Moleculair genetische methoden voor de diagnose van erfelijke ziekten

DNA-technologische methoden worden gebruikt om de lokalisatie van een mutant gen in een bepaald chromosoom te bepalen, dat verantwoordelijk is voor het ontstaan van bepaalde vormen van erfelijke pathologie. Omdat een gen een stukje DNA is, en een genmutatie een beschadiging van de primaire DNA-structuur (onder mutatie worden alle veranderingen in de DNA-sequentie verstaan, ongeacht hun lokalisatie en impact op de levensvatbaarheid van een individu), is het mogelijk om door onderzoek van preparaten van metafasechromosomen van een patiënt met een erfelijke ziekte de lokalisatie van het pathologische gen vast te stellen. Moleculair genetische methoden bieden mogelijkheden voor het diagnosticeren van ziekten op het niveau van een veranderde DNA-structuur; ze stellen ons in staat de lokalisatie van erfelijke aandoeningen te bepalen. Moleculair genetische methoden kunnen mutaties identificeren die verband houden met de vervanging van zelfs één enkele base.

De belangrijkste fase van genidentificatie is de isolatie ervan. DNA kan worden geïsoleerd uit elk type weefsel en cellen met een celkern. De fasen van DNA-isolatie omvatten: snelle lysis van cellen, verwijdering van fragmenten van celorganellen en membranen door centrifugatie, enzymatische vernietiging van eiwitten en extractie ervan uit de oplossing met behulp van fenol en chloroform, en concentratie van DNA-moleculen door precipitatie in ethanol.

In genetische laboratoria wordt DNA meestal geïsoleerd uit bloedleukocyten. Hiervoor wordt 5-20 ml veneus bloed van de patiënt afgenomen in een steriele reageerbuis met een anticoagulansoplossing (heparine). Vervolgens worden de leukocyten gescheiden en verwerkt volgens de bovenstaande stappen.

De volgende stap in het voorbereiden van het materiaal voor onderzoek is het "knippen" van het DNA in fragmenten op plaatsen met een strikt specifieke basenvolgorde. Dit wordt gedaan met behulp van bacteriële enzymen - restrictie-endonucleasen (restrictie-enzymen). Restrictie-enzymen herkennen specifieke sequenties van 4-6, minder vaak 8-12 nucleotiden in een dubbelstrengs DNA-molecuul en verdelen dit in fragmenten op de locaties van deze sequenties, de zogenaamde restrictieplaatsen. Het aantal resulterende restrictiefragmenten van DNA wordt bepaald door de frequentie waarmee restrictieplaatsen voorkomen, en de grootte van de fragmenten wordt bepaald door de aard van de verdeling van deze plaatsen over de lengte van het oorspronkelijke DNA-molecuul. Hoe vaker de restrictieplaatsen voorkomen, hoe korter de DNA-fragmenten na restrictie. Momenteel zijn er meer dan 500 verschillende soorten restrictie-enzymen van bacteriële oorsprong bekend, en elk van deze enzymen herkent zijn eigen specifieke nucleotidevolgorde. In de toekomst kunnen restrictieplaatsen worden gebruikt als genetische markers van DNA. De DNA-fragmenten die als gevolg van restrictie worden gevormd, kunnen door middel van elektroforese in een agarose- of polyacrylamidegel op lengte worden geordend, waardoor hun molecuulgewicht kan worden bepaald. DNA in een gel wordt doorgaans geïdentificeerd door specifieke kleuring (meestal ethidiumbromide) en door de gel te bekijken in doorvallend ultraviolet licht. De DNA-lokalisatieplaatsen zijn rood gekleurd. Bij mensen worden echter, wanneer DNA door verschillende restrictie-enzymen wordt verwerkt, zoveel fragmenten van verschillende lengte gevormd dat ze niet door elektroforese kunnen worden gescheiden. Het is dus niet mogelijk om individuele DNA-fragmenten visueel te identificeren tijdens elektroforese (uniforme kleuring wordt verkregen over de gehele lengte van de gel). Om de gewenste DNA-fragmenten in een dergelijke gel te identificeren, wordt daarom de hybridisatiemethode met gelabelde DNA-probes gebruikt.

Elk enkelstrengs DNA- of RNA-segment kan binden (hybridiseren) met een complementaire streng, waarbij guanine altijd bindt aan cytosine en adenine aan thymine. Zo ontstaat een dubbelstrengs molecuul. Als een enkelstrengs kopie van een gekloond gen wordt gelabeld met een radioactief label, ontstaat een probe. De probe kan een complementair DNA-segment vinden, dat vervolgens eenvoudig kan worden geïdentificeerd met behulp van autoradiografie. Een radioactieve probe die wordt toegevoegd aan een preparaat van uitgerekte chromosomen, maakt het mogelijk om het gen op een specifiek chromosoom te lokaliseren: met behulp van een DNA-probe kunnen specifieke gebieden worden geïdentificeerd tijdens Southern blotting. Hybridisatie treedt op als het te testen DNA-fragment een normaal gen bevat. In het geval dat er een abnormale nucleotidesequentie aanwezig is, d.w.z. dat de corresponderende chromosoomstructuren een mutant gen bevatten, zal hybridisatie niet plaatsvinden, waardoor de lokalisatie van het pathologische gen kan worden bepaald.

Om DNA-probes te verkrijgen, wordt de genkloneringsmethode gebruikt. De essentie van de methode is dat een DNA-fragment dat overeenkomt met een gen of een deel ervan, wordt ingevoegd in een kloondeeltje, meestal een bacterieel plasmide (annulair extrachromosomaal DNA dat aanwezig is in bacteriële cellen en antibioticaresistentiegenen draagt), waarna de bacteriën met het plasmide met het ingevoegde menselijke gen worden vermenigvuldigd. Dankzij de syntheseprocessen in het plasmide kunnen miljarden kopieën van het menselijke gen of een deel ervan worden verkregen.

De resulterende DNA-kopieën, gelabeld met een radioactief label of fluorochromen, worden vervolgens gebruikt als probes om te zoeken naar complementaire sequenties in de bestudeerde pool van DNA-moleculen.

Er bestaan momenteel veel verschillende methoden om genmutaties te diagnosticeren met behulp van DNA-sondes.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ]