Hematopoëtische stamcellen van de dooierzak

Uiteraard worden de verschillende proliferatieve en differentiërende mogelijkheden van hematopoëtische stamcellen bepaald door de eigenaardigheden van hun ontogenetische ontwikkeling, aangezien zelfs de lokalisatie van de belangrijkste hematopoëtische gebieden bij mensen verandert tijdens de ontogenese. Hematopoëtische voorlopercellen van de dooierzak van de foetus zijn toegewijd aan de vorming van een exclusief erytropoëtische cellijn. Na de migratie van primaire HSC's naar de lever en milt breidt het spectrum van commitmentlijnen zich uit in de micro-omgeving van deze organen. Hematopoëtische stamcellen verwerven met name het vermogen om lymfoïde cellen te genereren. In de prenatale periode bereiken hematopoëtische voorlopercellen de zone van uiteindelijke lokalisatie en bevolken ze het beenmerg. Tijdens de intra-uteriene ontwikkeling bevat het foetale bloed een aanzienlijk aantal hematopoëtische stamcellen. Zo bereikt het HSC-niveau in de 13e week van de zwangerschap 18% van het totale aantal mononucleaire bloedcellen. Vervolgens wordt een progressieve afname van hun gehalte waargenomen, maar zelfs vóór de geboorte verschilt de hoeveelheid HSC's in het navelstrengbloed weinig van de hoeveelheid in het beenmerg.

Volgens klassieke concepten vindt de natuurlijke verandering in de lokalisatie van hematopoëse tijdens de embryonale ontwikkeling van zoogdieren plaats door migratie en introductie van pluripotente hematopoëtische stamcellen in een nieuwe micro-omgeving – van de dooierzak naar de lever, milt en het beenmerg. Aangezien het hematopoëtische weefsel in de vroege stadia van de embryonale ontwikkeling een groot aantal stamcellen bevat, dat afneemt naarmate de foetus rijpt, wordt het hematopoëtische leverweefsel van de embryonale lever, geïsoleerd uit geaborteerd materiaal na 5-8 weken zwangerschap, beschouwd als de meest veelbelovende manier om hematopoëtische stamcellen te verkrijgen.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ]

Vragen over de oorsprong van hematopoëtische stamcellen

Het lijdt geen twijfel dat de embryonale vorming van erytrocyten plaatsvindt in de bloedeilandjes van de dooierzak. Het differentiatiepotentieel in vitro van hematopoëtische cellen uit de dooierzak is echter zeer beperkt (ze differentiëren voornamelijk tot erytrocyten). Opgemerkt moet worden dat transplantatie van hematopoëtische stamcellen uit de dooierzak de hematopoëse niet langdurig kan herstellen. Het is gebleken dat deze cellen niet de voorlopers zijn van volwassen HSC's. Echte HSC's verschijnen eerder, in de 3e tot 5e week van de intra-uteriene ontwikkeling, in de zone van de vorming van maagweefsel en endotheel van bloedvaten (para-aortale splanchnopleura, P-SP), evenals ter hoogte van de aorta, gonaden en primaire nieren – in de mesonefros, oftewel de zogenaamde AGM-regio. Het is aangetoond dat cellen in de AGM-regio niet alleen een bron zijn van HSC's, maar ook van endotheelcellen van bloedvaten, en van osteoclasten die betrokken zijn bij de vorming van botweefsel. In de zesde week van de zwangerschap verplaatsen vroege hematopoëtische stamcellen uit de AGM-regio zich naar de lever, die tot de geboorte het belangrijkste hematopoëtische orgaan van de foetus blijft.

Omdat dit punt uiterst belangrijk is vanuit het oogpunt van celtransplantatie, verdient het probleem van de oorsprong van HSC's in het proces van menselijke embryogenese een meer gedetailleerde presentatie. De klassieke ideeën dat de hematopoëtische stamcellen van zoogdieren en vogels afkomstig zijn van een extra-embryonale bron, zijn gebaseerd op de studies van Metcalf en Moore, die als eersten methoden gebruikten om HSC's en hun uit de dooierzak geïsoleerde nakomelingen te klonen. De resultaten van hun werk dienden als basis voor de migratietheorie, volgens welke HSC's, nadat ze voor het eerst in de dooierzak zijn verschenen, sequentieel de transiënte en definitieve hematopoëtische organen bevolken naarmate de corresponderende micro-omgeving daarin wordt gevormd. Zo ontstond het standpunt dat de generatie van HSC's, aanvankelijk gelokaliseerd in de dooierzak, dient als de cellulaire basis voor definitieve hematopoëse.

Hematopoëtische voorlopercellen uit de dooierzak behoren tot de categorie van de vroegste hematopoëtische voorlopercellen. Hun fenotype wordt beschreven met de formule AA4.1+CD34+c-kit+. In tegenstelling tot volwassen beenmerg-HSC's, brengen ze geen Sca-1-antigenen en MHC-moleculen tot expressie. Het lijkt erop dat de aanwezigheid van markerantigenen op de oppervlaktemembranen van HSC's uit de dooierzak tijdens de kweek overeenkomt met hun differentiatie tijdens de embryonale ontwikkeling met de vorming van toegewijde hematopoëtische lijnen: de expressie van CD34- en Thy-1-antigeen neemt af, de expressie van CD38 en CD45RA neemt toe en er verschijnen HLA-DR-moleculen. Met daaropvolgende specialisatie in vitro, geïnduceerd door cytokines en groeifactoren, begint de expressie van antigenen die specifiek zijn voor hematopoëtische voorlopercellen van een bepaalde cellijn. De resultaten van het onderzoek naar embryonale hematopoëse bij vertegenwoordigers van drie klassen gewervelde dieren (amfibieën, vogels en zoogdieren) en in het bijzonder de analyse van de oorsprong van HSC's die verantwoordelijk zijn voor definitieve hematopoëse in postnatale ontogenese, spreken klassieke concepten echter tegen. Het is vastgesteld dat bij vertegenwoordigers van alle beschouwde klassen twee onafhankelijke regio's waarin HSC's ontstaan, worden gevormd tijdens de embryogenese. De extra-embryonale "klassieke" regio wordt vertegenwoordigd door de dooierzak of zijn analogen, terwijl de recent geïdentificeerde intra-embryonale zone van HSC-lokalisatie het para-aortale mesenchym en de AGM-regio omvat. Tegenwoordig kan worden betoogd dat bij amfibieën en vogels definitieve HSC's afkomstig zijn van intra-embryonale bronnen, terwijl bij zoogdieren en mensen de deelname van HSC's in de dooierzak aan definitieve hematopoëse nog niet volledig kan worden uitgesloten.

Embryonale hematopoëse in de dooierzak is in feite primaire erytropoëse, die wordt gekenmerkt door het behoud van de celkern in alle stadia van de erytrocytrijping en de synthese van foetaal hemoglobine. Volgens de meest recente gegevens eindigt de golf van primaire erytropoëse in de dooierzak op de 8e dag van de embryonale ontwikkeling. Dit wordt gevolgd door een periode van accumulatie van definitieve erytroïde voorlopercellen - BFU-E, die uitsluitend in de dooierzak worden gevormd en voor het eerst verschijnen op de 9e dag van de zwangerschap. In de volgende fase van de embryogenese worden definitieve erytroïde voorlopercellen - CFU-E, evenals (!) mestcellen en CFU-GM, al gevormd. Dit vormt de basis voor de opvatting dat definitieve voorlopercellen in de dooierzak ontstaan, met de bloedbaan migreren, zich in de lever vestigen en snel de eerste fase van intra-embryonale hematopoëse in gang zetten. Volgens deze concepten kan de dooierzak enerzijds worden beschouwd als de plaats van primaire erytropoëse en anderzijds als de eerste bron van definitieve hematopoëtische voorlopercellen in de embryonale ontwikkeling.

Het is aangetoond dat kolonievormende cellen met een hoog proliferatiepotentieel al vanaf de achtste dag van de zwangerschap uit de dooierzak kunnen worden geïsoleerd, d.w.z. lang voordat het vaatstelsel van het embryo en de dooierzak gesloten zijn. Bovendien vormen de in vitro uit de dooierzak verkregen cellen met een hoog proliferatiepotentieel kolonies waarvan de grootte en cellulaire samenstelling niet verschillen van de overeenkomstige parameters van de kweek van beenmergstamcellen. Tegelijkertijd worden bij retransplantatie van kolonievormende cellen uit de dooierzak met een hoog proliferatiepotentieel significant meer dochterkolonievormende cellen en multipotente voorlopercellen gevormd dan bij gebruik van beenmergvoorlopercellen van hematopoëse.

Een definitieve conclusie over de rol van hematopoëtische stamcellen uit de dooierzak bij definitieve hematopoëse kan worden getrokken uit de resultaten van het werk waarin de auteurs een lijn dooierzak-endotheelcellen (G166) verkregen, die de proliferatie van de cellen effectief ondersteunde met de fenotypische en functionele kenmerken van HSC's (AA4.1+WGA+, lage dichtheid en zwakke adhesieve eigenschappen). Het gehalte van deze laatste nam meer dan 100 keer toe bij 8 dagen kweken op een voedingslaag van C166-cellen. Macrofagen, granulocyten, megakaryocyten, blastcellen en monocyten, evenals precursorcellen van B- en T-lymfocyten werden geïdentificeerd in gemengde kolonies die groeiden op een sublaag van C166-cellen. Dooierzakcellen die groeiden op een sublaag van endotheelcellen, hadden het vermogen tot zelfreproductie en doorstonden tot drie passages in de experimenten van de auteurs. Herstel van de hematopoëse met behulp van deze cellen bij volwassen muizen met ernstige gecombineerde immunodeficiëntie (SCID) ging gepaard met de vorming van alle soorten leukocyten, waaronder T- en B-lymfocyten. De auteurs gebruikten echter dooierzakcellen van een 10 dagen oud embryo, waarin de extra- en intra-embryonale vasculaire systemen al gesloten zijn, waardoor de aanwezigheid van intra-embryonale HSC's tussen de dooierzakcellen niet kan worden uitgesloten.

Tegelijkertijd onthulde de analyse van het differentiatiepotentieel van hematopoëtische cellen in vroege ontwikkelingsstadia, geïsoleerd vóór de vereniging van de vasculaire systemen van de dooierzak en het embryo (8-8,5 dagen zwangerschap), de aanwezigheid van voorlopercellen van T- en B-cellen in de dooierzak, maar niet in het embryo zelf. In het in-vitrosysteem, door middel van tweefasekweek op een monolaag van epitheel- en subepitheelcellen van de thymus, differentieerden mononucleaire cellen van de dooierzak tot pre-T- en mature T-lymfocyten. Onder dezelfde kweekomstandigheden, maar op een monolaag van stromacellen van de lever en het beenmerg, differentieerden mononucleaire cellen van de dooierzak tot pre-B-cellen en mature IglVT-B-lymfocyten.

De resultaten van deze onderzoeken geven aan dat immuunsysteemcellen zich kunnen ontwikkelen uit extra-embryonaal weefsel van de dooierzak. De vorming van primaire T- en B-cellijnen is bovendien afhankelijk van factoren in de stroma-micro-omgeving van embryonale hematopoëtische organen.

Andere auteurs hebben ook aangetoond dat de dooierzak cellen bevat met potentieel voor lymfoïde differentiatie, en de resulterende lymfocyten verschillen niet in antigene kenmerken van die in geslachtsrijpe dieren. Het is vastgesteld dat de dooierzakcellen van een 8-9 dagen oud embryo in staat zijn om de lymfopoëse in de athymocytische thymus te herstellen met de opkomst van volwassen CD3+CD4+- en CD3+CD8+-lymfocyten die een gevormd repertoire aan T-celreceptoren bezitten. De thymus kan dus worden bevolkt door cellen van extra-embryonale oorsprong, maar het is onmogelijk om de waarschijnlijke migratie van vroege T-lymfocytprecursorcellen vanuit intra-embryonale bronnen van lymfopoëse naar de thymus uit te sluiten.

Tegelijkertijd resulteert transplantatie van hematopoëtische cellen uit de dooierzak naar volwassen bestraalde ontvangers niet altijd in langdurige herpopulatie van lokalisatiezones van uitgeputte hematopoëtische weefsels, en in vitro vormen dooierzakcellen aanzienlijk minder miltkolonies dan cellen uit de AGM-regio. In sommige gevallen is het met dooierzakcellen van een 9 dagen oud embryo nog steeds mogelijk om langdurige (tot 6 maanden) herpopulatie van hematopoëtisch weefsel te bereiken bij bestraalde ontvangers. De auteurs zijn van mening dat dooierzakcellen met het CD34+c-kit+-fenotype niet alleen niet verschillen van die uit de AGM-regio in hun vermogen om uitgeputte hematopoëtische organen te herpopuleren, maar ook de hematopoëse effectiever herstellen, aangezien de dooierzak er bijna 37 keer meer van bevat.

Opgemerkt dient te worden dat de experimenten gebruik maakten van hematopoëtische dooierzakcellen met markerantigenen van hematopoëtische stamcellen (c-kit+ en/of CD34+ en CD38+). Deze werden rechtstreeks geïnjecteerd in de lever of buikader van de nakomelingen van vrouwelijke muizen die op de 18e dag van de dracht een busulfan-injectie kregen. Bij dergelijke pasgeboren dieren werd hun eigen myelopoëse sterk onderdrukt door de eliminatie van hematopoëtische stamcellen door busulfan. Na transplantatie van hematopoëtische dooierzakstamcellen werden gedurende 11 maanden in het perifere bloed van de ontvangers elementen aangetroffen die de donormarker glycerofosfaatdehydrogenase bevatten. Er werd vastgesteld dat dooierzak-HSC's de inhoud van lymfoïde, myeloïde en erytroïde cellen in het bloed, de thymus, de milt en het beenmerg herstellen, en dat de mate van chimerisme hoger was bij intrahepatische dan bij intraveneuze toediening van dooierzakcellen. De auteurs zijn van mening dat dooierzak-HSC's van embryo's in een vroeg stadium (tot 10 dagen) een voorafgaande interactie met de hematopoëtische micro-omgeving van de lever nodig hebben om de hematopoëtische organen van volwassen ontvangers succesvol te bevolken. Mogelijk bestaat er een unieke ontwikkelingsfase in de embryogenese, waarin dooierzakcellen, die aanvankelijk naar de lever migreren, vervolgens het vermogen verwerven om het stroma van de hematopoëtische organen van volwassen ontvangers te bevolken.

In dit verband moet worden opgemerkt dat chimerisme van cellen van het immuunsysteem vrij vaak wordt waargenomen na transplantatie van beenmergcellen bij bestraalde volwassen ontvangers. In het bloed van laatstgenoemde worden cellen van het donorfenotype in vrij grote hoeveelheden aangetroffen in de B-, T-lymfocyten en granulocyten van de ontvanger, en dit gedurende ten minste 6 maanden.

Hematopoëtische cellen bij zoogdieren worden voor het eerst gedetecteerd met behulp van morfologische methoden op de 7e dag van de embryonale ontwikkeling en worden vertegenwoordigd door hematopoëtische eilandjes in de vaten van de dooierzak. Natuurlijke hematopoëtische differentiatie in de dooierzak is echter beperkt tot primaire erytrocyten die celkernen behouden en foetaal hemoglobine synthetiseren. Niettemin werd traditioneel aangenomen dat de dooierzak de enige bron is van HSC's die migreren naar de hematopoëtische organen van het zich ontwikkelende embryo en zorgen voor definitieve hematopoëse bij volwassen dieren, aangezien de verschijning van HSC's in het embryolichaam samenvalt met de sluiting van de vasculaire systemen van de dooierzak en het embryo. Deze visie wordt ondersteund door gegevens waaruit blijkt dat dooierzakcellen, wanneer ze in vitro worden gekloond, granulocyten en macrofagen voortbrengen, en in vivo miltkolonies. Vervolgens werd tijdens transplantatie-experimenten vastgesteld dat de hematopoëtische cellen van de dooierzak, die in de dooierzak zelf alleen kunnen differentiëren tot primaire erytrocyten, in de micro-omgeving van de lever van pasgeboren en volwassen SCID-muizen, de uitgeputte thymus of stroma-feeder, het vermogen verwerven om hematopoëtische organen te herbevolken met het herstel van alle hematopoëtische lijnen, zelfs bij volwassen ontvangers. In principe stelt dit ons in staat om ze te classificeren als echte HSC's - als cellen die functioneren in de postnatale periode. Aangenomen wordt dat de dooierzak, samen met de AGM-regio, dient als bron van HSC's voor definitieve hematopoëse bij zoogdieren, maar hun bijdrage aan de ontwikkeling van het hematopoëtische systeem is nog steeds onduidelijk. De biologische betekenis van het bestaan van twee hematopoëtische organen met vergelijkbare functies in de vroege embryogenese van zoogdieren is eveneens onduidelijk.

De zoektocht naar antwoorden op deze vragen gaat door. In vivo kon de aanwezigheid van cellen in de dooierzak van 8-8,5 dagen oude embryo's worden aangetoond die de lymfopoëse herstellen in subletaal bestraalde SCID-muizen met een uitgesproken tekort aan T- en B-lymfocyten. Hematopoëtische cellen uit de dooierzak werden zowel intraperitoneaal als rechtstreeks in het milt- en leverweefsel geïnjecteerd. Na 16 weken werden TCR/CD34 CD4+ en CD8+ T-lymfocyten en B-220+IgM+ B-lymfocyten, gelabeld met donor MHC-antrxgenen, gedetecteerd in de ontvangers. Tegelijkertijd vonden de auteurs geen stamcellen die in staat waren tot een dergelijk herstel van het immuunsysteem in het lichaam van 8-8,5 dagen oude embryo's.

Hematopoëtische dooierzakcellen hebben een hoog proliferatief potentieel en zijn in staat tot langdurige zelfreproductie in vitro. Sommige auteurs identificeren deze cellen als HSC's op basis van de verlengde (bijna 7 maanden) generatie van erythroïde voorlopercellen. Deze cellen verschillen van beenmergvoorlopercellen van de erythroïde lijn door een langere passageperiode, grotere koloniegroottes, verhoogde gevoeligheid voor groeifactoren en langere proliferatie. Bovendien worden onder geschikte omstandigheden van dooierzakcelkweek in vitro ook lymfoïde voorlopercellen gevormd.

De gepresenteerde gegevens stellen ons in het algemeen in staat om de dooierzak te beschouwen als een bron van HSC's, die minder betrokken is en daardoor een groter proliferatief potentieel heeft dan beenmergstamcellen. Ondanks het feit dat de dooierzak pluripotente hematopoëtische voorlopercellen bevat die verschillende lijnen van hematopoëtische differentiatie in vitro langdurig in stand houden, is het enige criterium voor de volledigheid van HSC's hun vermogen om de hematopoëtische organen van de ontvanger, waarvan de hematopoëtische cellen vernietigd of genetisch defect zijn, langdurig te repopuleren. De kernvraag is dus of pluripotente hematopoëtische cellen van de dooierzak kunnen migreren en hematopoëtische organen kunnen bevolken, en of het raadzaam is om de bekende werken te herzien die hun vermogen aantonen om de hematopoëtische organen van volwassen dieren te repopuleren met de vorming van de belangrijkste hematopoëtische lijnen. Intra-embryonale bronnen van definitieve GSC's werden al in de jaren 70 geïdentificeerd in vogelembryo's, wat toen al twijfel deed ontstaan aan de gevestigde opvattingen over de extra-embryonale oorsprong van GSC's, ook bij vertegenwoordigers van andere klassen gewervelde dieren. De afgelopen jaren zijn er publicaties verschenen over de aanwezigheid van vergelijkbare intra-embryonale gebieden met GSC's bij zoogdieren en mensen.

Er moet nogmaals worden opgemerkt dat fundamentele kennis op dit gebied van groot belang is voor de praktische celtransplantatie, omdat deze niet alleen helpt bij het bepalen van de voorkeursbron van HSC's, maar ook bij het vaststellen van de kenmerken van de interactie tussen primaire hematopoëtische cellen en een genetisch vreemd organisme. Het is bekend dat de introductie van hematopoëtische stamcellen uit de lever van een menselijke foetus in een schapenembryo tijdens de organogenese leidt tot de geboorte van chimaera-dieren, waarvan 3 tot 5% van de menselijke hematopoëtische cellen stabiel is bepaald in het bloed en beenmerg. Tegelijkertijd veranderen menselijke HSC's niet van karyotype, waardoor ze een hoge proliferatiesnelheid en differentiatievermogen behouden. Bovendien conflicteren getransplanteerde xenogene HSC's niet met het immuunsysteem en de fagocyten van het gastheerorganisme en transformeren ze niet tot tumorcellen, wat de basis vormde voor de intensieve ontwikkeling van methoden voor intra-uteriene correctie van erfelijke genetische pathologie met behulp van HSC's of ESC's die zijn getransfecteerd met deficiënte genen.

Maar in welk stadium van de embryogenese is het meest geschikt om een dergelijke correctie uit te voeren? Voor het eerst verschijnen cellen die voor hematopoëse zijn bepaald bij zoogdieren direct na implantatie (zesde dag van de zwangerschap), wanneer morfologische tekenen van hematopoëtische differentiatie en vermoedelijke hematopoëtische organen nog ontbreken. In dit stadium zijn verspreide cellen van het muizenembryo in staat de hematopoëtische organen van bestraalde ontvangers te repopuleren met de vorming van erytrocyten en lymfocyten die zich onderscheiden van de gastheercellen door respectievelijk het type hemoglobine of glycerofosfaatisomerase, evenals een extra chromosomale marker (Tb) van donorcellen. Bij zoogdieren, zoals bij vogels, verschijnen hematopoëtische cellen gelijktijdig met de dooierzak, vóór de sluiting van het gemeenschappelijke vaatbed, direct in het lichaam van het embryo in de para-aortale splanchnopleura. Hematopoëtische cellen van het AA4.1+-fenotype werden geïsoleerd uit de AGM-regio en gekarakteriseerd als multipotente hematopoëtische cellen die T- en B-lymfocyten, granulocyten, megakaryocyten en macrofagen vormen. Fenotypisch gezien lijken deze multipotente voorlopercellen sterk op de HSC's in het beenmerg van volwassen dieren (CD34+c-kit+). Het aantal multipotente AA4.1+-cellen in alle cellen van de AGM-regio is klein - ze vormen niet meer dan 1/12 van het totale AGM-deel.

In het menselijke embryo is ook een intra-embryonale regio geïdentificeerd met HSC's die homoloog zijn aan de AGM-regio van dieren. Bovendien bevindt meer dan 80% van de multipotente cellen met een hoog proliferatief potentieel zich bij mensen in het embryo, hoewel dergelijke cellen ook in de dooierzak aanwezig zijn. Een gedetailleerde analyse van hun lokalisatie toonde aan dat honderden van dergelijke cellen verzameld zijn in compacte groepen die zich dicht bij het endotheel van de ventrale wand van de dorsale aorta bevinden. Fenotypisch zijn het CD34CD45+Lin-cellen. In de dooierzak, evenals in andere hematopoëtische organen van het embryo (lever, beenmerg), daarentegen, zijn dergelijke cellen enkelvoudig.

Bijgevolg bevat de AGM-regio in het menselijk embryo clusters van hematopoëtische cellen die nauw verbonden zijn met het ventrale endotheel van de dorsale aorta. Dit contact wordt ook op immunochemisch niveau getraceerd: zowel de cellen van de hematopoëtische clusters als de endotheelcellen brengen de vasculaire endotheliale groeifactor (Flt-3-ligand), hun receptoren FLK-1 en STK-1, evenals de transcriptiefactor van leukemiestamcellen tot expressie. In de AGM-regio worden mesenchymale derivaten vertegenwoordigd door een dichte streng afgeronde cellen langs de gehele dorsale aorta die tenascine C tot expressie brengen – een glycoproteïne van de grondsubstantie dat actief betrokken is bij de processen van intercellulaire interactie en migratie.

Multipotente stamcellen van de AGM-regio herstellen na transplantatie snel de hematopoëse in volwassen bestraalde muizen en zorgen voor een langdurige effectieve hematopoëse (tot wel 8 maanden). De auteurs vonden geen cellen met dergelijke eigenschappen in de dooierzak. De resultaten van deze studie worden bevestigd door de gegevens van een ander onderzoek, waaruit bleek dat in embryo's in een vroeg ontwikkelingsstadium (10,5 dagen) de AGM-regio de enige bron is van cellen die voldoen aan de definitie van HSC, waardoor de myeloïde en lymfoïde hematopoëse wordt hersteld bij volwassen bestraalde ontvangers.

De AGM-S3-stromalijn werd geïsoleerd uit het AGM-gebied, waarvan de cellen de generatie van toegewijde voorlopercellen CFU-GM, BFU-E, CFU-E en gemengde kolonievormende eenheden in kweek ondersteunen. Het gehalte van laatstgenoemde tijdens kweek op een feeder-sublaag van AGM-S3-lijncellen neemt 10 tot 80 keer toe. De micro-omgeving van het AGM-gebied bevat dus stromabasiscellen die hematopoëse effectief ondersteunen, waardoor het AGM-gebied zelf mogelijk fungeert als een embryonaal hematopoëtisch orgaan - een bron van definitieve HSC's, dat wil zeggen HSC's die het hematopoëtische weefsel van een volwassen dier vormen.

Uitgebreide immunofenotypering van de cellulaire samenstelling van de AGM-regio toonde aan dat deze niet alleen multipotente hematopoëtische cellen bevat, maar ook cellen die betrokken zijn bij de differentiatie van myeloïde en lymfoïde cellen (T- en B-lymfocyten). Moleculaire analyse van individuele CD34+c-kit+-cellen uit de AGM-regio met behulp van polymerasekettingreactie (PCR) toonde echter alleen activering van bètaglobine- en myeloperoxidasegenen aan, maar niet van lymfoïde genen die coderen voor de synthese van CD34, Thy-1 en 15. Gedeeltelijke activering van afstammingslijnspecifieke genen is kenmerkend voor vroege ontogenetische stadia van de generatie van HSC's en progenitorcellen. Als we bedenken dat het aantal toegewijde progenitorcellen in de AGM-regio van een 10-dagen embryo 2-3 ordegroottes lager ligt dan in de lever, kunnen we stellen dat op de 10e dag van de embryogenese de hematopoëse in de AGM-regio nog maar net begint, terwijl in het belangrijkste hematopoëtische orgaan van de foetus gedurende deze periode de hematopoëtische lijnen zich al hebben ontwikkeld.

In tegenstelling tot eerdere (9-11 dagen) hematopoëtische stamcellen van de dooierzak en de AGM-regio, die de hematopoëtische micro-omgeving van de pasgeborene, maar niet van het volwassen organisme, herbevolken, hebben hematopoëtische stamcellen van de 12-17 dagen oude embryonale lever geen vroege postnatale micro-omgeving meer nodig en bevolken ze de hematopoëtische organen van een volwassen dier niet slechter dan die van een pasgeborene. Na transplantatie van embryonale lever-HSC's had de hematopoëse in bestraalde volwassen ontvangermuizen een polyklonaal karakter. Bovendien werd met behulp van gelabelde kolonies aangetoond dat de werking van de geënte klonen volledig afhankelijk is van de klonale successie die in het volwassen beenmerg wordt waargenomen. Embryonale lever-HSC's, die onder de meest milde omstandigheden zijn gelabeld, zonder voorafgaande stimulatie met exogene cytokinen, bezitten dus al de belangrijkste eigenschappen van volwassen HSC's: ze hebben geen vroege postembryonale micro-omgeving nodig, gaan na transplantatie in een diepe rusttoestand en worden op sequentieel gemobiliseerd tot klonale formatie in overeenstemming met het klonale successiemodel.

Uiteraard is het noodzakelijk om wat dieper in te gaan op het fenomeen van klonale successie. Erytropoëse wordt uitgevoerd door hematopoëtische stamcellen met een hoog proliferatief potentieel en het vermogen om te differentiëren tot alle lijnen van toegewijde voorlopercellen van bloedcellen. Bij normale intensiteit van hematopoëse bevinden de meeste hematopoëtische stamcellen zich in een inactieve toestand en worden ze gemobiliseerd voor proliferatie en differentiatie, waarbij ze sequentieel klonen vormen die elkaar vervangen. Dit proces wordt klonale successie genoemd. Experimenteel bewijs voor klonale successie in het hematopoëtische systeem werd verkregen in studies met HSC's gekenmerkt door retrovirale genoverdracht. Bij volwassen dieren wordt hematopoëse in stand gehouden door vele gelijktijdig functionerende hematopoëtische klonen, derivaten van HSC's. Gebaseerd op het fenomeen van klonale successie is een repopulatiebenadering ontwikkeld voor de identificatie van HSC's. Volgens dit principe wordt er onderscheid gemaakt tussen langdurige hematopoëtische stamcellen (LT-HSC), die in staat zijn het hematopoëtische systeem gedurende het hele leven te herstellen, en kortdurende HSC, die deze functie gedurende een beperkte periode vervullen.

Als we hematopoëtische stamcellen beschouwen vanuit het perspectief van de repopulatiebenadering, dan is de bijzonderheid van hematopoëtische cellen van de embryonale lever hun vermogen om kolonies te vormen die aanzienlijk groter zijn dan die in de groei van navelstrengbloed of beenmerg-HSC's, en dit geldt voor alle soorten kolonies. Dit feit alleen al wijst op een hoger proliferatief potentieel van hematopoëtische cellen van de embryonale lever. Een unieke eigenschap van hematopoëtische stamcellen van de embryonale lever is een kortere celcyclus in vergelijking met andere bronnen, wat van groot belang is voor de effectiviteit van hematopoëtische orgaanrepopulatie tijdens transplantatie. Analyse van de cellulaire samenstelling van de hematopoëtische suspensie, verkregen uit bronnen van een volwassen organisme, geeft aan dat nucleaire cellen in alle stadia van de ontogenese overwegend bestaan uit uiteindelijk gedifferentieerde cellen, waarvan het aantal en fenotype afhangen van de ontogenetische leeftijd van de donor van het hematopoëtische weefsel. Met name suspensies van mononucleaire cellen uit beenmerg en navelstrengbloed bestaan voor meer dan 50% uit volwassen cellen van de lymfoïde reeks, terwijl het hematopoëtische weefsel van de embryonale lever minder dan 10% lymfocyten bevat. Bovendien worden de cellen van de myeloïde lijn in de embryonale en foetale lever voornamelijk vertegenwoordigd door de erytroïde reeks, terwijl in navelstrengbloed en beenmerg granulocyt-macrofaagelementen de overhand hebben.

Het is ook belangrijk dat de embryonale lever een complete set van de vroegste hematopoëtische voorlopercellen bevat. Hieronder vallen erytroïde, granulopoëtische, megakaryopoëtische en multilineage kolonievormende cellen. Hun primitievere voorlopercellen - LTC-IC - kunnen in vitro gedurende 5 weken of langer prolifereren en differentiëren en behouden ook hun functionele activiteit na inplanting in het lichaam van de ontvanger tijdens allogene en zelfs xenogene transplantaties bij immuundeficiënte dieren.

Het biologische voordeel van de overheersing van erytroïde cellen in de embryonale lever (tot 90% van het totale aantal hematopoëtische elementen) is de noodzaak om het snel toenemende bloedvolume van de zich ontwikkelende foetus te voorzien van erytrocytenmassa. In de embryonale lever wordt de erytropoëse vertegenwoordigd door nucleaire erytroïde voorlopercellen van verschillende rijpheidsgraden die foetaal hemoglobine (a2u7) bevatten, dat door zijn hogere affiniteit voor zuurstof zorgt voor een effectieve absorptie van dit laatste uit materneel bloed. Intensivering van de erytropoëse in de embryonale lever gaat gepaard met een lokale toename van de synthese van erytropoëtine (EPO). Het is opmerkelijk dat de aanwezigheid van erytropoëtine alleen voldoende is voor de realisatie van het hematopoëtische potentieel van hematopoëtische cellen in de embryonale lever, terwijl een combinatie van cytokinen en groeifactoren bestaande uit EPO, SCF, GM-CSF en IL-3 vereist is voor de betrokkenheid van HSC's uit beenmerg en navelstrengbloed bij erytropoëse. Tegelijkertijd reageren vroege hematopoëtische voorlopercellen, geïsoleerd uit de embryonale lever, die geen receptoren voor EPO hebben, niet op exogeen erytropoëtine. Voor de inductie van erytropoëse in een suspensie van mononucleaire cellen van de embryonale lever is de aanwezigheid van meer geavanceerde erytropoëtine-gevoelige cellen met het CD34+CD38+-fenotype, die de EPO-receptor tot expressie brengen, noodzakelijk.

In de literatuur bestaat nog steeds geen consensus over de ontwikkeling van hematopoëse in de embryonale periode. De functionele betekenis van het bestaan van extra- en intra-embryonale bronnen van hematopoëtische stamcellen is nog niet vastgesteld. Er bestaat echter geen twijfel over dat de lever bij de menselijke embryogenese het centrale orgaan voor hematopoëse is en in de 6e tot 12e week van de zwangerschap de belangrijkste bron vormt van hematopoëtische stamcellen die de milt, thymus en het beenmerg bevolken. DDR's zorgen voor de uitvoering van de corresponderende functies in de pre- en postnatale ontwikkelingsfase.

Nogmaals, de embryonale lever wordt gekenmerkt door het hoogste gehalte aan HSC's vergeleken met andere bronnen. Ongeveer 30% van de CD344-cellen in de embryonale lever heeft het CD38-fenotype. Tegelijkertijd bedraagt het aantal lymfoïde voorlopercellen (CD45+) in de vroege stadia van hematopoëse in de lever niet meer dan 4%. Er is vastgesteld dat, naarmate de foetus zich ontwikkelt, van 7 tot 17 weken zwangerschap, het aantal B-lymfocyten progressief toeneemt met een maandelijkse "stap" van 1,1%, terwijl het aantal HSC's permanent afneemt.

De functionele activiteit van hematopoëtische stamcellen hangt ook af van de embryonale ontwikkelingsfase van hun bron. De studie naar de kolonievormende activiteit van levercellen van menselijke embryo's na 6-8 en 9-12 weken zwangerschap tijdens kweek in een semi-vloeibaar medium in aanwezigheid van SCF, GM-CSF, IL-3, IL-6 en EPO toonde aan dat het totale aantal kolonies 1,5 keer hoger is bij het zaaien van HSC's van embryonale lever in vroege stadia van ontwikkeling. Tegelijkertijd is het aantal myelopoëtische voorlopercellen zoals CFU-GEMM in de lever na 6-8 weken embryogenese meer dan drie keer hoger dan hun aantal na 9-12 weken zwangerschap. Over het algemeen was de kolonievormende activiteit van hematopoëtische levercellen van embryo's in het eerste trimester van de zwangerschap significant hoger dan die van foetale levercellen in het tweede trimester van de zwangerschap.

Bovenstaande gegevens geven aan dat de embryonale lever zich aan het begin van de embryogenese niet alleen onderscheidt door een verhoogd gehalte aan vroege hematopoëtische stamcellen, maar dat de hematopoëtische cellen ook gekenmerkt worden door een breder spectrum aan differentiatie in verschillende cellijnen. Deze kenmerken van de functionele activiteit van hematopoëtische stamcellen van de embryonale lever kunnen een zekere klinische betekenis hebben, aangezien hun kwalitatieve kenmerken ons een uitgesproken therapeutisch effect laten verwachten bij transplantatie van zelfs een klein aantal cellen dat in de vroege stadia van de zwangerschap is verkregen.

Desalniettemin blijft het probleem van de hoeveelheid hematopoëtische stamcellen die nodig is voor een effectieve transplantatie open en relevant. Er worden pogingen gedaan om dit op te lossen door gebruik te maken van het hoge potentieel van zelfreproductie van hematopoëtische cellen van de embryonale lever in vitro, wanneer deze worden gestimuleerd door cytokines en groeifactoren. Met constante perfusie van vroeg-embryonale lever-HSC's in een bioreactor is het na 2-3 dagen mogelijk om een hoeveelheid hematopoëtische stamcellen te verkrijgen die 15 keer hoger is dan hun oorspronkelijke niveau. Ter vergelijking: onder dezelfde omstandigheden zijn minstens twee weken nodig om een 20-voudige toename van de output van menselijke navelstrengbloed-HSC's te bereiken.

De embryonale lever onderscheidt zich dus van andere bronnen van hematopoëtische stamcellen door een hoger gehalte aan zowel toegewijde als vroege hematopoëtische stamcellen. In kweek met groeifactoren vormen embryonale levercellen met het CD34+CD45Ra1 CD7110W-fenotype 30 keer meer kolonies dan vergelijkbare navelstrengbloedcellen en 90 keer meer dan HSC's uit beenmerg. De meest uitgesproken verschillen in de genoemde bronnen zijn te vinden in het gehalte aan vroege hematopoëtische stamcellen die gemengde kolonies vormen - de hoeveelheid CFU-GEMM in de embryonale lever is respectievelijk 60 en 250 keer groter dan die in navelstrengbloed en beenmerg.

Het is ook belangrijk dat tot de 18e week van de embryonale ontwikkeling (de periode waarin de hematopoëse in het beenmerg begint) meer dan 60% van de levercellen betrokken is bij de implementatie van de hematopoëtische functie. Omdat de menselijke foetus tot de 13e week van de ontwikkeling geen thymus en dus ook geen thymocyten heeft, vermindert transplantatie van hematopoëtische cellen uit embryonale lever van 6-12 weken zwangerschap het risico op een "graft-versus-host"-reactie aanzienlijk en is er geen histocompatibele donor nodig, omdat het hematopoëtisch chimerisme hierdoor relatief eenvoudig te bereiken is.