Hematopoëtische stamcellen uit navelstrengbloed

Navelstrengbloed is een goede bron van hematopoëtische stamcellen vanwege het proliferatieve potentieel en de repopulatiecapaciteit van hematopoëtische cellen. Het is herhaaldelijk aangetoond dat navelstrengbloed tegen de geboorte een voldoende groot aantal zwak gecommitteerde hematopoëtische voorlopercellen bevat. Sommige auteurs zijn van mening dat het voordeel van hematopoëtische stamceltransplantatie uit navelstrengbloed is dat er geen behoefte is aan een donor die compatibel is met HLA-antigenen. Volgens hen veroorzaakt de onrijpheid van het immuunsysteem van de pasgeborene een verminderde functionele activiteit van immunocompetente cellen en daardoor een lagere incidentie van ernstige graft-versus-hostziekte dan bij beenmergtransplantatie. Tegelijkertijd is de overlevingskans van een navelstrengbloedtransplantatie niet lager dan die van beenmergcellen, zelfs niet bij gebruik van een kleiner aantal HSC's per kg lichaamsgewicht van de patiënt. Wij zijn echter van mening dat de kwesties omtrent het optimale aantal getransplanteerde navelstrengbloedcellen dat nodig is voor een effectieve inplanting in het lichaam van de ontvanger, hun immunologische compatibiliteit en een aantal andere aspecten van het probleem van transplantatie van hematopoëtische stamcellen uit navelstrengbloed een grondiger onderzoek vereisen.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ]

Het verkrijgen van hematopoëtische stamcellen uit navelstrengbloed

De procedure voor het verkrijgen van hematopoëtische stamcellen uit navelstrengbloed vereist dat deze direct na de geboorte van het kind worden afgenomen en van de placenta worden gescheiden, zowel in utero als ex utero, en ook tijdens een keizersnede, maar ook ex utero. Het is aangetoond dat als de tijd tussen de geboorte en het loskomen van de placenta van de pasgeborene wordt teruggebracht tot 30 seconden, het verkregen volume navelstrengbloed gemiddeld met 25-40 ml toeneemt. Als deze procedure later wordt uitgevoerd, gaat er evenveel bloed verloren. Het is vastgesteld dat vroegtijdige scheiding van het kind van de placenta geen negatieve gevolgen heeft voor de pasgeborene.

Het Russische onderzoeksinstituut voor hematologie en transfusiologie heeft effectieve en goedkope technologieën ontwikkeld voor het verkrijgen van navelstrengbloed, zowel tijdens een normale geboorte ((70,2+25,8) ml) als tijdens een keizersnede ((73,4+25,1) ml). Er is een methode voorgesteld voor het scheiden van navelstrengbloed met een voldoende hoge opbrengst aan kernhoudende en mononucleaire cellen - respectievelijk (83,1+9,6) en (83,4+14,1)%. Er is een methode verbeterd voor het cryopreserveren van navelstrengbloed, die een hoge conservering van mononucleaire cellen en CFU-GM garandeert - respectievelijk (96,8+5,7) en (89,6+22,6)%. De efficiëntie van de drainagemethode voor het verzamelen van navelstrengbloed met behulp van de Kompoplast-300-container (Rusland) is bepaald. De auteurs verzamelden navelstrengbloed onmiddellijk na de geboorte van het kind en de scheiding van de placenta, onder omstandigheden van de placentaplaatsing in utero of ex utero. Vóór de punctie van de navelstrengader werd de navelstreng eenmaal behandeld met 5% jodiumtinctuur en vervolgens tweemaal met 70% ethylalcohol. Het bloed stroomde spontaan door de verbindingsslangen in de container. De afnameprocedure duurde niet langer dan 10 minuten. Het gemiddelde volume van 66 navelstrengbloedmonsters verzameld door drainage was (72 + 28) ml en het aantal leukocyten in het gemiddelde totale monstervolume was (1,1 + 0,6) x 107. Bij analyse van navelstrengbloed op steriliteit (bacteriële besmetting, HIV-1, hepatitis B- en C-virussen, syfilis en cytomegalovirusinfectie) werden IgG-antilichamen tegen het hepatitis C-virus slechts in één monster gedetecteerd. In een ander onderzoek werd de placenta direct na de geboorte met de foetuszijde naar beneden op een speciaal frame geplaatst, waarna de navelstreng werd behandeld met een 5% jodiumoplossing en 75% ethylalcohol. De navelstrengader werd leeggezogen met een naald uit een transfusiesysteem (G16). Er stroomde spontaan bloed in de container. Het gemiddelde volume bloed dat op deze manier werd verzameld, was (55 + 25) ml. In het werk van G. Kogler et al. (1996) werd navelstrengbloed verzameld met behulp van een gesloten methode en werden grote hoeveelheden bloed verkregen - gemiddeld (79 + 26) ml. De auteurs merken op dat van de 574 navelstrengbloedmonsters ongeveer 7% minder dan 40 ml bloed bevatte, waardoor ze niet voor transplantatie konden worden gebruikt. K. Isoyama et al. (1996), die navelstrengbloed verzamelden door middel van actieve exfusie met behulp van spuiten, verkregen gemiddeld 69,1 ml bloed (het volume navelstrengbloed varieerde van 15 tot 135 ml). Tot slot slaagden A. Abdel-Mageed PI et al. (1997) erin om gemiddeld 94 ml navelstrengbloed (van 56 tot 143 ml) te verkrijgen door middel van katheterisatie van de navelstrengader.

Om het risico op iatrogene infectie en besmetting met maternale secreties te verminderen, is een gesloten bloedafnamesysteem ontwikkeld, gebaseerd op het veelgebruikte transfusiesysteem van Baxter Healthcare Corp., Deerfield, Illinois (VS). Dit systeem bevat 62,5 ml CPDA (citraat-fosfaat-dextrose met adenine) als anticoagulans. De technologie voor het verkrijgen van het materiaal is van primair belang voor het bereiden van een hoogwaardig monster wat betreft volume, inhoud en zuiverheid van de celsuspensie. Van de bestaande methoden voor het verzamelen van navelstrengbloed, die conventioneel worden ingedeeld in gesloten, halfopen en open systemen, verdient het eerste de voorkeur, omdat het gesloten systeem het risico op microbiële besmetting van het materiaal en besmetting van de celsuspensie met maternale cellen aanzienlijk vermindert.

A. Nagler et al. (1998) voerden een vergelijkende analyse uit van de efficiëntie van alle drie systemen voor het verzamelen van navelstrengbloed. In de eerste variant werd de procedure uitgevoerd in een gesloten systeem door bloed direct in een container te exfoliëren. In de tweede variant werd navelstrengbloed verkregen door actieve exfusie van bloed met een MP1-spuit, gevolgd door het spoelen van de placentaire venen en gelijktijdige drainage van bloed in een container (open methode). In de derde variant werd bloed verzameld in een semi-open systeem door het actief te extraheren met spuiten en het door de navelstrengslagader te spoelen met gelijktijdige exfusie in een container. In de eerste variant verkregen de auteurs navelstrengbloed in een volume van (76,4 + 32,1) ml met een leukocytengehalte van (10,5 + 3,6) x ¹⁰⁶ in 1 ml bloed. In de tweede variant waren de corresponderende indicatoren (174,4 + 42,8) ml en (8,8 + 3,4) x 106 ^/ ml; in de derde - (173,7 + 41,3) ml en (9,3 + 3,8) x 106 ^/ ml. De meest voorkomende infectie van navelstrengbloedmonsters werd waargenomen bij gebruik van een open systeem. Er werd een directe correlatie vastgesteld tussen de massa van de placenta en het afgenomen bloedvolume: naarmate de massa van de placenta toeneemt, neemt de hoeveelheid afgenomen bloed toe.

Na het verzamelen van navelstrengbloed volgt de scheidingsfase: isolatie van mononucleaire cellen en zuivering van de celsuspensie uit erytrocyten. Onder experimentele omstandigheden worden cellen met een celkern geïsoleerd door sedimentatie met methylcellulose tijdens de lysis van erytrocyten met ammoniumchloride. Methylcellulose mag echter niet worden gebruikt voor klinische doeleinden, aangezien het verlies aan hematopoëtische stamcellen hierop 50-90% bereikt. Lysis van erytrocyten wordt ook vrijwel nooit klinisch uitgevoerd vanwege de grote volumes van de werkoplossing, hoewel het isolatiepercentage van cellen met een celkern met het CD34+-fenotype, evenals van progenitorcellen met de CFU-GM- en CFU-GEMM-functies op deze manier aanzienlijk hoger is. De opkomst van een nieuwe methode voor het isoleren van mononucleaire cellen in een dichtheidsgradiënt, buyant density solution (BDS72), wordt gerapporteerd. Deze stof heeft de volgende fysiologische parameters: pH - 7,4, osmolaliteit - 280 mOsm/kg, dichtheid - 1,0720 g/ml. Volgens de auteurs kan het gebruikt worden om tot 100% van de CD34-positieve cellen te isoleren en 98% van de erytrocyten te verwijderen. BDS72 wordt echter nog niet klinisch gebruikt.

In de goedgekeurde methoden voor het isoleren van cellen met een kern uit navelstrengbloed wordt doorgaans een 10% hydroxyethylzetmeeloplossing of een 3% gelatineoplossing gebruikt. De efficiëntie van sedimentatie van erytrocyten en isolatie van cellen met een kern is in beide gevallen ongeveer gelijk. Wanneer gelatine echter als sedimentatiemiddel wordt gebruikt, is het mogelijk om een iets grotere hoeveelheid CFU-GM te verkrijgen dan met hydroxyethylzetmeel. Aangenomen wordt dat de verschillen in efficiëntie van CFU-GM-isolatie te wijten zijn aan verschillende sedimentatiesnelheden van individuele fracties van cellen met een kern of aan het vermogen van hydroxyethylzetmeelmoleculen om te worden geabsorbeerd op het oppervlak van hematopoëtische celreceptoren en daardoor hun gevoeligheid voor koloniestimulerende factoren die worden gebruikt bij het in vitro kweken van CFU-GM te blokkeren. Niettemin kunnen beide sedimentatoren zeer geschikt zijn voor het isoleren van cellen met een kern bij het opzetten van grootschalige navelstrengbloedbanken.

Methoden voor het scheiden en cryopreserveren van navelstrengbloed verschillen in principe niet van die welke worden gebruikt bij het werken met hematopoëtische stamcellen uit perifeer bloed en beenmerg van volwassen donoren. Maar bij het voorbereiden van een groot aantal navelstrengbloedmonsters voor de opslag, moeten de scheidingsmethoden allereerst goedkoop zijn. Daarom worden momenteel helaas, voor klinische doeleinden, reeds beproefde routinematige methoden voor het isoleren en cryopreserveren van navelstrengbloedcellen gebruikt. Effectievere, maar kostbare methoden blijven het lot van experimentatoren.

Over het algemeen zijn criteria voor het beoordelen van het aantal hematopoëtische cellen en eisen voor het onderzoeken van navelstrengbloedmonsters om infectieuze agentia te identificeren, goedgekeurd. Om de veiligheid van hematopoëtische celtransplantatie van navelstrengbloed te garanderen, moeten alle bloedmonsters primair worden onderzocht op hematogene infecties en genetische aandoeningen. Een aantal auteurs beveelt aanvullende speciale methoden aan voor het onderzoeken van navelstrengbloed om genetische aandoeningen zoals athalassemie, sikkelcelanemie, adenosinedeaminasedeficiëntie, Bruton-agammaglobulinemie, de ziekte van Hurler en Ponter te diagnosticeren.

Volgens de aanbevelingen van L. Ticheli en co-auteurs (1998) moet elk navelstrengbloedmonster worden getest op cellen met een celkern, CD34-positieve cellen en CFU-GM, moet HLA-typering worden uitgevoerd en moet de bloedgroep worden bepaald op basis van ABO en de bijbehorende Rh-factor. Daarnaast moeten bacteriologische kweek en serologische tests op hiv en cytomegalovirusinfectie, HBsAg, virale hepatitis C, HTLY-I en HTLV-II (humane T-celleukemie), syfilis en toxoplasmose worden uitgevoerd. Polymerasekettingreactie (PCR) voor cytomegalovirus- en hiv-infectie is verplicht.

De procedure voor het verkrijgen van navelstrengbloed moet strikt volgens de principes van de medische bio-ethiek worden uitgevoerd. Voordat bloed wordt afgenomen, is toestemming van de zwangere vrouw vereist. Een voorafgaand gesprek met de zwangere vrouw om geïnformeerde toestemming te verkrijgen voor alle handelingen, van bloedafname tot het invullen van de documentatie, wordt uitsluitend door medisch personeel gevoerd. Het is in geen geval toegestaan dat deze procedures worden uitgevoerd door personeel met een biologische, chemische, farmaceutische of andere niet-medische opleiding, vanwege de schending van de vastgestelde normen van bio-ethiek en mensenrechten. In geval van positieve tests voor HBsAg-dragerschap, de aanwezigheid van antilichamen tegen de pathogenen van hepatitis C, hiv-infectie en syfilis, wordt navelstrengbloed niet afgenomen en worden monsters van reeds afgenomen bloed afgewezen en vernietigd. Opgemerkt dient te worden dat het dragen van latente infecties bij pasgeborenen veel minder vaak voorkomt dan bij volwassenen. De kans op hematogene overdracht en ontwikkeling van infectieuze complicaties tijdens infusie van hematopoëtische cellen uit navelstrengbloed is daardoor aanzienlijk lager dan bij gebruik van volwassen donorbeenmerg voor transplantatie.

Een belangrijk aspect van het klinisch gebruik van navelstrengbloed is de evaluatie van transplantaties. Deze evaluatie is gebaseerd op het bepalen van de hoeveelheid hematopoëtische stamcellen in een navelstrengbloedmonster en de benodigde celdoses voor transplantatie. Momenteel zijn er nog geen normen ontwikkeld voor de optimale hoeveelheid navelstrengbloedcellen die nodig zijn voor transplantatie. Er is geen algemeen aanvaarde visie, zelfs niet over routinematige parameters zoals het aantal CD34-positieve cellen en CFU-GM. Sommige auteurs evalueren het potentieel van hematopoëtische cellen door langetermijnkweken te analyseren met bepaling van het gehalte aan kolonievormende eenheden die veel voorkomen in granulocyten, erytrocyten, monocyten en megakaryocyten - CFU-GEMM.

In een klinische setting omvat de standaardevaluatie van een navelstrengbloedtransplantatie echter doorgaans alleen de bepaling van het aantal cellen met een celkern of mononucleaire cellen.

Opslag van hematopoëtische stamcellen uit navelstrengbloed

Er zijn ook enkele problemen met de technologie voor het bewaren van hematopoëtische cellen in navelstrengbloed. Bij het cryopreservatie van hematopoëtische stamcellen is het, om de optimale invriesmethode te bereiken, noodzakelijk om het volume navelstrengbloed zoveel mogelijk te beperken en erytrocyten vooraf te verwijderen om hemolyse en het risico op het ontwikkelen van een incompatibiliteitsreactie voor erytrocytantigenen (ABO, Rh) te voorkomen. Verschillende methoden voor het isoleren van cellen met een celkern zijn hiervoor geschikt. Begin jaren 90 van de vorige eeuw was de meest gebruikte methode het isoleren van cellen met een celkern in een dichtheidsgradiënt op basis van Ficoll met een dichtheid van 1,077 g/ml of Percoll met een dichtheid van 1,080 g/ml. Scheiding van navelstrengbloed in een dichtheidsgradiënt maakt de isolatie van voornamelijk mononucleaire cellen mogelijk, maar leidt tot aanzienlijke verliezen van hematopoëtische stamcellen - tot 30-50%.

De sedimentatie-efficiëntie van hydroxyethylzetmeel bij het isoleren van hematopoëtische cellen uit navelstrengbloed wordt verschillend beoordeeld. Sommige auteurs wijzen op de lage scheidingskwaliteit met deze methode, terwijl andere onderzoekers juist de voorkeur geven aan het isoleren van HSC uit navelstrengbloed met een 6% hydroxyethylzetmeeloplossing. Tegelijkertijd wordt de hoge sedimentatie-efficiëntie van hematopoëtische cellen benadrukt, die volgens sommige gegevens varieert van 84% tot 90%.

Voorstanders van een ander standpunt zijn van mening dat vrijwel alle fractioneringsmethoden gepaard gaan met grote verliezen aan cellen met een celkern en stellen voor om scheiding door middel van centrifugatie uit te voeren, waarbij het navelstrengbloed in drie fracties wordt verdeeld: erytrocyten, leukocytenring en plasma. Door cellen op deze manier te isoleren, ontdekten de auteurs dat het gehalte aan mononucleaire cellen, vroege hematopoëtische voorlopercellen en cellen met het CD34+-immunofenotype uiteindelijk respectievelijk 90, 88 en 100% van het oorspronkelijke niveau bedroeg. Vergelijkbare waarden voor de toename van navelstrengbloedcellen die met deze methode werden gezuiverd, werden ook door andere onderzoekers verkregen: na sedimentatie werd 92% van de cellen met een celkern, 98% van de mononucleaire cellen, 96% van de CD34-positieve cellen en 106% van de kolonievormende eenheden geïsoleerd.

Eind jaren negentig werd gelatine op grote schaal gebruikt als sedimentatiemiddel. In de klinische praktijk wordt gelatine sinds 1994 gebruikt voor de isolatie van hematopoëtische stamcellen uit navelstrengbloed. Bij gebruik van een 3% gelatine-oplossing bedraagt de efficiëntie van het isoleren van cellen met een celkern 88-94%. Het grootschalige gebruik van gelatine bij het opzetten van een navelstrengbloedbank heeft zijn voordelen ten opzichte van andere sedimentatiemiddelen bevestigd. Een vergelijkende analyse van de efficiëntie van alle bovengenoemde methoden voor het isoleren van cellen met een celkern onder de omstandigheden van sequentieel gebruik in elk van de geteste navelstrengbloedmonsters heeft aangetoond dat een 3% gelatine-oplossing het optimale sedimentatiemiddel is wat betreft de opbrengst van mononucleaire cellen met het CD34+/CD45+-fenotype, evenals wat betreft het aantal CFU-GM en CFU-GEMM. Methoden waarbij gebruik werd gemaakt van een Ficoll-dichtheidsgradiënt en van hydroxyethylzetmeel en methylcellulose, waren aanzienlijk minder effectief. Het verlies aan hematopoëtische cellen bedroeg hierbij 60%.

De toename van het aantal transplantaties van stamcellen uit navelstrengbloed hangt niet alleen samen met de ontwikkeling van methoden voor hun acquisitie, maar ook met de opslag ervan. Er zijn veel problemen die direct verband houden met de voorbereiding van navelstrengbloed voor langdurige opslag en de keuze van de optimale technologie voor cryopreservatie van de monsters. Voorbeelden hiervan zijn de haalbaarheid van scheidingsprocedures, het gebruik van verschillende cryopreservatiemedia en de toepassing van methoden voor het prepareren van ontdooide cellen voor transplantatie. Het transport van inheemse navelstrengbloedmonsters vindt vaak plaats vanuit regio's die ver verwijderd zijn van hematologische centra. In dit verband rijst de vraag naar acceptabele bewaartermijnen voor navelstrengbloed vanaf het moment van acquisitie tot het begin van de cryopreservatie, wat van bijzonder belang is bij het opzetten van navelstrengbloedbanken.

Een onderzoek naar de functionele activiteit van hematopoëtische cellen in navelstrengbloed na langdurige opslag (tot 12 jaar) in vloeibare stikstof heeft aangetoond dat ongeveer 95% van de hematopoëtische cellen gedurende deze periode hun hoge proliferatieve vermogen niet verliest. In het werk van S. Yurasov en co-auteurs (1997) werd bewezen dat het bewaren van navelstrengbloed bij kamertemperatuur (22 °C) of bij 4 °C gedurende 24 en 48 uur de levensvatbaarheid van hematopoëtische cellen niet significant vermindert, die respectievelijk 92 en 88% van het oorspronkelijke niveau bedraagt. Echter, indien de bewaarperiode wordt verlengd tot drie dagen, neemt het aantal levensvatbare cellen met een celkern in het navelstrengbloed aanzienlijk af. Tegelijkertijd hebben andere studies aangetoond dat bij opslag gedurende 2-3 dagen bij 22 of 4 °C, de levensvatbaarheid van volwassen granulocyten, en niet die van hematopoëtische cellen, het meest wordt aangetast.

De levensvatbaarheid van hematopoëtische stamcellen uit navelstrengbloed kan negatief worden beïnvloed door componenten van navelstrengbloedafnamesystemen. Een analyse van het effect van verschillende anticoagulantia, waarvan het werkingsmechanisme berust op calciumionbinding (ACD, EDTA, XAPD-1), op hematopoëtische stamcellen onder omstandigheden van 24 tot 72 uur opslag van navelstrengbloed, toonde hun negatieve effect op de levensvatbaarheid van cellen met een celkern. In dit verband bevelen de auteurs het gebruik van PBS (fosfaatbufferoplossing) aan met de toevoeging van natieve heparine zonder conserveermiddel in een concentratie van 20 U/ml. Dit maakt het volgens hen mogelijk om de bewaarperiode van ongefractioneerd navelstrengbloed te verlengen tot 72 uur en de functionele activiteit van kolonievormende eenheden te behouden. Een onderzoek naar de veiligheid van CFU-GM en CFU-G toonde echter aan dat de bewaartijd van navelstrengbloed vóór cryopreservatie niet langer mag zijn dan negen uur. Uiteraard geldt hierbij het principe dat, indien er tegenstrijdige gegevens beschikbaar zijn, de minimale aanbevolen bewaartermijn voor navelstrengbloed moet worden aangehouden en dat zo snel mogelijk met geprogrammeerd invriezen van de geïsoleerde cellen moet worden begonnen.

Bij het invriezen van hematopoëtische stamcellen uit navelstrengbloed wordt doorgaans een 10% DMSO-oplossing gebruikt als cryoprotectant. Naast het uitgesproken cryoprotectieve effect heeft dimethylsulfoxide in een dergelijke concentratie echter ook een direct cytotoxisch effect, zelfs bij minimale blootstelling aan hematopoëtische cellen uit navelstrengbloed. Om het cytotoxische effect van DMSO te verminderen, wordt een blootstellingstemperatuur van nul graden gebruikt, wordt de snelheid van alle handelingen verhoogd en worden na het ontdooien van de navelstrengbloedmonsters meerdere wasbeurten uitgevoerd.

Sinds 1995 ontwikkelt het Instituut voor Hematologie en Transfusiologie van de Academie voor Medische Wetenschappen van Oekraïne een wetenschappelijke richting gericht op een uitgebreide studie van navelstrengbloed als alternatieve bron van hematopoëtische stamcellen. Met name zijn er nieuwe technologieën ontwikkeld voor cryopreservatie bij lage temperatuur van hematopoëtische cellen uit ongefractioneerd en gefractioneerd navelstrengbloed. Laagmoleculair medisch polyvinylpyrrolidon wordt gebruikt als cryoprotectant. De cryopreservatiemethode van ongefractioneerd navelstrengbloed is gebaseerd op een originele technologie voor de prepreparatie van cellen voor invriezing en een methode voor speciale verwerking van celsuspensies direct vóór transplantatie.

Een van de belangrijkste factoren die de functionele activiteit van ingevroren hematopoëtische stamcellen beïnvloedt, is de afkoelsnelheid van de celsuspensie, met name tijdens de kristallisatiefase. Een softwarematige aanpak voor het oplossen van het probleem van invriessnelheid en -tijd biedt uitstekende mogelijkheden voor het ontwikkelen van eenvoudige en zeer effectieve cryopreservatiemethoden, zonder de celsuspensie vóór transplantatie van cryoprotectors te hoeven wassen.

De gevaarlijkste fasen voor de levensvatbaarheid van cellen tijdens hun preparatie zijn de fasen van direct invriezen en ontdooien. Bij het invriezen van hematopoëtische cellen kan een aanzienlijk deel ervan worden vernietigd tijdens de overgang van het intercellulaire medium van de vloeibare naar de vaste fase - kristallisatie. Om het percentage celdood te verminderen, worden cryoprotectoren gebruikt, waarvan de werkingsmechanismen en de cryoprotectieve effectiviteit voldoende worden beschreven in de wetenschappelijke literatuur.

Een veelbelovende richting voor het optimaliseren van cryopreservatiemethoden voor beenmerg- en navelstrengbloedcellen is de combinatie van lage concentraties van verschillende cryoprotectoren met verschillende werkingsmechanismen in één oplossing. Bijvoorbeeld DMSO dat op intracellulair niveau werkt en hydroxyethylzetmeel of albumine, die een extracellulair beschermend effect hebben.

Voor cryopreservatie van navelstrengbloedcellen wordt traditioneel een 20% DMSO-oplossing gebruikt. Deze wordt langzaam in een ijsbad gegoten, onder constant mechanisch roeren, totdat een gelijke (1:1) verhouding van het cryoprotectant- en celsuspensievolume is bereikt. De uiteindelijke concentratie dimethylsulfoxide is 10%. De celsuspensie wordt vervolgens in een geprogrammeerde cryogene unit gekoeld met een snelheid van GS/min tot -40 °C, waarna de koelsnelheid wordt verhoogd tot 10 °C/min. Na het bereiken van -100 °C wordt de container met de celsuspensie in vloeibare stikstof (-196 °C) geplaatst. Met deze cryopreservatietechniek bereikt de conservering van functioneel actieve mononucleaire cellen na ontdooiing 85% van de oorspronkelijke waarde.

Modificaties van cryopreservatiemethoden zijn gericht op het verlagen van de DMSO-concentratie door toevoeging van hydroxyethylzetmeel (de eindconcentraties van dimethylsulfoxide en hydroxyethylzetmeel bedragen respectievelijk 5 en 6%). Een hoge efficiëntie van een dergelijke combinatie van cryoprotectoren wordt waargenomen bij het invriezen van een suspensie van myeloïde cellen, en met niet minder cytoprotectie dan bij gebruik van slechts een 10%-oplossing van dimethylsulfoxide. Het aantal levensvatbare cellen met een kern bereikte 96,7% van het oorspronkelijke niveau en hun functionele activiteit, geschat op basis van het aantal CFU-GM, was 81,8%.

Bij gebruik van een dimethylsulfoxide-oplossing in concentraties van 5 tot 10% in combinatie met 4% hydroxyethylzetmeel (eindconcentratie), bleek de veiligheid van CD34-positieve cellen in dergelijke concentraties dimethylsulfoxide vrijwel onveranderd te blijven. Tegelijkertijd wordt bij een daling van de dimethylsulfoxideconcentratie van 5 naar 2,5% massale celdood van navelstrengbloedcellen waargenomen - het aantal levensvatbare celeenheden neemt af van 85,4 naar 12,2%. Andere auteurs kwamen eveneens tot de conclusie dat het juist 5% en 10% dimethylsulfoxide-oplossingen (in de versie van de auteur - in combinatie met autoloog serum) zijn die de maximale cytoprotectie bieden tijdens cryopreservatie van HSC's uit navelstrengbloed. Bovendien wordt een hoge conservering van achtereenvolgens ingevroren en ontdooide cellen waargenomen in het geval van een combinatie van 5 of 10% dimethylsulfoxide met een 4% hydroxyethylzetmeeloplossing, met name bij een gecontroleerde koelsnelheid van GS/min. In een andere studie werd een cryoprotectieve oplossing gebruikt bestaande uit drie ingrediënten - DMSO, gezuiverd humaan albumine en RPMI-medium in een verhouding van 1:4:5. Deze werd toegevoegd aan de celsuspensie in een gelijke volumeverhouding (de uiteindelijke concentratie dimethylsulfoxide was 5%). Na ontdooiing in een waterbad bij een temperatuur van +4 GS bedroeg de conservering van CFU-GM meer dan 94%.

Sommige auteurs suggereren het gebruik van ongefractioneerd navelstrengbloed voor cryopreservatie, aangezien aanzienlijke hoeveelheden hematopoëtische cellen verloren gaan tijdens het verwijderen van rode bloedcellen. In deze variant wordt een 10%-oplossing van dimethylsulfoxide gebruikt om mononucleaire cellen te beschermen tegen de schadelijke effecten van cryokristallisatie. Het invriezen gebeurt met een constante koelsnelheid van GS/min tot -80 °C, waarna de navelstrengbloedcelsuspensie in vloeibare stikstof wordt gebracht. Deze invriesmethode resulteert in gedeeltelijke lysis van rode bloedcellen, waardoor bloedmonsters niet gefractioneerd hoeven te worden. Na ontdooiing wordt de celsuspensie van vrije hemoglobine en dimethylsulfoxide gewassen in een oplossing van humaan albumine of in het autologe bloedserum van de patiënt en gebruikt voor transplantatie.

De conservering van hematopoëtische stamcellen na ontdooiing van ongefractioneerd navelstrengbloed is weliswaar hoger dan die van gefractioneerd navelstrengbloed. Vanwege de cryostabiliteit van sommige erytrocyten kunnen er echter ernstige posttransfusieproblemen ontstaan door transfusie van ABO-incompatibele erytrocyten. Bovendien neemt het volume van het opgeslagen ongefractioneerde bloed aanzienlijk toe. Vanuit klinisch oogpunt verdient cryopreservatie van eerder geïsoleerde en uit andere celfracties gezuiverde hematopoëtische cellen in navelstrengbloed nog steeds de voorkeur.

In het bijzonder is een methode ontwikkeld voor cryopreservatie van gefractioneerde navelstrengbloedcellen, waarbij erytrocyten kunnen worden verwijderd tijdens de voorbereiding op invriezen. Hierbij wordt een 6%-oplossing van hydroxyethylzetmeel gebruikt als onderdeel van de plasmavervangende oplossing "Stabizol". Na ontdooiing is de op deze manier verkregen celsuspensie klaar voor klinisch gebruik zonder verdere manipulatie.

Er bestaan momenteel veel zeer effectieve methoden voor het cryopreserveren van navelstrengbloed. Het fundamentele verschil is dat bloedmonsters ongefractioneerd worden ingevroren of tijdens de preparatie worden gescheiden in celfracties, en dat kernhoudende cellen zonder toevoeging van erytrocyten worden geprepareerd.

Hematopoëtische stamceltransplantatie uit navelstrengbloed

Eind jaren tachtig en begin jaren negentig werd vastgesteld dat navelstrengbloed, dat de foetus tijdens de zwangerschap in leven houdt, een hoog gehalte aan hematopoëtische stamcellen bevat. De relatieve eenvoud van het verkrijgen van navelstrengbloedcellen en de afwezigheid van duidelijke ethische problemen droegen bij aan het gebruik van navelstrengbloedstamcellen in de praktijk. De eerste succesvolle navelstrengbloedtransplantatie bij een kind met Fanconi-anemie diende als startpunt voor het uitbreiden van het aantal navelstrengbloedstamceltransplantaties en het opzetten van een systeem voor de opslag ervan. In het wereldwijde systeem van navelstrengbloedbanken is het New York Placental Blood Center, dat op de balans staat van het Amerikaanse National Institute of Health, de grootste. Het aantal opgeslagen navelstrengbloedmonsters in deze bank nadert de 20.000. Het aantal ontvangers (voornamelijk kinderen) dat een succesvolle transplantatie heeft ondergaan, groeit eveneens. Volgens het Amerikaanse ministerie van Volksgezondheid bedraagt de periode zonder terugval na een transplantatie bij ontvangers van navelstrengbloed al meer dan 10 jaar.

Dit is niet verrassend, aangezien talrijke studies naar het hematopoëtische potentieel van navelstrengbloed hebben aangetoond dat het qua kwantiteit en kwaliteit van de vroegste stamcellen niet alleen niet onderdoet voor het beenmerg van een volwassene, maar het in sommige opzichten zelfs overtreft. Het hogere proliferatieve potentieel van navelstrengbloedstamcellen is te danken aan de ontogenetische kenmerken van cellulaire signalering, de aanwezigheid van receptoren voor specifieke groeifactoren op de HSC, het vermogen van navelstrengbloedcellen tot autocriene productie van groeifactoren, en de grote omvang en lengte van telomeren.

De genomische en fenotypische kenmerken van hematopoëtische stamcellen uit navelstrengbloed bepalen dus de hoogwaardige kwaliteit van de transplantaatkwaliteit, met een groot potentieel voor herstel van de donorhematopoëse in het lichaam van de ontvanger.

Voordelen van hematopoëtische stamcellen uit navelstrengbloed

Tot de reële voordelen van het gebruik van hematopoëtische stamcellen uit navelstrengbloed voor transplantatie ten opzichte van andere bronnen van hematopoëtische cellen, behoren het vrijwel nulrisico voor de gezondheid van de donor (als we de placenta als zodanig buiten beschouwing laten) en de afwezigheid van algehele anesthesie. Het gebruik van navelstrengbloed vergroot de mogelijkheden voor celtransplantatie dankzij gedeeltelijk HLA-compatibele transplantaten (incompatibiliteit van één tot drie antigenen). Er is een methode ontwikkeld voor het langdurig bewaren van hematopoëtische cellen uit navelstrengbloed in bevroren toestand, waardoor de kans op het verkrijgen van zeldzame HLA-typen toeneemt en de zoektijd naar een HLA-compatibel transplantaat voor allogene transplantatie wordt verkort. Tegelijkertijd wordt het risico op het ontwikkelen van bepaalde latente infecties die via overdraagbare weg worden overgedragen aanzienlijk verminderd. Bovendien ontstaat een goedkope vorm van biologische levensverzekering dankzij de mogelijkheid om navelstrengbloedcellen te gebruiken voor autologe transplantatie.

Echter, vanwege de kleine hoeveelheden bloed die uit de placenta kunnen worden afgenomen (gemiddeld niet meer dan 100 ml), ontstaat het probleem om zoveel mogelijk bloed uit de navelstrengader te verkrijgen, terwijl tegelijkertijd de voorwaarde van minimaal risico op bacteriële besmetting van de afgenomen navelstrengbloedmonsters strikt in acht moet worden genomen.

Primitieve hematopoëtische cellen in navelstrengbloed worden doorgaans geïdentificeerd aan de hand van de aanwezigheid van het CD34-glycofosfoproteïne op hun oppervlak, en op basis van hun functionele eigenschappen door de clonogeniciteit of kolonievorming in vitro te bestuderen. Vergelijkende analyse toonde aan dat in navelstrengbloed en beenmerg het maximale gehalte aan CD34-positieve cellen in de mononucleaire fractie respectievelijk 1,6 en 5,0% bedraagt, het maximale gehalte aan kolonievormende eenheden in de CD34+-celsubpopulatie 80 en 25% bedraagt, de totale kloneringsefficiëntie van CD34+-cellen 88 en 58% bedraagt en het maximale gehalte aan kolonievormende cellen met een hoog proliferatiepotentieel (HPP-CFC in de CD34+-populatie) 50 en 6,5% bedraagt. Hierbij moet worden opgemerkt dat de kloneringsefficiëntie van CD34+CD38-cellen en het vermogen om te reageren op cytokinestimulatie ook hoger zijn in hematopoëtische stamcellen uit navelstrengbloed.

De combinatie van de fenotypische antigenen Thy-1, CD34 en CD45RA bevestigt het hoge proliferatieve potentieel van hematopoëtische cellen in navelstrengbloed. De expressie van deze drie antigenen op het oppervlak van navelstrengbloedcellen wijst erop dat ze tot de stamcellen behoren. Daarnaast werd vastgesteld dat navelstrengbloed cellen bevat met het CD34+-fenotype die geen markers van lineaire differentiatie vertonen. Het aantal cellulaire subpopulaties met het fenotypische profiel CD34+/Lin in navelstrengbloed bedraagt ongeveer 1% van het totale aantal CD34-positieve cellen. Hematopoëtische voorlopercellen van navelstrengbloed vormen zowel de lymfoïde cellijn als de pluripotente myeloïde reeks van lineaire celdifferentiatie, wat eveneens wijst op hun afkomst uit stamcellen.

Zoals reeds vermeld, zijn er significante verschillen tussen beenmerg en navelstrengbloed in de hoeveelheid hematopoëtische cellen die voor transplantatie worden gebruikt en die tijdens één afnameprocedure worden verkregen. Als tijdens een beenmergtransplantatie het verlies aan celmassa tijdens scheiding, cryopreservatie, ontdooiing en onderzoek acceptabel is binnen 40-50%, dan is dit celverlies voor navelstrengbloed zeer significant, aangezien bij onvoldoende gebruik van HSC de transplantatie ineffectief kan blijken te zijn. Volgens G. Kogler et al. (1998) kunnen bij celtransplantatie met een lichaamsgewicht van 10 kg alle navelstrengbloedmonsters in aanmerking komen voor transplantatie (het totale aantal verzamelde navelstrengbloedmonsters is 2098), met een lichaamsgewicht van 35 kg - 67%, en kan slechts 25% van de monsters een effectieve transplantatie opleveren bij patiënten met een lichaamsgewicht van 50-70 kg. Deze klinische situatie wijst op de noodzaak om de efficiëntie van bestaande methoden voor het verzamelen, reproduceren en bewaren van navelstrengbloedcellen te optimaliseren en te verbeteren. Daarom wordt er in de literatuur momenteel uitgebreid gesproken over de standaardisatie van methoden voor het verzamelen, testen, scheiden en cryopreservatie van navelstrengbloed om bloedbanken op te zetten, het gebruik ervan in de kliniek en het vastleggen van de voorwaarden en bepalingen voor het bewaren van hematopoëtische stamcellen uit navelstrengbloed.

[ 7 ], [ 8 ], [ 9 ]

Gebruik van hematopoëtische stamcellen uit navelstrengbloed in de geneeskunde

^{Meestal is het mogelijk om tot 10 6} hematopoëtische stamcellen uit navelstrengbloed te isoleren, zelden meer. In dit verband blijft de vraag of een dergelijke hoeveelheid hematopoëtische cellen uit navelstrengbloed voldoende is om de hematopoëse bij een volwassen ontvanger te herstellen, tot op de dag van vandaag onbeantwoord. De meningen hierover zijn verdeeld. Sommige onderzoekers zijn van mening dat een dergelijke hoeveelheid ruim voldoende is voor transplantatie bij kinderen, maar te weinig voor transplantatie bij een volwassene. Voor hen is de optimale hoeveelheid de introductie van (7-10) x 10 ⁶ CD34-positieve cellen per 1 kg lichaamsgewicht - gemiddeld 7 x 10 ⁸ per transplantatie. Uit deze berekeningen volgt dat één monster navelstrengbloed 700 keer minder hematopoëtische stamcellen bevat dan nodig is voor één transplantatie bij een volwassen patiënt. Een dergelijke kwantitatieve beoordeling wordt echter gemaakt naar analogie van het aantal getransfundeerde beenmergcellen en houdt helemaal geen rekening met de ontogenetische kenmerken van de hematopoëse.

In het bijzonder wordt het feit van een hoger proliferatief potentieel van hematopoëtische stamcellen uit navelstrengbloed in vergelijking met hematopoëtische stamcellen uit beenmerg genegeerd. De resultaten van in-vitrostudies naar het kolonievormend potentieel suggereren dat één dosis navelstrengbloed de hematopoëse van een volwassen ontvanger kan herstellen. Aan de andere kant mag niet worden vergeten dat het aantal navelstrengbloedstamcellen zelfs tijdens de embryonale ontwikkeling afneemt: het gehalte aan CD34-positieve cellen in navelstrengbloed neemt lineair 5 keer af in de periode van 20 weken (het bloed voor de studie werd afgenomen tijdens een vroegtijdige zwangerschapsafbreking) tot 40 weken zwangerschap (de periode van fysiologische weeën), wat gepaard gaat met een parallelle, permanent toenemende expressie van lineaire cytodifferentiatiemarkers.

Vanwege het ontbreken van een gestandaardiseerde aanpak voor de kwantitatieve bepaling van voorlopercellen in navelstrengbloedmonsters, blijven discussies over de optimale dosis hematopoëtische stamcellen uit navelstrengbloed voortduren. Sommige onderzoekers zijn van mening dat het aantal cellen met een kern en mononucleaire cellen, herberekend op basis van het lichaamsgewicht van de ontvanger, d.w.z. hun dosis, kan worden gebruikt als criteria voor de selectie van navelstrengbloedmonsters. Sommige auteurs zijn van mening dat de minimale kwantitatieve drempelwaarde voor CD34+-cellen, zelfs voor autotransplantatie van HSC's, 2 x 106 ^/ kg is. Tegelijkertijd zorgt een verhoging van de dosis hematopoëtische cellen tot 5 x 106 ^cellen /kg (slechts 2,5 keer) al voor een gunstiger verloop van de vroege posttransplantatieperiode, vermindert het de incidentie van infectieuze complicaties en verkort het de duur van preventieve antibiotische therapie.

Volgens E. Gluckman et al. (1998) is in de oncohematologie de voorwaarde voor succesvolle navelstrengbloedceltransplantatie de introductie van ten minste 3,7 x 10 ⁷ kernhoudende cellen per 1 kg lichaamsgewicht van de ontvanger. Wanneer de dosis hematopoëtische stamcellen wordt verlaagd tot 1 x 10 ⁷ of minder kernhoudende cellen per 1 kg lichaamsgewicht van de patiënt, neemt het risico op transplantatiefalen en recidief van bloedkanker sterk toe. Erkend moet worden dat het minimale aantal progenitorcellen dat nodig is voor snel herstel van de hematopoëse na allotransplantatie van HSC's nog steeds onbekend is. Theoretisch kan dit worden bereikt met één cel, maar in de klinische praktijk van beenmergtransplantatie wordt een snelle en stabiele engraftment gegarandeerd door transfusie van ten minste (1-3) x 10 ⁸ kernhoudende cellen per 1 kg lichaamsgewicht van de patiënt.

Een recente gedetailleerde studie om het optimale aantal HSC's in de oncohematologie te bepalen, omvatte observatie van patiënten in drie groepen, toegewezen op basis van het gehalte aan CD34-positieve cellen in het getransplanteerde materiaal. Patiënten uit de eerste groep kregen (3-5) x 10 ⁶ cellen/kg toegediend. De HSC-dosis bij patiënten uit de tweede groep was (5-10) x 10 ⁶ cellen/kg, en patiënten uit de derde groep kregen een transplantatie met meer dan 10 x 10 ⁶ CD34+ cellen/kg. De beste resultaten werden waargenomen in de groep ontvangers die een transplantatie ondergingen met een aantal CD34-positieve cellen gelijk aan (3-5) x 10 ⁶ /kg. Bij een verhoging van de dosis getransplanteerde cellen boven 5 x 10 ⁶ /kg werden geen statistisch significante voordelen aangetoond. In dit geval gaat een zeer hoog gehalte aan HSC's in het transplantaat (> 10 x 106 ^/ kg) gepaard met de reïnfusie van een aanzienlijk aantal resterende tumorcellen, wat leidt tot recidief van de ziekte. Een direct verband tussen het aantal getransplanteerde allogene progenitorcellen en de ontwikkeling van de graft-versus-hostreactie is niet vastgesteld.

De wereldwijd opgebouwde ervaring met navelstrengbloedtransplantatie bevestigt hun hoge repopulatiepotentieel. De engraftmentsnelheid van de navelstrengbloedtransplantatie correleert met het aantal ingebrachte cellen met een celkern. De beste resultaten worden waargenomen bij een transplantatie van 3 x 10⁻¹ ^/ kg, terwijl deze dosis voor beenmerg 2 x 10⁻¹/kg bedraagt ^. Volgens gegevens van de coördinatiecentra werden eind 2000 wereldwijd 1200 navelstrengbloedtransplantaties uitgevoerd, voornamelijk van verwante donoren (83%). Het is duidelijk dat navelstrengbloed als alternatief voor beenmerg moet worden beschouwd bij transplantatie bij patiënten met hemoblastose.

Tegelijkertijd wekt de neonatale aard van de navelstrengbron van hematopoëtisch weefsel optimisme vanwege de aanwezigheid van functionele kenmerken van de HSC. Tegelijkertijd kan alleen klinische ervaring antwoord geven op de vraag of één navelstrengbloedmonster voldoende is om de hematopoëse te herstellen bij een volwassen ontvanger met hematopoëtische aplasie. Transplantatie van navelstrengbloedcellen wordt gebruikt in behandelprogramma's voor vele tumor- en niet-tumorziekten: leukemie en myelodysplastische syndromen, non-Hodgkinlymfoom en neuroblastoom, aplastische anemie, congenitale Fanconi- en Diamond-Blackfan-anemie, leukocytenadhesiedeficiëntie, Barr-syndroom, de ziekte van Gunther, het Hurler-syndroom en thalassemie.

Immunologische aspecten van hematopoëtische celtransplantatie uit navelstrengbloed verdienen bijzondere aandacht en een aparte studie. Het is aangetoond dat de transplantatieresultaten bij navelstrengbloedstamcellen van donoren met incomplete HLA-compatibiliteit zeer bevredigend zijn, wat volgens de auteurs wijst op een lagere immunoreactiviteit van navelstrengbloedcellen dan van beenmerg.

Een gedetailleerde studie van de cellulaire samenstelling van navelstrengbloed onthulde de kenmerken van zowel het fenotypische spectrum van effectorcellen van het immuunsysteem als hun functionele activiteit, wat het mogelijk maakte om navelstrengbloed te beschouwen als een bron van HSC's met een relatief laag risico op het ontwikkelen van een 'graft-versus-host'-reactie. Onder de tekenen van functionele onrijpheid van immunocompetente cellen in navelstrengbloed valt de onbalans in de productie van cytokinen en een afname van de gevoeligheid voor cytokineregulatie van de immuunrespons op te merken. De resulterende remming van de activiteit van cytotoxische lymfocyten wordt beschouwd als een factor die bijdraagt aan de vorming van immunologische tolerantie voor het getransplanteerde hematopoëtische weefsel. In de populatie navelstrenglymfocyten, in tegenstelling tot het perifere bloed en beenmerg van volwassen donoren, overheersen inactieve, onrijpe lymfocyten en suppressorcellen. Dit wijst op een verminderde bereidheid van navelstrenglymfocyten voor een immuunrespons. Een belangrijk kenmerk van de monocytaire populatie navelstrengbloedcellen is het lage gehalte aan functioneel volwaardige en actieve antigeenpresenterende cellen.

Enerzijds vergroot de lage maturiteit van de effectorcellen van het immuunsysteem in navelstrengbloed de indicaties voor klinisch gebruik, aangezien deze eigenschappen zorgen voor een afname van de intensiteit van het immuunconflict tussen de cellen van de donor en de ontvanger. Anderzijds is bekend dat er een correlatie bestaat tussen de mate van ontwikkeling van de "graft-versus-host"-reactie en het antitumoreffect van transplantatie, oftewel de ontwikkeling van het "graft-versus-leukemie"-effect. In dit verband is een onderzoek uitgevoerd naar de antitumorcytotoxiciteit van navelstrengbloedcellen. De verkregen resultaten wijzen erop dat, ondanks de sterk verzwakte reactie van immunocompetente navelstrengbloedcellen op antigeenstimulatie, de lymfocyten die primair worden geactiveerd, natuurlijke killercellen en killerachtige cellen zijn die een actieve rol spelen in de mechanismen die antitumorcytotoxiciteit implementeren. Daarnaast werden subpopulaties van lymfocyten met de fenotypes CD16+CD56+ en CD16"TCRa/p+ in navelstrengbloed aangetroffen. Aangenomen wordt dat deze cellen in hun geactiveerde vorm de "graft-versus-leukemie"-reactie uitvoeren.

Aan het Oncologisch Instituut van de Academie voor Medische Wetenschappen van Oekraïne werden cryopreserveerde hematopoëtische cellen uit navelstrengbloed toegediend aan kankerpatiënten met aanhoudende hematopoëtische hypoplasie als gevolg van chemotherapie en radiotherapie. Bij deze patiënten herstelde transplantatie van hematopoëtische stamcellen uit navelstrengbloed de onderdrukte hematopoëse zeer effectief, zoals bleek uit een aanhoudende toename van het gehalte aan volwassen gevormde elementen in het perifere bloed, evenals een toename van de indicatoren die de toestand van cellulaire en humorale immuniteit kenmerken. De stabiliteit van het repopulatie-effect na transplantatie van hematopoëtische cellen uit navelstrengbloed maakt voortzetting van bestraling en chemotherapie mogelijk zonder onderbreking van de behandeling. Er is informatie over een hogere efficiëntie van allotransplantatie van stamcellen uit navelstrengbloed bij oncohematologische patiënten: het jaarlijkse risico op recidief van een tumor bij gebruik ervan was 25% versus 40% bij patiënten met getransplanteerd allogeen beenmerg.

Het werkingsmechanisme van cryopreserveerde stamcellen uit navelstrengbloed moet worden beschouwd als het resultaat van humorale stimulatie van de hematopoëse van de ontvanger, veroorzaakt door het unieke vermogen van neonatale cellen tot autocriene productie van hematopoëtische groeifactoren, en als een gevolg van tijdelijke inplanting van donorcellen (zoals blijkt uit een betrouwbare toename van het gehalte aan foetaal hemoglobine in het perifere bloed van ontvangers op de 7e tot 15e dag na transfusie ten opzichte van de initiële gegevens). De afwezigheid van posttransfusiereacties bij ontvangers van navelstrengbloed is het gevolg van de relatieve tolerantie van de immunocompetente cellen, en vormt tevens een betrouwbaarheidscriterium voor de biologische geschiktheid van het cryopreserveerde materiaal.

Killerprogenitorcellen van T-lymfocyten uit navelstrengbloed kunnen worden geactiveerd onder invloed van exogene cytokinestimulatie. Dit wordt gebruikt om nieuwe ex vivo en in vivo methoden te ontwikkelen voor het induceren van antitumorcytotoxiciteit van transplantaatlymfoïde elementen voor daaropvolgende immunotherapie. Bovendien maakt de "onrijpheid" van het genoom van immunocompetente cellen uit navelstrengbloed het mogelijk om ze te gebruiken om de antitumoractiviteit te versterken met behulp van moleculaire modelleringsmethoden.

Tegenwoordig vindt navelstrengbloed brede toepassing, voornamelijk in de pediatrische hematologie. Bij kinderen met acute leukemie vermindert allotransplantatie van hematopoëtische stamcellen uit navelstrengbloed, vergeleken met allotransplantatie van beenmerg, de incidentie van graft-versus-hostziekte aanzienlijk. Dit gaat echter gepaard met een langere periode van neutro- en trombocytopenie en helaas ook een hogere mortaliteit 100 dagen na transplantatie. Een langere herstelperiode van de granulocyten- en bloedplaatjeswaarden in het perifere bloed kan te wijten zijn aan onvoldoende differentiatie van individuele subpopulaties van CD34-positieve navelstrengbloedcellen, zoals blijkt uit de lage absorptie van radioactief rhodamine en de lage expressie van CD38-antigenen op hun oppervlak.

Tegelijkertijd liet transplantatie van hematopoëtische stamcellen uit navelstrengbloed naar volwassen patiënten, uitgevoerd vanwege de afwezigheid van zowel een compatibele, niet-verwante beenmergdonor als de mogelijkheid om autologe HSC's te mobiliseren, een hoge recidiefvrije overleving na één jaar zien in de groep patiënten jonger dan 30 jaar (73%). Uitbreiding van de leeftijdscategorie van ontvangers (18-46 jaar) leidde tot een afname van de overleving tot 53%.

Kwantitatieve analyse van cellen met het CD34+-fenotype in beenmerg en navelstrengbloed toonde hun hogere (3,5 keer) gehalte in beenmerg aan, maar een significante overheersing van cellen met het fenotypische profiel CD34+HLA-DR werd opgemerkt in navelstrengbloed. Het is bekend dat bloedcellen met de immunologische markers CD34+HLA-DR actiever prolifereren dan cellen met het immunofenotype CD34+HLA-DR+, wat werd bevestigd in experimentele studies naar de groei van langdurige hematopoëtische celculturen in vitro. Primitieve celprecursoren met het CD34+CD38-fenotype zijn aanwezig in zowel navelstrengbloed als beenmerg, maar navelstrengbloedcellen met de markerset CD34+CD38 hebben een hogere klonogene activiteit dan hematopoëtische cellen met hetzelfde fenotype, geïsoleerd uit het beenmerg van volwassen donoren. Daarnaast prolifereren navelstrengbloedcellen met het CD34+CD38-immunofenotype sneller als reactie op cytokinestimulatie (IL-3, IL-6, G-CSF) en produceren ze 7 keer meer kolonies in langdurige kweken dan beenmergcellen.

Navelstrengbloedstamcelbanken

Voor de juiste ontwikkeling van een nieuw gebied binnen de praktische geneeskunde - transplantatie van navelstrengbloedstamcellen, en voor de implementatie van hematopoëtische stamceltransplantaties uit beenmerg, is een uitgebreid netwerk van bloedbanken noodzakelijk, dat al in de VS en Europa is opgericht. Binnenlandse netwerken van navelstrengbloedbanken worden verenigd door de Netcord Bank Association. De opportuniteit van de oprichting van een internationale vereniging van navelstrengbloedbanken wordt bepaald door het feit dat een groot aantal getypeerde navelstrengbloedmonsters nodig is voor het uitvoeren van niet-verwante transplantaties, wat het selecteren van een HLA-identieke donor mogelijk maakt. Alleen de oprichting van een systeem van banken met opslag van bloedmonsters van verschillende HLA-typen kan het probleem van het vinden van de benodigde donor daadwerkelijk oplossen. De organisatie van een dergelijk navelstrengbloedbanksysteem vereist de voorafgaande ontwikkeling van ethische en juridische normen, waarover momenteel op internationaal niveau wordt onderhandeld.

Om navelstrengbloedbanken in Oekraïne op te richten, moet een hele reeks regels en documenten worden opgesteld.

Allereerst gaat het om de standaardisatie van methoden voor het verzamelen, fractioneren en invriezen van navelstrengbloed. Het is noodzakelijk om de regels voor het verzamelen van navelstrengbloed in kraamklinieken te reguleren in overeenstemming met de eisen van de medische ethiek, om de minimale hoeveelheid navelstrengbloed te bepalen die een succesvolle transplantatie garandeert. Het is noodzakelijk om verschillende criteria voor de beoordeling van de kwaliteit en kwantiteit van hematopoëtische stamcellen te vergelijken en te standaardiseren, evenals HLA-typeringsmethoden en diagnostische methoden voor genetische en infectieziekten die kunnen worden overgedragen tijdens de infusie van navelstrengbloedcellen, om gemeenschappelijke criteria vast te stellen voor de selectie van gezonde donoren. Het is ook de moeite waard om de kwestie van het creëren van aparte opslagfaciliteiten voor serum, cellen en DNA verkregen uit navelstrengbloed te bespreken.

Het is absoluut noodzakelijk om een computernetwerk van navelstrengbloedgegevens te creëren dat gekoppeld kan worden aan registers van beenmergdonoren. Voor de verdere ontwikkeling van celtransplantatie is het noodzakelijk om speciale protocollen te ontwikkelen voor het vergelijken van de resultaten van navelstrengbloed- en beenmergtransplantaties van HLA-identieke verwanten en niet-verwante donoren. Standaardisatie van documentatie, inclusief geïnformeerde toestemming van ouders, en het informeren van de moeder of verwanten over genetische en/of infectieziekten die bij het kind zijn vastgesteld, kan helpen bij het oplossen van de ethische en juridische problemen rond het klinisch gebruik van navelstrengbloedcellen.

De bepalende voorwaarde voor de ontwikkeling van celtransplantatie in Oekraïne zal de adoptie van het Nationale Stamceldonatieprogramma zijn en de ontwikkeling van internationale samenwerking met andere landen via de World Marrow Donor Association (WMDA), het Amerikaanse National Marrow Donor Program (NMDP) en andere registers.

Als we de nog korte geschiedenis van de ontwikkeling van hematopoëtische stamceltransplantatie uit navelstrengbloed samenvatten, merken we op dat de eerste aannames over de mogelijkheid van klinisch gebruik van navelstrengbloed, die begin jaren 70 werden geuit, in de jaren 80 werden bevestigd door de resultaten van experimentele studies met dieren. In 1988 werd 's werelds eerste transplantatie van hematopoëtische cellen uit navelstrengbloed bij een mens uitgevoerd, waarna een wereldwijd netwerk van navelstrengbloedbanken ontstond. In 10 jaar tijd naderde het aantal patiënten met getransplanteerde hematopoëtische cellen uit navelstrengbloed de 800. Onder hen bevonden zich patiënten met diverse tumorziekten (leukemie, lymfoom, solide tumoren) en niet-tumorziekten (aangeboren immuundeficiënties, bloedarmoede, aandoeningen geassocieerd met stofwisselingsstoornissen).

Het gehalte aan vroege en toegewijde celprecursoren in navelstrengbloed is hoger dan in het perifere bloed van een volwassene. Wat betreft het aantal granulocyt-macrofaag kolonievormende eenheden en hun proliferatieve potentieel, overtreft navelstrengbloed het perifere bloed van volwassenen aanzienlijk, zelfs na de introductie van groeifactoren. Bij langdurige celculturen in vitro is een hogere proliferatieve activiteit en levensvatbaarheid van navelstrengbloedcellen waargenomen dan van beenmergcellen. Kritische momenten bij stamceltransplantatie met navelstrengbloed zijn het aantal en het hematopoëtische potentieel van cellen met een celkern, de aanwezigheid van een cytomegalovirusinfectie, de HLA-compatibiliteit van donor en ontvanger, het lichaamsgewicht en de leeftijd van de patiënt.

Transplantatie van navelstrengbloedstamcellen zou echter moeten worden overwogen als alternatief voor beenmergtransplantatie voor de behandeling van ernstige bloedziekten, met name bij kinderen. De klinische problemen met navelstrengbloedtransplantatie worden geleidelijk opgelost: er bestaan al vrij effectieve methoden voor het verzamelen, scheiden en cryopreserveren van navelstrengbloedcellen, er worden omstandigheden gecreëerd voor de oprichting van navelstrengbloedbanken en er worden methoden verbeterd voor het testen van cellen met een celkern. Een 3% gelatine-oplossing en een 6% hydroxyethylzetmeeloplossing zouden als optimaal moeten worden beschouwd voor de scheiding tijdens grootschalige winning van hematopoëtische stamcellen uit navelstrengbloed bij het opzetten van banken.

P. Perekhrestenko en co-auteurs (2001) merken terecht op dat transplantatie van navelstrengbloedstamcellen een terechte plaats verdient in het complex van therapeutische maatregelen om hematopoëtische depressies van verschillende oorsprong te overwinnen, aangezien navelstrengbloedstamcellen een aantal belangrijke voordelen bieden, waarvan de belangrijkste de relatieve eenvoud van hun verkrijging, de afwezigheid van risico's voor de donor, de geringe besmetting van neonatale cellen met virussen en de relatief lage kosten van de transplantatie zijn. Sommige auteurs wijzen erop dat transplantatie van navelstrengbloed minder vaak gepaard gaat met complicaties die verband houden met de graft-versus-hostreactie dan transplantatie van beenmergcellen, wat volgens hen te wijten is aan de zwakke expressie van HLA-DR-antigenen op navelstrengbloedcellen en hun onrijpheid. De belangrijkste populatie van cellen met een celkern in navelstrengbloed zijn echter T-lymfocyten (CD3-positieve cellen). Het gehalte hiervan bedraagt ongeveer 50%, wat 20% minder is dan in het perifere bloed van een volwassene. De fenotypische verschillen in T-celsubpopulaties uit deze bronnen zijn echter onbeduidend.

Van de factoren die direct van invloed zijn op de overlevingskans bij transplantatie van stamcellen uit navelstrengbloed, zijn de leeftijd van de patiënten (de beste resultaten worden waargenomen bij ontvangers van één tot vijf jaar), vroege diagnose van de ziekte en de vorm van leukemie (de effectiviteit is significant hoger bij acute leukemie) van groot belang. Van groot belang zijn de dosis kernhoudende navelstrengbloedcellen en hun HLA-compatibiliteit met de ontvanger. Het is geen toeval dat de analyse van de klinische effectiviteit van transplantatie van HSC uit navelstrengbloed in de oncohematologie de beste behandelresultaten laat zien bij gebruik van verwante transplantaties: de recidiefvrije overleving na één jaar bereikt in dit geval 63%, terwijl deze bij niet-verwante transplantatie slechts 29% bedraagt.

De aanwezigheid van een groot aantal stamcellen in navelstrengbloed en de hoge repopulatiecapaciteit van neonatale hematopoëtische stamcellen maken het dus mogelijk om ze te gebruiken voor allogene transplantatie bij oncohematologische patiënten. Er moet echter worden opgemerkt dat de recapitulatie van hematopoëse na transplantatie van hematopoëtische cellen uit navelstrengbloed "uitgerekt in de tijd" is: herstel van het neutrofielengehalte in het perifere bloed wordt meestal waargenomen tegen het einde van de 6e week, en trombocytopenie verdwijnt meestal na 6 maanden. Bovendien sluit de onrijpheid van hematopoëtische cellen uit navelstrengbloed immunologische conflicten niet uit: ernstige acute en chronische graft-versus-hostziekte wordt waargenomen bij respectievelijk 23 en 25% van de ontvangers. Recidieven van acute leukemie tegen het einde van het eerste jaar na navelstrengbloedtransplantatie worden in 26% van de gevallen waargenomen.

[ 10 ], [ 11 ]