende bacteriële en virale infecties na opening in 1985, Carrie Myullisom (winnaar van de Nobelprijs. 1989) polymerasekettingreactie.

Principes en mogelijkheden van de polymerasekettingreactiemethode

PCR maakt het mogelijk om in vitro een nucleotidensequentie (DNA-fragment van het pathogeen) gedurende miljoenen uren in miljoenen keren te vermenigvuldigen (vermenigvuldigen). De reactie in de aanwezigheid van enkele DNA-ketens bepaalt de extreem hoge gevoeligheid van de test.

De nucleotidesequentie van bepaalde regio's in de DNA-keten bepaalt de genetische identiteit van het micro-organisme, wat de hoge specificiteit van PCR verklaart.

De waarde van deze techniek voor het opsporen en onderzoeken van de eigenschappen veroorzaakt door Mycobacterium tuberculosis biologische eigenschappen van een micro-organisme met zeer langzame groei: verdubbelingstijd van Mycobacterium tuberculosis DNA indien kweken is 12-24 uur.

Het principe van de PCR-methode bestaat uit amplificatie - meerdere, miljoenen keren. Vermenigvuldiging van de secties van een specifieke DNA-sequentie in een buis-microvolume tijdens een cyclische herhaling van de volgende drie reactiestadia, die elk in een ander temperatuurregime verlopen:

• Stadium I - denaturatie van dubbelstrengs DNA bij verwarming met een divergentie van zijn ketens;
• II stadium - complementaire binding (hybridisatie) van primers (priming oligonucleotiden) met terminale secties van ketens van strikt specifieke, gekozen voor vermenigvuldiging van het DNA-fragment;
• Stadium III - voltooiing van de keten van het DNA-fragment met behulp van een thermostabiel DNA-polymerase.

Voor amplificatie in vitro moeten er moleculen van matrix-DNA zijn. Vier soorten deoxynucleoside trifosfaten (nucleotiden) die de overeenkomstige stikstofhoudende basen bevatten: adenine (A), thymine (T), guanine (D), cytosine (C); kunstmatig gesynthetiseerde priming-oligonucleotiden (primers) bestaande uit 18-20 basenparen; thermostabiel DNA polymerase enzym met een temperatuuroptimum van 68-72 ^{op de} C en magnesiumionen.

De specificiteit van PCR hangt af van de keuze van het DNA-fragment. In overeenstemming hiermee worden flankzaadoligonucleotiden gesynthetiseerd. Specificiteit van hybridisatie en voltooiing van de DNA-keten is te danken aan het principe van complementariteit van de volgende paren van stikstofhoudende basen: adenine-thymine, guanine-cytosine.

Om de genomische tuberculeuze mycobacteriën complex efficiëntste targetamplificatie meeste testsystemen gekozen DNA-fragment van IS6110, die in de meeste stammen van Mycobacterium tuberculosis genoom een groot aantal (10-20) herhalingen, dat bepaalt, samen met specificiteit, hoge gevoeligheid van de assay te bepalen. Tegelijkertijd worden stammen van Mycobacterium tuberculosis met een klein aantal herhalingen of de afwezigheid van IS6110-fragment beschreven.

Isolatie van DNA-moleculen uit een biologisch monster

Voor het uitvoeren van PCR moeten de DNA-moleculen van het pathogeen geïsoleerd worden uit het biologische materiaal in een minimaal volume, met een minimale hoeveelheid niet-specifiek DNA en verschillende remmers van het enzym-DNA-polymerase.

De voorbereiding van monsters moet worden uitgevoerd onder omstandigheden die kruisbesmetting van de monsters door de geïsoleerde DNA-moleculen voorkomen. Om dit te doen, is voorbehandeling van de kamer met ultraviolet, vloeren en werkoppervlakken van bureaus en apparaten noodzakelijk met chloorbevattende oplossingen. Het is ook noodzakelijk om schone handschoenen, wegwerp reageerbuisjes en tips voor automatische pipetten te gebruiken.

Aan het DNA van Mycobacterium tuberculosis uit klinische monsters (cerebrospinale vloeistof, bronchiale wassing) een groot aantal cellen, celafval of zouten daarvan bevatten, voldoende om het monster te centrifugeren te isoleren ten 3-4000. Rpm, toevoegen slib 20-30 ul van 2% -oplossing triton X-100 en verwarmd tot 90 ^ongeveer C gedurende 30 minuten.

Afhankelijk sample viscositeit - voor de bereiding van sputum monsters moeten efficiënte vervloeiing, die in het algemeen wordt gebruikt voor een 4% oplossing van natriumhydroxide en N-acetyl-L-cysteïne (NALC) in een hoeveelheid van 50-80 mg per monster. De NALC-oplossing moet ex tempore worden bereid of NALC-poeder kan direct droog aan het monster worden toegevoegd. Na vloeibaarmaking moeten de monsters gedurende 15 minuten worden gecentrifugeerd bij 3,5 - 4000 rpm (3000 g) in flacons van 50 ml met schroefdoppen, I.E. Onder dezelfde omstandigheden die worden aanbevolen voor de voorafgaande bereiding van slijm.

Voor de extractie van DNA uit de werkwijze pellet wordt gebruikt meestal gebaseerd op het gebruik van een 06/05 molair oplossing van guanidine isothiocyanaat lysereagens de microporeuze deeltjes en siliciumoxide ( "diatomeeënaarde") sorberen DNA-molecuul. Niet- specifieke stoffen, zoals remmers mogelijk dan in een 2,5 molaire oplossing van guanidine isothiocyanaat en ethanol, waarna het DNA-molecuul wordt gedesorbeerd in water gewassen, en deze monsters werden gebruikt om PCR uit te voeren. Om de technologie van DNA-extractie te vereenvoudigen, wordt "diatomeeënaarde" vaak vervangen door magnetische microdeeltjes bedekt met siliciumoxide. In dit geval wordt een speciale magnetische standaard voor microbuisjes gebruikt in plaats van centrifugatie om de deeltjes neer te slaan.

In Rusland is een originele methode ontwikkeld voor immunomagnetische scheiding van mycobacteriën met daaropvolgende extractie van het DNA van de ziekteverwekker. Voor Mycobacterium tuberculosis immunomagnetische scheiding met behulp ferroparticles grootte van 3-5 micron, bekleed met siliciumdioxide, waaraan zijn gebonden door chemische binding polyklonaal (konijn) antilichamen tegen Mycobacterium tuberculosis. Monsters van sputum na alkalische lyse worden geneutraliseerd met een zure tris-HCl-oplossing en geïncubeerd met een immunomagnetisch sorptiemiddel. Vervolgens worden de immunoferrodeeltjes verzameld met een magnetische staaf met een vervangbare punt, overgebracht naar een microbuis en geprecipiteerd. Voeg 20-30 μl van een 2% Triton X-100-oplossing toe en verwarm gedurende 30 minuten bij 90 ^° C. Het supernatant wordt gebruikt als een DNA-matrijs voor PCR-analyse.

Een moeilijk probleem is de isolatie van mycobacterium tuberculosis-DNA uit biopsiespecimens. Voor enzymbiopsie wordt het enzym proteïnase K gedurende de nacht bij een eindconcentratie van 200-500 mg / l bij een temperatuur van 56 ^° C gebruikt. Verder wordt een van de bekende werkwijzen gebruikt. Overtollig niet-specifiek DNA in de PCR-analyse van biopsieën veroorzaakt vaak de remming van de reactie, die herhaalde extractie van DNA vereist.

Methoden voor het detecteren van resultaten

Na voltooiing van de reactie worden de geamplificeerde DNA-fragmenten van het pathogeen geïdentificeerd door verschillende werkwijzen.

De gelelektroforese methode is goed bekend. Het resulterende DNA-fragment wordt geïdentificeerd door een positieve controle die het gewenste specifieke DNA-fragment bevat, of volgens een bekende grootte (het aantal nucleotide-paren) van het fragment, dat wordt bepaald met behulp van een standaard moleculaire marker.

In aanwezigheid van een specifieke kleurstof wordt ethidiumbromide opgenomen in dubbelstrengig DNA. Het gesynthetiseerde DNA-fragment wordt gedetecteerd als een lichtgevende band onder de werking van het ultraviolet.

De grootte van het DNA-fragment, bepaald door elektroforese vanaf de afstand vanaf het begin, moet overeenkomen met een bekende molecuulgewichtsmerker of positieve controle.

Andere werkwijzen voor het bepalen PCR resultaten op basis van de hybridisatie van een enkele keten PCR producten met een oligonucleotide complementair daaraan - DNA-probe gemerkt met biotine, gevolgd door detectie via enzymatische reacties, bijvoorbeeld door binding aan streptavidine-biotine alkalisch fosfatase.

Op basis van dit type detectie zijn PCR-analyzers gemaakt waarin de detectie van PCR-resultaten automatisch wordt uitgevoerd als resultaat van het lezen van de optische dichtheid in de monsters na de manifestatie van de enzymatische reactie.

De nadelen van deze methoden zijn de mogelijkheden van intralaboratoriumverontreiniging door vrij korte fragmenten van DNA-moleculen. Wanneer moleculen nieuwe monsters invoeren, worden ze een matrix voor PCR en leiden ze tot fout-positieve resultaten.

In dit verband worden, om vals-positieve resultaten te voorkomen, strikte regels voor de scheiding en isolatie van gebouwen ingevoerd: om DNA uit biologische monsters te extraheren; lokalen voor de detectie van resultaten (elektroforese) uit de schone zone. Deze lokalen zijn een zone van waarschijnlijke verontreiniging. Een ander geïsoleerd gebied is een schone kamer voor het introduceren van de te testen DNA-monsters in buizen met een reactiemengsel voor PCR. Ten slotte wordt aangenomen dat het hoofdapparaat - de DNA-versterker - in een aparte, mogelijk kantoorkamer moet worden geplaatst.

Om verontreiniging van de producten van de voorgaande reacties te voorkomen - enkele Likon-amp PCR system test plaats dezoksinukleozidtimidina bevatten dezoksinukleoziduridin die bij in vitro synthese schakeling opgenomen plaats in de juiste stand, d.w.z., De stikstofbasis van thymine aanwezig in natuurlijk DNA is vervangen door uracil. Uracil-DNA-glycosylase, toegevoegd aan het reactiemengsel aan het te analyseren materiaal, vernietigt alleen de verontreinigende fragmenten met deoxyuridine, maar niet het natieve DNA dat moet worden geanalyseerd. Lt; / RTI & gt; Daaropvolgende verwarming op 94 ^° C inactiveert dit enzym en interfereert niet met amplificatie in PCR.

Er is een testsysteem op basis van isotherme amplificatie van rRNA, waarvoor de reverse transcriptie en synthese van DNA-moleculen het eerst worden uitgevoerd. Wat op zijn beurt een matrix is voor de daaropvolgende synthese van RNA-moleculen. RNA-amplicons worden gedetecteerd met behulp van een met acridine gekleurde DNA-probe wanneer gehybridiseerd in een reactiebuisoplossing. Deze methode heeft, naast een hoge gevoeligheid, het voordeel van het analyseren in één buis, wat contaminatie voorkomt. Volgens de auteurs bereikt de gevoeligheid van deze methode bij respiratoire monsters 90% met een specificiteit van 99-100%.

Nieuwe detectiemethoden worden geïmplementeerd in real-time PCR. Deze methoden verschillen hoofdzakelijk doordat PCR en detectie van de resultaten ervan gelijktijdig in één gesloten buis worden uitgevoerd. Dit vereenvoudigt niet alleen de analysetechniek, maar voorkomt ook de besmetting van laboratoriumruimten en testmonsters met producten van eerdere PCR.

Met real-time PCR is de detectie van de resultaten het gevolg van fluorescentie die voortkomt uit de hybridisatie van een fluorogene DNA-probe met een specifiek DNA-fragment geamplificeerd gedurende PCR. Structuur fluorogene DNA probes geconstrueerd dat de fluorescente merker vrijkomt als gevolg van enzymatische reactie of op afstand van de quenchermolecuul fluorescentie alleen onder specifieke hybridisatie met de gewenste DNA-molecuul tijdens de PCR te amplificeren. Met de toename van het aantal moleculen gehybridiseerd met de probe, is de toename in fluorescentie tot het detecteerbare niveau evenredig met het aantal moleculen van het geamplificeerde product. Aangezien bij elke cyclus aantal PCR-fragment DNA-molecuul wordt vermenigvuldigd met de helft, het cyclusnummer waarbij fluorescentie wordt bepaald en verhoogt omgekeerd evenredig met het aantal DNA-moleculen in het oorspronkelijke monster. Als de reactie in te voeren als calibrator verschillende bekende concentraties van moleculen overeenkomstige DNA-fragment van Mycobacterium tuberculosis, met het computerprogramma kan worden berekend en de hoeveelheid genomisch DNA in het testmateriaal.

Elke standaardsteekproef wordt gedupliceerd. Het kwantitatieve criterium is het minimale aantal PCR-cycli dat nodig is voor het begin en de groei van de bepaalde fluorescentie. Op de abscis - het aantal cycli; de Y-as is de fluorescentiewaarde. De DNA-concentraties zijn omgekeerd evenredig met het aantal cycli dat nodig is voor het verschijnen van fluorescentie. In de rechterkolom (21-32) zijn de cyclusnummers voor de overeenkomstige concentraties gemarkeerd. Verschillen tussen 10-voudige concentraties van DNA-fragmenten 10 ² -10 ⁶ ml - 3,2-3,4 cycli. Twee patiënten IS6110 fragmenten concentraties waren ongeveer 10 ³ / ml en 10 ⁴ / ml. Rekening houdend met het aantal herhalingen (6-20) van de fragmenten geanalyseerd in het genoom van Mycobacterium tuberculosis, is het aantal myco-bacteriën in klinische monsters respectievelijk ongeveer 100 en 1000 cellen.

Het gebruik van PCR bij de diagnose van tuberculose

De PCR-methode wordt het meest gebruikt voor de versnelde diagnose van tuberculose - detectie van mycobacterium tuberculosis in klinische monsters: sputum. Bronchiale blozen, pleuraal exsudaat, urine, hersenvocht, osteolyse punctaat, vrouwelijke geslachtsorganen en verschillende biopsiemonsters. Bij bestudering van ongeveer 500 monsters sputum en bronchiale opvliegingen van 340 patiënten met bevestigde diagnose van longtuberculose in Nederland, werd de vergelijkende gevoeligheid van PCR, kweek en uitstrijkje-microscopie bestudeerd. De gevoeligheid van de analyse was respectievelijk 92,6,88,9 en 52,4%. De specificiteit van alle methoden was ongeveer 99%.

De effectiviteit van detectie van mycobacterium tuberculosis door uitstrijkmicroscopie, uitzaaien op het Levenstein-Jensen-medium, VASTES-testsysteem en PCR-analyse werd vergeleken. PCR toonde een gevoeligheid van 74,4%, microscopie - 33,8%, zaaien op een dicht medium - 48,9% en VASTES - 55,8%. De gemiddelde detectietijd voor het zaaien op een Levenstein-Jensen-medium is 24 dagen. VASTES - 13 dagen, PCR - 1 dag.

De mogelijkheden om PCR te gebruiken als een gevoelige en snelle methode voor het monitoren van de effectiviteit van tuberculosebehandeling worden ook besproken.

Detectie van Mycobacterium tuberculosis DNA door PCR met effectieve chemotherapie bepaald gedurende een langere tijd - gemiddeld 1,7 maanden tegenover uitstrijkje onder fluorescentiemicroscopie gedefinieerd en 2,5 maanden tegenover het bacteriologisch onderzoek.

Diagnose van extrapulmonale vormen van tuberculose

Stand gevoelige PCR werkwijze is bijzonder groot voor extrapulmonale vormt als het vormen onder deze klinische en radiologische methoden bacteriologische gebruikelijke werkwijzen voor de bepaling van Mycobacterium tuberculosis in diagnostica ineffectief.

In het onderzoek werden urinemonsters positief PCR-resultaten bij 16 van 17 patiënten met actieve tuberculose en negatieve urine 4 patiënten actief renale tuberculose en 39 patiënten met ziekte nontubercular urinewegen.

De effectiviteit van PCR-analyse in de studie van beenmergpiraat bij patiënten met koorts van onbekende oorsprong werd aangetoond in gevallen van vermoedelijke tuberculose. Voor de diagnose van tuberculeuze lymfadenitis werden 102 punctie-aspiraten en een biopsiespecimen van 67 kinderen met verdenking op tuberculeuze lymfadenitis bij kinderen onderzocht. Positieve resultaten werden verkregen: 71,6% real-time PCR. Fluorescentiemicroscopie - 46,7%. Cultuuronderzoek - 41,8%. Bij de studie van 50 lymfklierbiopsieën bij patiënten met "cat scratch" -ziekte waren alle resultaten negatief. Aldus werd 100% specificiteit van PCR-analyse aangetoond. In hetzelfde werk, met punctiebiopsie van lymfeklieren, werd de mogelijkheid van detectie van M. Avium aangetoond.

Diagnose van tuberculose van het vrouwelijke genitale gebied onvruchtbaarheid, zoals bekend, is een van de moeilijkste problemen van de diagnose. In een PCR-studie van endometriumbiopten, endometriumaspiraten en vloeistofmonsters uit de Douglas-ruimte ontvingen 14 (56%) van 25 patiënten die laparoscopisch werden onderzocht met verdachte tuberculose positieve resultaten. Met behulp van uitstrijkmicroscopie en kweek werden respectievelijk 1 en 2 resultaten verkregen. Deze gevallen waren ook PCR-positief. De meeste PCR-positieve resultaten waren gerelateerd aan gevallen met kenmerkende tekens van tuberculose volgens de histologische studie; een kleiner aantal - met verdenking van tuberculose volgens laparoscopische gegevens. Slechts één positief resultaat van PCR-analyse werd verkregen in de afwezigheid van laparoscopische gegevens voor tuberculose.

Bij het diagnosticeren van extrapulmonale vormen van tuberculose hebben artsen vaak een vraag over de mogelijkheid om een pathogeen te detecteren bij het testen van bloedmonsters met de PCR-methode. Literaire gegevens geven aan dat de detectie van DNA uit de mycobacterium tuberculosis uit bloedmonsters mogelijk is met verstrekkende vormen van HIV-infectie. Het DNA van mycobacterium tuberculosis werd alleen gedetecteerd met gegeneraliseerde tuberculose van verschillende organen bij patiënten met een getransplanteerde nier en immunosuppressie.

[60], [61], [62], [63], [64], [65]

Soortidentificatie van mycobacteriën

De PCR-werkwijze kan zeer effectief voor de snelle identificatie van mycobacteriën tuberculose complex en sommige soorten van mycobacteriën nontubercular na ontvangst van hun initiële groei. In dit geval kan het gebruik van PCR 7-10 dagen besparen, noodzakelijk voor de daaropvolgende culturele identificatie van een positief resultaat. Research PCR is technisch zeer eenvoudig, omdat het niet ingewikkeld monstervoorbereiding klinisch materiaal nodig hebben om hoge gevoeligheid te bereiken. In de studie 80 positief in deze test systeem (MB Vasto. Organon bedrijf) alle positieve kweken van PCR waren strikt specifiek gehouden gedurende 1 dag. Voor andere soorten van mycobacteriën te identificeren bij de bereiding van DNA van het pathogeen kweek gehybridiseerd met specifieke DNA-probes gemerkt met acridine en stammen gedetecteerd door het verschijnen van chemiluminescentie via chemiluminometer of nitrocellulose strips met een visuele beoordeling na hybridisatie. Met een dergelijke kit die een beperkt aantal soorten: Mycobacterium tuberculosis-complex. M. Avium, M. Avium complex, M. Kansasii en M. Gordonae.

A.Telenti et al. Ontwikkelde ook een relatief eenvoudige en goedkope werkwijze voor soorten identificatie van klinisch belangrijke species mycobacteriën d.m.v. PCR en daaropvolgende behandeling met twee restrictie-enzymen (enzymen met eigenschappen knip een DNA-molecuul op specifieke punten). Het DNA-fragment is geamplificeerd. Die codeert voor een heat shock-eiwit (65 kDa) en vervolgens wordt het PCR-fragment van 439 nucleotide-paren geproduceerd door PCR afzonderlijk behandeld met twee enzymen, Bste II en Nae III. Vervolgens geanalyseerd met behulp van agarosegelelektroforese verkregen twee producten traceren, waarvan de omvang (aantal baseparen) met een standaard set DNA fragmenten (moleculaire DNA-merkers) een lengte van 100 tot 1000 baseparen. In elk van de specifieke (M. Tuberculosis, M. Avium, M. Intracellulare, M. Kansasii, M.fortuitum) detecteren twee of drie DNA-fragmenten van verschillende grootte per restrictie-enzym. De combinatie van verschillende groottes van DNA-fragmenten maakt het mogelijk om deze soorten onderling te differentiëren.

De technologie van biologische DNA-microarrays wordt ontwikkeld. Waarmee in één onderzoek meer dan 100 soorten mycobacteriën kunnen worden geïdentificeerd.

Soorten identificatie kan ook worden uitgevoerd door PCR-amplificatie van het 16S rRNA variabele gebied gevolgd door amplificatie van amplicons in vergelijking met de overeenkomstige primaire structuur, die het mogelijk maakt om meer dan 40 soorten mycobacteriën te identificeren.

Met behulp van PCR kan ook een soortidentificatie binnen het mycobacterium tuberculosis-complex worden uitgevoerd, waaronder differentiatie van M. Bovis en M. Bovis BCG. Om dit te doen, wordt de aanwezigheid of afwezigheid van sommige genen in de genomische gebieden van RD1 geanalyseerd. RD9 en RD10. RD1 is afwezig in M. Bovis BCG, maar is aanwezig in virulente soorten, waaronder M. Bovis.

Bepaling van de geneesmiddelgevoeligheid van Mycobacterium tuberculosis met PCR

Doelstellingen van moleculair genetische werkwijzen voor drug gevoeligheid of resistentie van Mycobacterium tuberculosis te verminderen om mutaties te identificeren specifieke nucleotidesequenties van bekende genen. Basismethoden berusten hetzij op directe prochityvanii (sequentiebepaling) van deze sequenties na amplificatie of hybridisatie van biotine-gelabelde DNA-fragmenten geamplificeerd in de PCR DNA-probes. Beide alternatieven omvatten het identificeren van het nucleotide substituties in de sequenties die met behulp van DNA probes tot de afwezigheid of onvolledige hybridisatie op een nitrocellulosemembraan met behulp enzymconjugaat (streptavidine-alkaline fosfatase) - Methode LiPA-Rif-TB.

Werkwijze voor het meten van de fluorescentie in een plaatselijk gefixeerd op microsections DNA probes complementair met bekende mutaties in het PCR geamplificeerde gen gebieden die verantwoordelijk zijn voor resistentie of geneesmiddelgevoeligheid, genaamd mikrobiochipov methode. Het belangrijkste algoritme voor het uitvoeren van dit onderzoek is als volgt. Na het isoleren van DNA uit een klinisch monster of kweek van mycobacteriën noodzakelijk om PCR amplificatie van relevante fragmenten van rpoB-gen dat verantwoordelijk is voor drug gevoeligheid voor rifampicine of katG en inha genen die coderen voor eiwitten van Mycobacterium zijn verantwoordelijk voor gevoeligheid voor isoniazide voeren. De PCR-resultaten worden geëvalueerd door agarosegelelektroforese, waarbij de overeenkomstige DNA-fragmenten van de gewenste lengte worden bevestigd. Vervolgens wordt een tweede PCR-ronde uitgevoerd om een fluorescerend label in het DNA te introduceren. De resultaten van PCR worden opnieuw bevestigd door gelelektroforese. Daarna werd hybridisatie door wassen van het verkregen materiaal op de biochip, hetgeen een groot aantal in een kleine glazen plaat korte DNA-strengen (probes) die complementair zijn met sequenties van het geneesmiddel-gevoelige soort Mycobacterium tuberculosis nucleotide op met betrekking tot mogelijke mutaties vast uitgevoerd (incubatie overnacht) gevolgd. Evenals de mutante sequenties die verantwoordelijk zijn voor geneesmiddelresistentie. Lokatie DNA proben op de plaat - strikt gedefinieerd, en het niveau van fluorescentie waargenomen na hybridisatie met de uitslag vast met een speciaal leesapparaat wordt geplaatst. In dit opzicht worden de resultaten van de analyse bepaald door middel van een speciaal computerprogramma.

In de afgelopen jaren zijn alternatieve methoden ontwikkeld voor het bepalen van de geneesmiddelgevoeligheid van mycobacteria tuberculosis op basis van real-time PCR-technologie, die het mogelijk maken om deze studies uit te voeren in een test met gesloten buisjes.

In Fig. 13-13 presenteert het resultaat van de analyse van klinische culturen van mycobacterium tuberculosis bij de bepaling van geneesmiddelresistentie tegen rifampicine door middel van real-time PCR: 218 - een controlemonster (gevoelig voor rifampicine); 93 - positieve controle voor de mutatie van Ser-Trp TCG-TGG; 4482 - positieve controle voor mutatie van Ser-Leu TCG-TTG; 162-322 - experimentele monsters. Resultaat van berekening van kinetische krommen van amplificatie op 4 kanalen: kanaal 1: 393 - positieve controle voor mutatie van Ser-Trp TCG-TGG; kanaal 2: 4482 - positieve controle voor mutatie van Ser-Leu TCG-TTG; 162, 163, 172, 295 - experimentele monsters; kanaal 4: kinetische krommen van amplificatie van alle monsters die deelnemen aan het experiment. Positieve controle van de amplificatiereactie. Conclusies: Op basis van de resultaten van de analyse werden de volgende mutaties geïdentificeerd die de resistentie tegen rifampicine bepalen: in de monsters 162,163,172,295-Ser-Leu TCG-TTG. Hetzelfde principe werd gebruikt om de geneesmiddelresistentie tegen isoniazide voor de genen katG en inhA te bepalen, die de meest voorkomende mutaties bepalen.

[66], [67], [68], [69], [70], [71],

Stamidentificatie van mycobacterium tuberculosis

De meest grondig bestudeerde werkwijze voor identificatie van stammen van Mycobacterium tuberculosis is een techniek genaamd restrictiefragment lengte polymorfisme (RFLP RFLP,. Of in het Engels versie) en die is gebaseerd op fragmentirovanin (restrictie) van Mycobacterium tuberculosis DNA-enzym PvuII en de fragmenten verkregen daaropvolgende hybridisatie met bepaalde specifieke sequenties van DNA het herhaalde element IS6110. Intraspecifieke variabiliteit wordt gerealiseerd als gevolg van het verschillende aantal herhalingen van IS6110 en hun locatie op DNA. Evenals de verscheidenheid aan afstanden tussen bepaalde aanvalspunten van het enzymbeperkingsenzym (restrictieplaatsen) en het IS6110-element. Deze technologie is erg ingewikkeld en tijdrovend. Na behandeling met DNA geëxtraheerd uit een kweek van Mycobacterium tuberculosis, wordt gelelektroforese uitgevoerd met een restrictie-enzym, en vervolgens overgebracht DNA-fragmenten van verschillende lengtes op een nitrocellulosemembraan, werd hybridisatie uitgevoerd met fragmenten van IS6110-element gedragen en gedetecteerd door middel van enzymatische reacties. Het resulterende specifieke patroon van banden karakteriseert het DNA van een specifieke stam van Mycobacterium tuberculosis. Met behulp van computeranalyse wordt de identiteit of verwantschap van de stammen onthuld. Ondanks het feit dat de RFLP-methode de meest discriminerende is, d.w.z. Identificeert het grootste aantal verschillen in de geanalyseerde stammen, is het effectief om een klein aantal (minder dan 5) IS6110-repeats waargenomen bij sommige stammen. In Fig. 13-14 toont de resultaten van RFLP-typering van stammen.

Een alternatief kan de methode van spoligotypering zijn - analyse van het polymorfisme van spacer-DNA-sequenties - tussenliggend tussen directe herhalingen van het DR-gebied. Bij het uitvoeren van spoligotypering van de stammen, wordt PCR uitgevoerd met primers die het DR-gebied begrenzen, waarna fragmenten van verschillende lengte worden gevormd die hybridiseren met de variabele intermediaire gebieden van DNA. Analyse van de spacersequenties van het DR-gebied wordt gepresenteerd. Volgens onderzoekers, eenvoudiger, productiever en geschikt voor primaire screening van stammen en voorlopige epidemiologische analyse, evenals onderzoek van direct klinisch materiaal.

Vanzelfsprekend is een meer effectieve en technologisch toegankelijke methode VNTR (afkorting van Engelse woorden), of een methode voor het bepalen van het variabele aantal exacte tandemherhalingen in het DNA van mycobacterium tuberculosis. Deze methode is alleen gebaseerd op het gebruik van PCR en vereist geen extra manipulatie. Omdat het aantal tandemherhalingen in verschillende stammen en in verschillende loci verschillend is, worden de fragmenten van verschillende groottes bepaald en geanalyseerd op het resulterende elektroforegram van PCR-producten. Volgens de onderzoekers bereikt het gebruik van VNTR een grotere mate van discriminatie van stammen dan met de RFLP-methode.

Veel aandacht is de laatste jaren besteed aan de verspreiding van stammen van Mycobacterium tuberculosis van de W-Beijing-familie (soms de Beijing-stam genoemd), die grotendeels resistent zijn tegen geneesmiddelen.

Basisvereisten voor de kwaliteit van moleculair biologisch onderzoek

[72], [73], [74], [75],

Basisregelgevingsdocumenten voor PCR

Bestellingen Russische Ministerie van Volksgezondheid: №45 van 2000/02/07 g .. Nummer 109 van 2003/03/21 g .. Nummer 64 van 2000/02/21, de richtsnoeren: 1.3.1888-04 "Organisatie van de werkzaamheden in studies met behulp van PCR materiaal besmet met pathogene biologische middelen van groepen III-IV met pathogeniteit "; 1.3.1794-03 "Organisatie van het werk in de studie van PCR-materiaal, geïnfecteerd met micro-organismen van de I-II pathogeniciteitsgroepen". . 2003; 3.5.5.1034-01 "Sanering van het materiaal, geïnfecteerde bacteriën I-IV pathogeniciteit groepen bij het gebruik van PCR," 2001 De appendix 11 naar de unified instructies voor microbiologisch onderzoek methoden in de identificatie, diagnose en behandeling van tuberculose.

[76], [77], [78]

Het personeel

Uitvoering van moleculair biologisch onderzoek kan de arts van de klinische laboratoriumdiagnostiek, artsen bacteriologen, virologen, artsen, biologen, klinisch diagnostisch laboratorium, evenals specialisten secundair medisch onderwijs te houden, voorbij specialisatie en bijscholing op de voorgeschreven wijze.

Regeling van laboratoriumlokalen

De volgende laboratoriumruimten zijn vereist:

• Monsterbehandelingsgebied is een laboratorium dat is aangepast om te werken met infectieuze agentia van de III-IV pathogeniciteitsgroepen, volgens de Methodical Instructions 13.1888-04.
• Zone voor de bereiding van reactiemengsels PCR - laboratoriumruimte, die bescherming biedt tegen interne laboratoriumverontreiniging - "schone" zone.
• • Als elektroforese of hybridisatie wordt gebruikt om PCR-producten te analyseren. Laboratoriumruimte waarin de vermenigvuldigde DNA-fragmenten worden geëxtraheerd uit de buizen en amplificatie, kunnen respectievelijk in het milieu, overeenkomstig de vereisten voor PCR laboratoria (1.3.1794-03 richtsnoeren Oriëntatie 1.3.1888-04) moeten volledig worden is afgezonderd van het in de voorgaande paragrafen aangegeven terrein. Moet worden uitgesloten van de bewegingszone aan elektroforese voor monsterbehandeling en een "schone" gebied van elke personeel, apparatuur, materialen en voorwerpen, alsmede de overdracht van lucht door het ventilatiesysteem, of als gevolg van tocht zone. Deze zone is niet vereist voor de fluorimetrische detectie van PCR-producten.
• De ruimte voor documentatie en verwerking van resultaten is uitgerust met computers en de nodige kantoorapparatuur. Deze kamer kan apparatuur bevatten die PCR-producten detecteert zonder de slang te openen. - fluorescente PCR-detectoren en thermische cyclers voor real-time PCR.

De sanitaire en epidemiologische vereisten voor de primaire behandeling van sputum zijn vergelijkbaar met de standaard microbiologische vereisten voor het werken met mycobacteria tuberculosis.

[79], [80], [81], [82],

Voltooiing van laboratoriumapparatuur voor PCR-diagnostiek

Het laboratorium bevat apparatuur voor de volgende ruimtes.

• ruimte voor monstervoorbereiding, bevat de volgende apparatuur: laminar van de klasse II van bescherming "SP-1.2": solid-state thermostaat met een verwarmingsdeksel voor reageerbuizen van het type "Eppendorf"; microcentrifuge bij 13.000 tpm; een centrifuge (Vortex); koelkast met een temperatuurbereik van -20 ^о С tot +10 ^о С; pipetten met variabel volume van de "Rroline" -serie; een pomp met een OM-1 valkolf; een statief voor pipetten; statief werkstation 200x0,5 ml; statief werkstation 50x1.5 ml; Staat voor het opslaan van reageerbuizen van 80x1,5 ml;
• Reactiemengsel bereidingskamer: beschermende kamer PCR-box ("Laminar-C. 110 cm); centrifuge - Vortex; Pipetten met variabel volume uit de Proline-serie; een statief voor pipetten; statief werkstation 200x0.2 ml; Staat voor het opslaan van reageerbuizen van 80x1,5 ml; koelkast met een temperatuurbereik van -20 ^о С tot + 10 ^о С;
• ruimte voor elektroforese: camera voor horizontale elektroforese; voeding; transilluminator;
• DNA-versterkers of nucleïnezuuranalysator (PCR in real time) met een computer en software; kan in elke logeerkamer worden geplaatst. Als real-time PCR-technologie wordt gebruikt. Ruimte voor elektroforese is niet nodig.

[83], [84], [85], [86]

Externe kwaliteitscontrole

Om zeker te zijn van het verkrijgen van objectief betrouwbare resultaten, moeten laboratoria deelnemen aan het systeem van externe evaluatie van de kwaliteit van laboratoriumonderzoek.

Deelnemers aan het kwaliteitscontrolesysteem ontvangen; 12 flacons gevriesdroogd Bacteriële celsuspensie, waarvan twee met de E. Coli E. Coir, 3 buisjes met Mycobacterium tuberculosis (avirulente stam) 10 ² / ml; 3 flesjes van dezelfde stam van cellen bij een concentratie van 10 ⁴ / ml; 2 ampullen nontubercular mycobacterie M. Avium-intracellulare en M. Kansasii in een concentratie van 10 ⁵ / ml.

Gedistribueerde tests voor externe kwaliteitsbeoordeling zijn vooraf getest in twee onafhankelijke laboratoria met uitgebreide ervaring op dit gebied.

[87], [88]