Immunologisch onderzoek in de urologie

Het voorschrijven van een immunogram aan een urologische patiënt betekent dat de behandelend arts de aanwezigheid van aandoeningen in het immuunsysteem vermoedt. Terugkerende bacteriële, virale en schimmelinfecties, allergische manifestaties en systemische ziekten kunnen tekenen zijn van deze aandoeningen, die worden gekenmerkt door een aantal syndromen (infectieuze, oncologische, allergische, auto-immuun, lymfoproliferatieve). Eén patiënt kan meerdere syndromen hebben. Zo kunnen chronische infectieziekten (infectiesyndroom) immunodeficiëntie veroorzaken, en immunodeficiëntie kan zich manifesteren als een predispositie voor infectieuze en oncologische ziekten (oncologisch syndroom). Predispositie voor infecties kan optreden tegen de achtergrond van secundaire immunodeficiëntie, die is ontstaan als gevolg van een lymfoproliferatieve ziekte, zoals leukemie. Er zijn drie hoofdgroepen van pathologische veranderingen in het immuunsysteem:

• kwantitatieve of functionele deficiëntie van een of andere schakel van het immuunsysteem, die leidt tot de ontwikkeling van een immuundeficiëntietoestand;
• een stoornis in de herkenning van antigenen door het immuunsysteem, wat leidt tot de ontwikkeling van auto-immuunprocessen;
• een hyperreactieve of "verdraaide" immuunreactie, die zich manifesteert in de ontwikkeling van allergische ziekten.

Er bestaan screenings- (niveau 1-testen) en verhelderende (niveau 2-testen) methoden voor immunodiagnostiek. De eerste dienen om verstoringen in het immuunsysteem vast te stellen, de tweede om de mechanismen vast te stellen die betrokken zijn bij de implementatie ervan met het oog op verdere immunocorrectie.

B-cel immuniteit

Screeningsmethoden

• Bepaling van het relatieve en absolute aantal B-lymfocyten met behulp van immunofluorescentie of flowcytofuorimetrie met monoklonale antilichamen tegen B-celantigenen (CD19, CD20, waarbij CD staat voor clusters van differentiatie). Het normale aantal B-lymfocyten bij volwassenen bedraagt 8-19% van het totale aantal leukocyten, oftewel 190-380 cellen/μl. Een toename van het aantal B-lymfocyten treedt op bij acute en chronische bacteriële en schimmelinfecties, chronische leverziekten, systemische bindweefselziekten, chronische lymfatische leukemie en myeloom.
• Bepaling van de concentratie van niet-specifieke immunoglobulinen (F, M, G, E) door middel van eenvoudige radiale immunodiffusie, nefelometrie of turbometrie, radioimmunoassay of enzymimmunoassay (ELISA). Normen voor volwassenen: immunoglobuline (Ig)A 0,9-4,5 g/l. IgM 0,3-3,7 g/l. IgG 8,0-17 g/l. Een verhoging van de concentratie van immunoglobulinen treedt op bij dezelfde pathologische omstandigheden waarin een verhoging van het gehalte aan B-lymfocyten optreedt. Een verlaging van de concentratie van immunoglobulinen treedt op bij congenitale hypogammaglobulinemie, neoplasmata van het immuunsysteem, verwijdering van de milt, eiwitverlies, nier- of darmziekten, behandeling met cytostatica en immunosuppressiva.

Verduidelijkende methoden

• Bepaling van circulerende immuuncomplexen in het bloed door selectieve precipitatie in polyethyleenglycol, gevolgd door spectrofotometrische dichtheidsmeting (normaal 80-20 U). Een toename van circulerende immuuncomplexen is kenmerkend voor acute bacteriële, schimmel- en virusinfecties, auto-immuunziekten, immuuncomplexziekten, serumziekte en allergische reacties van type 3;
• Bepaling van specifieke immunoglobulinen in het bloed in relatie tot bacteriële en virale antigenen, desoxyribonucleïnezuur (DNA) bij auto-immuunziekten, detectie van antisperma (auto-immuun onvruchtbaarheid) en antirenale antilichamen (pyelonefritis en glomerulonefritis) door middel van de radiale immunodiffusie- of ELISA-methode.
• Bepaling van antisperma-antistoffen in sperma [MAR-test (gemengde antiglobulinereactie)], normaal - negatief resultaat.
• Bepaling van de concentratie immunoglobulinen in de urine ten behoeve van de differentiële diagnose tussen pyelonefritis en glomerulonefritis (selectiviteit van proteïnurie).
• Bepaling van het IgE-gehalte in prostaatsap ter diagnose van allergische prostatitis met behulp van de radiale immunodiffusiemethode of ELISA.
• Onderzoek naar de respons in de reactie van B-lymfocyt blasttransformatie op B-celmitogeen (pokeweed-mitogeen voor stimulatie van de reactie van B-lymfocyt blasttransformatie in aanwezigheid van T-lymfocyten), waarvan de normatieve waarde 95-100% is.

T-celverbinding van immuniteit

Screeningsmethoden

• Bepaling van het relatieve en absolute aantal volwassen CD3 T-lymfocyten door middel van immunofluorescentie of flowcytofuorimetrie met behulp van monoklonale anti-CD3-antilichamen. De norm voor volwassenen is 58-76% of 1100-1700 cellen/μl. Een afname van het aantal T-lymfocyten is een indicator van insufficiëntie van de cellulaire schakel van de immuniteit. Dit is typerend voor sommige secundaire en primaire immunodeficiënties (chronische bacteriële en virale infecties: tuberculose, verworven immunodeficiëntiesyndroom, maligne tumoren, chronisch nierfalen, letsel, stress, veroudering, ondervoeding, behandeling met cytostatica, blootstelling aan ioniserende straling). Een toename van het aantal T-lymfocyten treedt op tegen de achtergrond van immuunhyperactiviteit of bij lymfoproliferatieve aandoeningen. Bij ontstekingen neemt het aantal T-lymfocyten eerst toe en neemt vervolgens af. Het uitblijven van een afname van het aantal T-lymfocyten duidt op een chronisch ontstekingsproces.
• Evaluatie van lymfocytensubpopulaties.
  • Bepaling van het aantal T-helpers (anti-CD4-antilichamen). Normaal gesproken 36-55% of 400-1100 cellen/mcl. Een toename van het aantal van deze cellen treedt op bij auto-immuunziekten, de ziekte van Waldenström en activering van de antitransplantatie-immuniteit; een afname van het aantal T-helpers treedt op bij chronische bacteriële, virale en protozoaire infecties, tuberculose, het verworven immunodeficiëntiesyndroom, kwaadaardige tumoren, brandwonden, verwondingen, ondervoeding, veroudering, behandeling met cytostatica en blootstelling aan ioniserende straling.
  • Bepaling van het aantal T-suppressoren (anti-CD4-antilichamen). Normaal gesproken 17-37% of 300-700 cellen/μl. Een toename van het aantal T-suppressoren treedt op onder dezelfde omstandigheden waarbij het aantal T-helpers afneemt, en een afname ervan vindt plaats onder dezelfde omstandigheden waarbij het gehalte T-helpers toeneemt.
  • Immunoregulerende index CD4/CD8, normaal 1,5-2,5. Hyperactiviteit met waarden boven 2,5 (allergische en auto-immuunziekten); hypoactiviteit - lager dan 1,0 (predispositie voor chronische infecties). Aan het begin van het ontstekingsproces neemt de immunoregulerende index toe en na een daling normaliseert deze.

Verduidelijkende methoden

• Bepaling van het aantal natural killers (NK-cellen) - anti-CD16 en anti-CD56 antilichamen. De norm voor CD16-lymfocyten is 6-26%, CD56 - 9-19%. Een toename van het aantal NK-cellen treedt op bij transplantaatafstoting, een afname bij virale infecties, kanker, primaire en secundaire immuundeficiënties, brandwonden, verwondingen en stress, behandeling met cytostatica en blootstelling aan ioniserende straling.
• Bepaling van het aantal T-lymfocyten met een receptor voor interleukine-2 (activatiemarker) - anti-CD25-antilichamen. De norm is 10-15%. Een toename van hun aantal wordt waargenomen bij allergische aandoeningen, transplantaatafstoting, reactie op thymusafhankelijke antigenen in de acute periode van primaire infectie, en een afname bij dezelfde aandoeningen waarbij het aantal NK-cellen afneemt.
• Studie naar de expressie van de activatiemarker - klasse II histocompatibiliteitsmolecuul HLA-DR. Verhoogde expressie treedt op bij ontstekingsprocessen, bij patiënten met hepatitis C, coeliakie, syfilis en acute luchtwegaandoeningen.
• Evaluatie van apoptose van lymfocyten. Een globaal idee van de gereedheid van lymfocyten voor apoptose kan worden bepaald door de expressie van de Fas-receptor (CD95) op hun oppervlak en het bd-2 proto-oncogen in de mitochondriën. Apoptose van lymfocyten wordt beoordeeld door ze te behandelen met twee fluorescerende kleurstoffen: propidiumjodide, dat bindt aan DNA-fragmenten, en annexine Y, dat bindt aan fosfatidylserine, dat op het celmembraan verschijnt bij aanvang van apoptose. De resultaten worden geëvalueerd met een flowcytofluorometer. De resultaten worden berekend op basis van de verhouding van cellen gekleurd met verschillende kleurstoffen. Ongekleurde cellen zijn levensvatbaar; cellen die alleen gebonden zijn aan annexine Y zijn vroege manifestaties van apoptose; met propidiumjodide en annexine Y zijn dit late manifestaties van apoptose; kleuring met alleen propidiumjodide duidt op necrose.
• Evaluatie van T-lymfocytenproliferatie in vitro.
  • Veranderingen in celblastogenese - blasttransformatiereactie van lymfocyten. Leukocyten worden geïncubeerd met een mitogeen van plantaardige oorsprong (lectinen). Fytohemagglutinine wordt meestal gedurende 72 uur gebruikt, waarna een uitstrijkje wordt genomen, gekleurd en het aantal blasten wordt geteld! De stimulatie-index is de verhouding tussen het percentage getransformeerde cellen in het experiment (kweek met fytohemagglutinine) en het percentage getransformeerde cellen in de controle (kweek zonder fytohemagglutinine). De blasttransformatiereactie van lymfocyten kan worden beoordeeld door een radioactief label (ZN-thymndinum) aan de gekweekte cellen toe te voegen, aangezien de DNA-synthese toeneemt tijdens de celdeling. Verstoringen in de proliferatieve respons treden op bij zowel primaire als secundaire immunodeficiënties die verband houden met infecties, kanker, nierfalen en chirurgische ingrepen.
  • In deze studies worden de expressie van activeringsmarkers (CD25, transferrinereceptor - CD71) en het molecuul van het belangrijkste histocompatibiliteitscomplex klasse II HLA-DR, die vrijwel afwezig zijn op rustende T-lymfocyten, gemeten. T-lymfocyten worden gestimuleerd met fytohemagglutinine; na 3 dagen wordt de expressie van activeringsmarkers geanalyseerd met behulp van de methode van directe of indirecte immunofluorescentiereactie, flowcytofluorometrie, met behulp van monoklonale antilichamen tegen de geïsoleerde receptoren.
  • Meting van de hoeveelheid mediatoren die door geactiveerde T-lymfocyten worden gesynthetiseerd [interleukine (IL) 2, IL-4, IL-5, IL-6, γ-interferon, enz.] met behulp van radioimmunoassay of ELISA. Van bijzonder belang is de bepaling van de concentratie van γ-interferon en IL-4 als markers voor Th1 en Th2 in het supernatant van geactiveerde culturen en in de cel. Indien mogelijk is het nuttig om de genexpressie voor het corresponderende cytokine te bepalen aan de hand van het matrixribonucleïnezuurgehalte in de producerende cel en de expressie-intensiteit van receptoren voor de corresponderende cytokines.
    
• Reactie op remming van lymfocytmigratie. Gesensibiliseerde T-lymfocyten scheiden in reactie met antigeen lymfokinen uit, waaronder factoren die lymfocytmigratie remmen. Het remmingsfenomeen wordt waargenomen wanneer mitogenen in de celkweek worden geïntroduceerd. Evaluatie van de mate van remming stelt ons in staat om het vermogen van lymfocyten om cytokinen uit te scheiden te beoordelen. Normaal gesproken bedraagt de migratiefrequentie, afhankelijk van het specifieke mitogeen, 20-80%.
• Beoordeling van de cytotoxiciteit van NK-cellen. Het vermogen van natural killer-cellen om doelcellen van de K-562 erythromyeloïde lijn te doden, wordt bepaald. Indien antilichaamafhankelijke cytotoxiciteit wordt beoordeeld, worden doelcellen gebruikt die gecoat zijn met IgG-antilichamen. Doelcellen worden gelabeld met 3H-uridine en geïncubeerd met effectorcellen. De dood van doelcellen wordt beoordeeld door de afgifte van het radioactieve label in de oplossing. Een afname van de cytotoxiciteit treedt op bij maligne neoplasmata. In sommige gevallen, wanneer het nodig is om de effectiviteit van behandeling met interleukinen te voorspellen, wordt de cytotoxiciteit van NK-cellen beoordeeld tijdens incubatie met bepaalde cytokinen.

Onderzoek naar de functie van fagocyten

Screeningsmethoden

Onderzoek naar de intensiteit van de absorptie van microbiële cellen door fagocyten (fagocytose van latexdeeltjes, testkweek van stafylokokken, E. coli of micro-organismen geïsoleerd van de patiënt). Door middel van centrifugatie van gehepariniseerd bloed wordt een suspensie van leukocyten geïsoleerd, waaraan serum van de IV-bloedgroep wordt toegevoegd voor opsonisatie (opsoninen zijn eiwitten die fagocytose bevorderen). De microbiële suspensie wordt verdund, gemengd met leukocyten en 120 minuten geïncubeerd. 30, 90, 120 minuten na aanvang van de incubatie worden monsters genomen voor analyse. Van de verzamelde leukocytensuspensie worden uitstrijkjes gemaakt. De volgende fagocytose-indicatoren worden bepaald:

• fagocytische index - het percentage cellen dat binnen 30 minuten en 120 minuten incubatie in fagocytose ging; de standaardwaarde van de fagocytische index (30) is 94%, de fagocytische index (120) is 92%;
• fagocytisch aantal - het gemiddelde aantal bacteriën dat zich intracellulair bevindt; de standaardwaarde van het fagocytisch aantal (30) is 11%, het fagocytisch aantal (120) is 9,8%;
• fagocytische aantalcoëfficiënt - de verhouding van het fagocytisch aantal (30) tot het fagocytisch aantal (120); normaal gesproken 1,16;
• Neutrofiele bactericide index - de verhouding tussen het aantal gedode microben in fagocyten en het totale aantal geabsorbeerde microben; normaal gesproken 66%.

Verduidelijkende methoden

• Studie van het bactericide vermogen van fagocyten in de test met nitroblauwtetrazolium (NBT) - NBT-test. Gele nitroblauwtetrazoliumkleurstof wordt toegevoegd aan leukocyten. Wanneer een neutrofiel de kleurstof absorbeert, vindt een reductieproces plaats onder invloed van vrije zuurstofradicalen, wat resulteert in blauwe kleuring. De reactie wordt uitgevoerd in een 96-wells plaat met platte bodem. Hanks' oplossing (spontane NBT) wordt toegevoegd aan de eerste drie wells met een mengsel van NBT en leukocyten, en latexdeeltjes worden toegevoegd aan de tweede; het mengsel wordt 25 min. bij 37 °C geïncubeerd. De resultaten worden afgelezen bij 540 nm op een lezer en uitgedrukt in willekeurige eenheden. De stimulatiecoëfficiënt (K _st ) wordt berekend, gelijk aan de verhouding van de optische dichtheid in de gestimuleerde wells tot de gemiddelde optische dichtheid in de wells zonder stimulatie. Bij gezonde mensen is NBT _spont = 90 ± 45 CU, NBT _stim = 140 ± 60 CU. K _st = 1,78 ± 0,36.
• Onderzoek naar adhesiemoleculen. Flowcytofluorometrie wordt gebruikt om de expressie van de oppervlakteantigenen CD11a/CD18, CD11b/CD18 en CD11c/CD18 te bepalen. Immunodeficiënties met verminderde adhesie manifesteren zich door terugkerende infecties, trage wondgenezing en de afwezigheid van pus in de infectiehaarden.

Studie van het complementsysteem

Screeningsmethoden

Bepaling van de hemolytische activiteit van complement is een studie van de klassieke route van complementactivatie. Verschillende verdunningen van serum van een zieke en een gezonde persoon worden toegevoegd aan ramerytrocyten, bedekt met antilichamen. De eenheid van hemolytische activiteit is de reciproke waarde van de serumverdunning waarbij 50% van de erytrocyten wordt vernietigd. De mate van hemolyse wordt fotometrisch bepaald aan de hand van de afgifte van hemoglobine in de oplossing. Een afname van de hemolytische activiteit van complement wordt waargenomen bij systemische lupus erythematodes met nierschade, acute glomerulonefritis, gecombineerde immunodeficiënties, myasthenie, virale hepatitis, lymfomen, een toename van obstructieve geelzucht, Hashimoto's thyreoïditis, reuma, reumatoïde artritis, nodulaire periarteriitis, dermatomyositis, myocardinfarct, colitis ulcerosa, syndroom van Reiter en jicht.

Verduidelijkende methoden

• Bepaling van complementcomponenten. Kwantitatieve bepaling wordt uitgevoerd door middel van radiale immunodiffusie en nefelometrie.
  Het onderzoek is niet informatief tenzij de antigene eigenschappen van complementcomponenten veranderen.
• Het is vastgesteld dat de Clq-component van complement fagocytose bevordert en cellulaire cytotoxiciteit medieert. Een afname hiervan treedt op bij immuuncomplexziekten, systemische lupus erythematodes, purulente infecties en tumoren.
• De C3-component is betrokken bij de activering van de klassieke en alternatieve complementroutes. Een afname van de concentratie ervan wordt geassocieerd met chronische bacteriële en schimmelinfecties, de aanwezigheid van circulerende of weefsel-immuuncomplexen.
• De C4-component is betrokken bij de activering van de klassieke complementroute. Een afname van de concentratie ervan gaat gepaard met een langdurige activering van het complementsysteem door immuuncomplexen en een afname van de concentratie van de C1-remmer, die de activering van de klassieke complementroute reguleert. C4-deficiëntie treedt op bij systemische lupus erythematodes, een toename van C4 treedt op bij nierziekten, transplantaatafstoting, acute ontstekingen en gastro-intestinale aandoeningen.
• C5a is een klein fragment van het C5-molecuul, dat zich ervan afsplitst als gevolg van activering van het complementsysteem. De concentratie ervan neemt toe bij ontstekingen, sepsis, atopische en allergische aandoeningen.
• Cl-remmer is een multifunctionele factor. Het reguleert de activering van de complementcomponent C1 en remt de activiteit van kallikreïne, plasmine en geactiveerde Hageman-factor, Cls en O-proteasen. Een tekort aan C1-remmer leidt tot angio-oedeem.
• Functionele studies van complement. Het testserum wordt toegevoegd aan een standaardserum zonder complementcomponent en de hemolytische activiteit van het complement wordt bepaald. Als de hemolytische activiteit niet wordt hersteld, wordt de activiteit van deze complementcomponent in het testserum als verminderd beschouwd.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ]